姜 菲 賴 琦* 高彥華** 彭忠利 董利鋒 張佳雯 李 瀟 廖宇鵬

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，動物科學國家民委重點實驗室，成都610041；2.中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京100081；3.四川愛客信生物科技股份有限公司，廣漢628300)

異位酸又稱為支鏈揮發(fā)性脂肪酸(branched chain volatile fatty acids，BCVFA)，是含4～5個碳原子的短鏈揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)，包括戊酸、異丁酸和2-甲基丁酸等，是反芻動物常用的飼料添加劑[1-2]。動物試驗和體外發(fā)酵試驗均表明，反芻動物飼糧中添加2-甲基丁酸、異丁酸或異戊酸能顯著提高纖維分解菌數(shù)量和纖維素酶活性[3-5]。此外，異位酸還能提高纖維的降解率。Roman-Garcia等[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加各2 mmol/L的異丁酸、異戊酸和2-甲基丁酸混合物能夠提高底物中性洗滌纖維(NDF)的體外降解率；Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2-甲基丁酸能顯著增加肉牛玉米青貯NDF的瘤胃降解率，提高粗飼料的利用率。在改善纖維消化率的同時，異位酸通過給瘤胃微生物提供碳骨架，使瘤胃微生物能夠轉化非蛋白氮(NPN)生成更多的微生物蛋白(MCP)[8]。因此，反芻動物飼糧中添加適宜水平的異位酸有利于改善瘤胃發(fā)酵性能，提高粗纖維消化率，但其作用效果與異位酸種類以及飼糧類型有關。

異位酸主要來源于蛋白質降解后的氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)經(jīng)氧化脫氨基和脫羧基后的產物[9]，反芻動物在常規(guī)飼養(yǎng)條件下產生的異位酸，與乙酸、丙酸、丁酸相比是很微量的，因此成為限制瘤胃微生物發(fā)酵和養(yǎng)分代謝的重要因子[10]。川西高原牦牛常年以牧草作為其主要的粗飼料來源，且多數(shù)牧草中蛋白質含量較低，此飼養(yǎng)條件下可能會產生瘤胃異位酸生成不足的問題，進而造成瘤胃微生物生長代謝受限，影響牦牛的生長性能。目前，關于異位酸的種類及添加水平對反芻動物瘤胃體外發(fā)酵的影響主要集中在奶牛、犢牛、肉牛和羊的研究上，而關于高原牦牛的研究較少。箭筈豌豆(Viciasativa)和燕麥(Avenasativa)是川西高原牦牛采食的常見牧草，但是不同地域和不同季節(jié)的箭筈豌豆和燕麥養(yǎng)分存在差異。為了更好地指導四川省甘孜縣牦牛對牧草的利用，本研究首先采用康乃爾凈碳水化合物-蛋白質體系(CNCPS)評價箭筈豌豆和燕麥的營養(yǎng)價值；并結合高原牧草實際使用情況，在底物篩選的步驟中將箭筈豌豆和燕麥進行一定比例組合，起到平衡養(yǎng)分、提高2種牧草消化率的作用，從而更好地利用2種牧草；在此基礎上再篩選適宜的異位酸種類及添加水平，最終達到提高粗飼料消化率、縮短牦牛生長周期、降低養(yǎng)殖成本的生產目的。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗由3部分組成，分別是利用CNCPS評定箭筈豌豆和燕麥草營養(yǎng)價值試驗、不同箭筈豌豆與燕麥組合的體外發(fā)酵試驗以及添加異位酸對牦牛瘤胃體外發(fā)酵產氣量、 發(fā)酵參數(shù)和養(yǎng)分降解率的影響試驗。

1.1.1 CNCPS評定箭筈豌豆和燕麥草營養(yǎng)價值試驗

將樣品先于(103±2) ℃下烘15 min，然后立即降到65 ℃烘干5～6 h，取出于室內空氣中冷卻4 h，粉碎過40目篩后制備成風干樣品保存，用于后續(xù)常規(guī)養(yǎng)分的測定。

1.1.2 不同箭筈豌豆與燕麥組合的體外發(fā)酵試驗

將箭筈豌豆與燕麥按照5種不同比例組合，體外發(fā)酵箭筈豌豆與燕麥的底物組合見表1。試驗共5個組合，每個組合4個重復，進行72 h的體外發(fā)酵試驗，篩選箭筈豌豆和燕麥作為發(fā)酵底物的最佳組合比例。

瘤胃液的采集：2021年1月5日于成都青白江屠宰場選取體況較好的麥洼公牦牛，屠宰后立即采集瘤胃液，用4層紗布過濾后立即裝入保溫瓶中，并通入二氧化碳(CO2)保持厭氧條件，迅速帶回實驗室進行體外發(fā)酵試驗?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

緩沖液的配制：瘤胃緩沖液的配制參照Goering等[11]的方法，將520.2 mL蒸餾水，0.1 mL A液，208.1 mL B液，208.1 mL C液，1 mL D液，62.4 mL E液于2 000 mL錐形瓶中混合均勻，進行39 ℃恒溫水浴，期間不斷通入二氧化碳直至緩沖液接近無色。

體外培養(yǎng)：體外培養(yǎng)采用ANKOM RFS體外產氣系統(tǒng)。準確稱量1 g發(fā)酵底物放入250 mL產氣瓶中，放入39 ℃恒溫氣浴振蕩器預熱60 min。將預先經(jīng)39 ℃水浴解凍好的瘤胃液經(jīng)4層紗布過濾后，按1∶4與預先配制好的混合緩沖液均勻混合，期間不斷通入二氧化碳保證其處于厭氧環(huán)境。準確量取150 mL混合瘤胃液加入到每個產氣瓶中，然后迅速擰緊產氣瓶蓋子。將其置于39 ℃的恒溫氣浴振蕩器中，進行體外培養(yǎng)72 h，同時進行空白試驗。提前制冰，將編號的尼龍袋烘干稱重，培養(yǎng)結束后停止記錄，保存數(shù)據(jù)，將產氣瓶放在冰上終止發(fā)酵，立即測定pH，用尼龍袋將發(fā)酵液過濾，液體分裝于3個50 mL離心管中，置于-20 ℃保存，用于測定發(fā)酵參數(shù)，用純水將產氣瓶中的殘渣沖至尼龍布上，將尼龍布置于65 ℃烘箱中烘48 h，稱重，計算干物質降解率。

1.1.3 添加異位酸對牦牛瘤胃體外發(fā)酵產氣量、 發(fā)酵參數(shù)和養(yǎng)分降解率的影響試驗

以篩選出的箭筈豌豆和燕麥組合為發(fā)酵底物，分別添加3個水平的異丁酸、2-甲基丁酸和戊酸進行體外發(fā)酵試驗。試驗共10個處理，每個處理5個重復，異位酸種類及添加水平見表3。試驗步驟同1.1.2，發(fā)酵72 h后，記錄并保存72 h產氣量，收集發(fā)酵產物樣品進行養(yǎng)分降解率及MCP、氨態(tài)氮(NH3-N)、VFA含量的測定，評價添加3種異位酸對牦牛瘤胃體外發(fā)酵產氣量、 發(fā)酵參數(shù)和養(yǎng)分降解率的影響。

1.2 試驗材料

異丁酸、2-甲基丁酸和戊酸由某公司提供，純度>95%。體外產氣的發(fā)酵底物采用箭筈豌豆和燕麥，其中箭筈豌豆采集自四川省甘孜縣貢隆鄉(xiāng)(海拔3 354 m)，為新牧草，65 ℃烘干制備為風干樣品；燕麥采集自四川省甘孜縣庭卡鄉(xiāng)(海拔3 500 m)，為收割儲備的燕麥干草樣品。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 常規(guī)養(yǎng)分測定

每個樣品取2個平行，以平均值為最終測定結果，不平行樣品需重新取樣測定，測定指標包括干物質(DM)、粗脂肪(EE)、粗蛋白質(CP)、粗灰分(Ash)、NDF、酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌不溶蛋白(NDIP)、酸性洗滌不溶蛋白(ADIP)和酸性洗滌木質素(ADL)含量，測定方法參考《飼料分析及飼料質量檢測技術》[12]。

1.3.2 NPN含量測定

采用三氯乙酸法[13]測定NPN含量，具體方法為：稱取0.5 g待測樣品于125 mL錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，靜置0.5 h后加入10 mL 10%三氯乙酸溶液，靜置20～30 min，使用Whatman#541或#54濾紙過濾，殘渣使用三氯乙酸溶液沖洗2次，再轉移至凱氏定氮儀測定氮含量。

1.3.3 可溶性蛋白(SOLP)含量測定

參照硼酸-磷酸鹽緩沖液法[14]測定SOLP含量，具體方法為：稱取0.5 g樣品，置于錐形瓶中，加入50 mL硼酸鹽-磷酸鹽緩沖溶液，再加入1 mL 10%疊氮化鈉，室溫靜置3 h，真空抽濾，濾渣定氮。

1.3.4 淀粉(Starch)含量測定

淀粉含量測定方法參照蒽酮法[15]。

1.3.5 CNCPS組分

CNCPS根據(jù)飼料在瘤胃中的降解特性將飼料中蛋白質分為非蛋白氮(PA)、真蛋白(PB)、不可降解蛋白(PC)，根據(jù)降解速率又將PB分為快速降解蛋白(PB1)、中速降解蛋白(PB2)和慢速降解蛋白(PB3)；將飼料中的碳水化合物(CHO)分為快速降解碳水化合物(CA)、中速降解碳水化合物(CB1)、慢速降解碳水化合物(CB2)和不可降解碳水化合物(CC)。參根據(jù)Sniffen等[16]的公式計算CNCPS組分，各組分計算公式如下：

PA(%CP)=NPN(%SOLP)×0.01×
SOLP(%CP)；
PB1(%CP)=SOLP(%CP)-PA(%CP)；
PB2(%CP)=100-PA(%CP)-PB1(%CP)-
PB3(%CP)-PC(%CP)；
PB3(%CP)=NDIP(%CP)-ADIP(%CP)；
PC(%CP)=ADIP(%CP)；
CHO(%DM)=100-CP(%DM)-EE(%DM)-
Ash(%DM)；
NSC(%CHO)=100-CB2(%CHO)-
CC(%CHO)；
CA(%CHO)=[(100-Starch(%NSC)]×
[l00-CB2(%CHO)-CC(%CHO)]/100；
CB1(%CHO)=Starch(%NSC)×[(100-
CB2(%CHO)-CC(%CHO))]/100；
CB2(%CHO)=100×{[(NDF(%DM)-
NDIP(%CP)×0.01×CP(%DM)-NDF(%DM)×
0.01×ADL(%NDF)×2.4)]/CHO(%DM)}；
CC(%CHO)=[100×(NDF(%DM)×0.01×
ADL(%NDF)×2.4]/CHO(%DM)。

1.3.6 產氣量(gas production，GP)測定

根據(jù)ANKOM RFS產氣測量系統(tǒng)操作說明，在39 ℃時，將產氣壓力換算為體積：

Vx=Vj×Ppsi×0.068 004 084。

式中：Vx為39 ℃時產氣體積(mL)；Vj為模塊瓶內液面上部空間的體積(mL)；Ppsi為GPM軟件記錄的累積壓力(psi)，1 psi≈6.89 kPa。

1.3.7 pH測定

培養(yǎng)結束后，立即用冰水浴終止發(fā)酵，立即用pH計(pHS-10)測定pH。

1.3.8 養(yǎng)分降解率測定

用尼龍布過濾培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液于-20 ℃保存，用于測定NH3-N、VFA和MCP含量；發(fā)酵殘渣于65 ℃烘箱中烘干，測定養(yǎng)分(DM、NDF和ADF)降解率[17]。

1.3.9 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定

取發(fā)酵后經(jīng)過濾的發(fā)酵液測定瘤胃發(fā)酵參數(shù)，NH3-N含量測定采用馮宗慈等[18]改進的比色法，VFA含量測定采用Agilent 6890 N氣相色譜儀(測定發(fā)酵液中乙酸、丙酸、異丁酸、戊酸和異戊酸的含量，以2-乙基丁酸作為內標物，采用內標校正定量方法進行計算[17])。MCP含量測定：將瘤胃液于39 ℃下水浴解凍，取5 mL瘤胃液于10 mL離心管中，經(jīng)超聲破碎后(功率350 W，破碎9次，每次15 s，間隔5 s)于2 433×g離心10 min，取1 mL上清液，于4 ℃下16 200×g離心20 min，棄去上清，用1 mL生理鹽水(0.85%)沖洗沉淀，再在4 ℃下16 200×g離心20 min，重復2次，所得沉淀即為MCP，加入1 mL蒸餾水重懸作為待測液[19]，按索萊寶生物科技有限公司BCA蛋白定量測試盒說明書測定。

1.3.10 組合效應指數(shù)計算

單項組合效應指數(shù)(single factor associative effects index，SFAEI)及多項組合效應指數(shù)(multiply factor associative effects index，MFAEI)具體計算公式如下：

SFAEI=(組合后實測值-加權估計值)/
加權估計值；
加權估計值=箭筈豌豆樣品的實測值×
所占比例+燕麥樣品的實測值×所占比例。

MFAEI為多個單向組合效應指數(shù)之和[20]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

通過SPSS 20.0數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。CNCPS數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗分析；產氣量采用重復測量數(shù)據(jù)雙因素或三因素方差分析，利用一般線性模型(GLM)對數(shù)據(jù)進行球形檢驗，多重比較選擇Duncan氏法進行檢驗；對發(fā)酵底物組合篩選試驗的其他指標采用單因素方差分析，對添加異位酸發(fā)酵試驗的其他指標采用雙因素方差分析。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 箭筈豌豆和燕麥的養(yǎng)分含量和CNCPS組分含量

由表4可知，箭筈豌豆和燕麥的DM含量都在88%以上；箭筈豌豆的CP含量為25.47%，顯著高于燕麥(P<0.05)；箭筈豌豆的NDF含量為43.79%，顯著低于燕麥(P<0.05)；箭筈豌豆的NDIP和ADIP含量顯著低于燕麥(P<0.05)。以上結果提示，箭筈豌豆的營養(yǎng)品質要優(yōu)于燕麥。

表4 箭筈豌豆和燕麥養(yǎng)分含量(干物質基礎)

由表5可知，箭筈豌豆的PC含量顯著低于燕麥(P<0.05)，表明其蛋白質品質優(yōu)于燕麥。燕麥的CHO、CB1和CB2含量顯著高于箭筈豌豆(P<0.05)，而CC含量顯著低于箭筈豌豆(P<0.05)，表明燕麥的CHO品質優(yōu)于箭筈豌豆。綜合來看，箭筈豌豆和燕麥作為牦牛用飼草都具有較好的營養(yǎng)價值。

2.2 箭筈豌豆與燕麥不同底物組合體外發(fā)酵的組合效應

由表6可知，箭筈豌豆和燕麥不同底物組合與時間之間存在顯著交互作用(P<0.05)，但是不同底物組合對累計產氣量無顯著影響(P>0.05)。時間對累積產氣量產生顯著影響(P<0.05)，各組產氣量隨著發(fā)酵時間延長顯著增加(P<0.05)。

由表7可知，隨著底物組合中燕麥添加比例增加，DM、NDF和ADF降解率呈現(xiàn)先增加后降低的變化規(guī)律，其中組合2的DM、NDF和ADF降解率最高，顯著高于組合5(P<0.05)，而組合2的pH則顯著低于組合1與組合5(P<0.05)。隨著底物組合中燕麥添加比例增加，NH3-N含量呈現(xiàn)線性降低規(guī)律，且各組合之間差異顯著(P<0.05)；MCP含量先增加后降低，其中組合2和組合3的MCP含量顯著高于其他組合(P<0.05)。

表5 箭筈豌豆和燕麥CNCPS組分含量(干物質基礎)

表6 箭筈豌豆與燕麥不同底物組合的累積產氣量

由表8可知，以SFAEI評估各項指標時，除pH外，其他指標的SFAEI均為正值，表明箭筈豌豆和燕麥不同底物組合的多項組合效應為正組合效應。以MFAEI評估不同組合時，其效應值隨組合中燕麥含量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中組合3的MFAEI為0.661 8，高于組合2和組合3，因此采用組合3(50%箭筈豌豆+50%燕麥)作為后續(xù)試驗的發(fā)酵底物。

表7 箭筈豌豆與燕麥不同底物組合的體外發(fā)酵參數(shù)和養(yǎng)分降解率

表8 箭筈豌豆與燕麥不同底物組合體外發(fā)酵的組合效應指數(shù)

2.3 添加異位酸對牦牛瘤胃體外發(fā)酵產氣量、 發(fā)酵參數(shù)和養(yǎng)分降解率的影響

2.3.1 72 h累積產氣量

由表9可知，異位酸種類、添加水平與發(fā)酵時間對牦牛瘤胃體外發(fā)酵72 h累積產氣量不存在顯著交互作用(P>0.05)，其中異位酸種類與發(fā)酵時間、異位酸添加水平與發(fā)酵時間對牦牛瘤胃體外發(fā)酵72 h累積產氣量存在顯著交互作用(P<0.05)。隨著發(fā)酵時間的延長，各組的累積產氣量顯著增加(P<0.05)。與空白對照組相比，添加異丁酸顯著降低72 h累積產氣量(P<0.05)，并且添加異丁酸的72 h累積產氣量也顯著低于添加2-甲基丁酸和戊酸(P<0.05)。隨著異位酸添加水平的增加，72 h累積產氣量呈現(xiàn)先降低后增加的變化趨勢，其中0.3%添加水平的72 h累積產氣量顯著低于0和0.9%添加水平(P<0.05)。

2.3.2 養(yǎng)分降解率和發(fā)酵參數(shù)

由表10可知，異位酸種類與添加水平對牦牛瘤胃體外發(fā)酵DM、NDF和ADF降解率以及pH、NH3-N和MCP含量無顯著交互作用(P>0.05)。異位酸種類和添加水平也分別對牦牛瘤胃體外發(fā)酵DM、NDF和ADF降解率無顯著影響(P>0.05)。異位酸種類顯著影響牦牛瘤胃體外發(fā)酵pH、NH3-N和MCP含量(P<0.05)。與空白對照組相比，添加異丁酸、2-甲基丁酸和戊酸能顯著降低NH3-N含量(P<0.05)，其中添加戊酸的NH3-N含量還顯著低于添加異丁酸和2-甲基丁酸(P<0.05)。異位酸添加水平顯著影響牦牛瘤胃體外發(fā)酵NH3-N和MCP含量(P<0.05)。與0添加水平相比，NH3-N含量在添加水平為0.3%、0.6%和0.9%時顯著降低(P<0.05)，其中在添加水平為0.3%時的最低；MCP含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在添加水平為0.9%時最低，顯著低于其他添加水平(P<0.05)，提示異位酸添加水平過高可能會抑制體外發(fā)酵體系中微生物的增殖。

表9 添加異位酸對牦牛瘤胃體外發(fā)酵72 h累積產氣量的影響

9Items Time/h4816243648720.6%17.87±1.83b29.08±3.69c65.66±13.38b90.06±15.02b113.41±14.31ab124.95±12.08ab133.46±11.64ab0.9%24.17±3.41a40.89±7.03b83.87±14.00a104.50±16.84a126.87±15.16a138.11±14.09a146.89±14.51aP P-value×× Type×supplemental level×time0.161× Type×time<0.001× Supplemental level×time0.008× Type×supplemental level0.571 Time<0.001 Type<0.001 Supplemental level<0.001

表10 添加異位酸對牦牛瘤胃體外發(fā)酵養(yǎng)分降解率和發(fā)酵參數(shù)的影響

10ItemsDMD/%NDFD/%ADFD/%pHNH3-N/(mg/dL)MCP/(mg/dL) Supplemental level068.51±4.1253.93±5.8953.70±5.806.75±0.0427.25±0.59a57.29±0.66a0.30%70.81±2.3956.01±2.4753.46±3.596.78±0.0424.14±0.78c59.21±5.33a0.60%71.06±3.0157.29±5.1855.53±6.916.76±0.0624.68±1.65bc58.53±4.98a0.90%69.76±3.1756.56±5.7355.93±6.426.76±0.0225.30±1.56b51.63±5.98bP P-value×Type×supplemental level0.6300.7060.5490.9810.2620.087 Type0.1350.6340.6400.040<0.001<0.001Supplemental level0.4520.7770.4830.4110.006<0.001

2.3.3 VFA含量

由表11可知，異位酸種類與添加水平對牦牛瘤胃體外發(fā)酵除戊酸含量及乙酸/丙酸之外的VFA含量均存在顯著交互作用(P<0.05)。異位酸種類極顯著影響了牦牛瘤胃體外發(fā)酵VFA含量(P<0.05)，其中與空白對照組相比，添加2-甲基丁酸顯著增加了乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量(P<0.05)，且顯著高于添加異丁酸和戊酸(P<0.05)；添加異丁酸顯著增加了異丁酸含量(P<0.05)，且顯著高于和添加2-甲基丁酸和戊酸(P<0.05)；添加戊酸顯著增加了戊酸含量(P<0.05)，且顯著高于添加異丁酸和2-甲基丁酸(P<0.05)。但是與空白對照組相比，添加戊酸顯著降低了乙酸、丙酸和TVFA含量(P<0.05)。異位酸添加水平對瘤胃體外發(fā)酵除乙酸和丁酸含量之外的VFA含量和乙酸/丙酸產生顯著影響(P<0.05)。隨著異位酸添加水平的增加，丙酸、戊酸和TVFA含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在0.6%添加水平最高，均顯著高于0和0.9%添加水平(P<0.05)；而異丁酸、異戊酸含量呈現(xiàn)線性增加趨勢，在0.9%添加水平最高，顯著高于0和0.3%添加水平(P<0.05)。

表11 添加異位酸對牦牛瘤胃體外發(fā)酵VFA含量的影響

11ItemsAcetic acid/(mmol/L)Propionic acid/(mmol/L)Butyric acid/(mmol/L)Isobutyric acid/(mmol/L)Valeric acid/(mmol/L)Isovaleric acid/(mmol/L)/Acetic acid/propionic acidTotal volatile fatty acids/(mmol/L) Valeric acid0.30%12.84±1.554.82±1.291.67±0.390.27±0.070.63±0.140.41±0.122.77±0.5720.65±3.250.60%11.64±2.124.37±1.071.43±0.590.23±0.100.81±0.090.37±0.192.72±0.4418.85±3.900.90%10.57±1.163.34±0.891.40±0.390.22±0.060.64±0.140.40±0.113.28±0.5716.56±2.66 Main effects TypeBlank control group16.65±2.16b5.44±1.01c1.79±0.19b0.32±0.14c0.44±0.09c0.51±0.10b3.14±0.61a25.14±2.38b Isobutyric acid15.08±3.01b6.53±1.69b1.48±0.42b0.68±0.25a0.39±0.14c0.45±0.12b2.43±0.73b24.62±4.52b2- 2-methybutyric acid24.17±2.74a7.78±1.14a2.47±0.27a0.44±0.10b0.57±0.09b1.21±0.38a3.13±0.31a36.65±3.90a Valeric acid11.68±1.81c4.18±1.20d1.50±0.45b0.24±0.08c0.69±0.14a0.39±0.14b2.92±0.56a18.69±3.52c Supplemental level016.65±2.165.44±1.01b1.79±0.190.32±0.14c0.44±0.09b0.51±0.10c3.14±0.61a25.14±2.38b0.30%17.11±7.246.78±1.98a1.73±0.720.36±0.12bc0.49±0.18b0.55±0.27bc2.52±0.62b27.02±9.96ab0.60%17.56±5.136.81±1.97a1.81±0.580.45±0.23b0.63±0.17a0.68±0.42ab2.62±0.41b27.95±7.70a0.90%16.28±5.434.89±1.55b1.90±0.510.54±0.31a0.43±0.15b0.83±0.58a3.35±0.45a24.98±8.00bP P-value×Type×supplemental level<0.0010.0040.003<0.0010.8010.0010.082<0.001 Type<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 Supplemental level0.133<0.0010.374<0.0010.003<0.001<0.0010.020

3 討 論

3.1 箭筈豌豆和燕麥的養(yǎng)分含量和CNCPS組分含量

本試驗測得燕麥的CP含量為5.57%，含量較低，低于付洋洋等[21]測得四川省阿壩州燕麥干草的CP含量(8.42%)，與殷滿財?shù)萚22]測得青海地區(qū)燕麥干草的CP含量(4.1%)接近，NDF和ADF含量與付洋洋等[21]的結果相近，高于殷滿財?shù)萚22]的結果。箭筈豌豆的CP含量為25.47%，與陳玲玲等[23]測定的赤峰地區(qū)箭筈豌豆的CP含量(25.23%)相近，高于Karabulut等[24]測定的箭筈豌豆的CP含量(18.1%)，提示不同產地的燕麥和箭筈豌豆由于生長環(huán)境和收割季節(jié)的差異，從而影響其養(yǎng)分的組成。CNCPS組分含量中，燕麥NDIP和ADIP含量高于箭筈豌豆，且箭筈豌豆PC含量較低，表明箭筈豌豆更容易被動物消化，但燕麥的淀粉和CHO含量較高，可為反芻動物提供能量，而箭筈豌豆的CHO含量較低，CC含量較高。一般來說，豆科牧草與禾本科牧草的蛋白質和CHO含量差異較大，與禾本科牧草相比，豆科牧草蛋白質含量較高，CHO含量較低[23]。綜合來看，燕麥的CHO含量較高，箭筈豌豆的蛋白質含量高，為更好利用2種牧草，平衡營養(yǎng)成分，提示牦牛飼草中可將箭筈豌豆與燕麥進行一定比例組合，以提高2種牧草的消化率。

3.2 箭筈豌豆與燕麥不同底物組合體外發(fā)酵的組合效應

瘤胃降解飼料產生的氣體主要來源于微生物對飼料中蛋白質和CHO含碳部分的降解，可在一定程度上反映瘤胃微生物對飼料的利用效率[25]。CHO含量較高的牧草的產氣量高于蛋白質含量較高的牧草，隨著體外發(fā)酵時間延長，產氣量也逐漸累積[26]。本試驗中，同樣也觀察到隨著發(fā)酵底物組合中燕麥添加比例增加產氣量呈上升的趨勢，可能是由于燕麥的CHO含量高于箭筈豌豆，隨著其比例增加從而提高了產氣量。

除了產氣量，本試驗還發(fā)現(xiàn)隨著燕麥添加比例增加，DM、NDF和ADF降解率均降低。賈澤統(tǒng)[27]探究了不同比例苜蓿草與燕麥草組合對奶牛生產性能的影響，發(fā)現(xiàn)隨著燕麥草的添加比例升高，奶牛的生產性能降低，這是由于燕麥草的纖維素含量高于苜蓿草，蛋白質含量低于苜蓿草，造成生產性能下降，因此推測DM、NDF和ADF降解率隨燕麥含量增加而降低與底物組合中纖維素含量逐漸增加有關。刁波等[28]將燕麥與天然牧草組合發(fā)現(xiàn)，隨著燕麥添加比例增加，NH3-N含量逐漸降低，與本試驗中結果一致。NH3-N主要來自飼草中蛋白質降解，本試驗用發(fā)酵底物箭筈豌豆CP含量顯著高于燕麥，所以當?shù)孜锝M合中箭筈豌豆添加比例較高時，蛋白質分解較快，不能及時被微生物合成MCP，造成NH3-N含量增加。MCP含量隨著燕麥添加比例增多呈現(xiàn)先增加后降低的規(guī)律，其中箭筈豌豆與燕麥比例為75∶25以及50∶50時顯著高于其他組合，表明箭筈豌豆和燕麥進行組合能提高飼草蛋白質向MCP的轉化率。根據(jù)MFAEI結果，本研究確定將50%箭筈豌豆+50%燕麥作為體外發(fā)酵底物組合。

3.3 添加異位酸對牦牛瘤胃體外發(fā)酵產氣量、養(yǎng)分降解率和發(fā)酵參數(shù)的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，添加異丁酸能夠顯著降低發(fā)酵72 h的累積產氣量，而添加2-甲基丁酸和戊酸對72 h的累積產氣量影響不大。這可能是由于異位酸的加入對瘤胃中某些特定細菌具有抑菌活性[29]；程桂英[30]試驗也表明，添加不同異位酸會改變瘤胃細菌區(qū)系的組成，且每種異位酸有各自的優(yōu)勢菌群。此外，不同試驗條件下發(fā)酵底物和瘤胃液中微生物存在差異，最終降低了產氣量。

本試驗中，添加不同種類及不同水平的異位酸對DM、NDF、ADF降解率無顯著影響，龍際飛等[31-32]在體外發(fā)酵中添加戊酸，發(fā)現(xiàn)0.3%戊酸組NDF降解率與對照組差異不顯著，但隨著戊酸添加水平增加，NDF降解率顯著降低；在體外發(fā)酵中添加2-甲基丁酸，NDF降解率先升高后降低，但無顯著差異。在體內試驗中，劉強等[33]在西門塔爾牛飼糧中添加異丁酸和異戊酸，發(fā)現(xiàn)能顯著提高玉米秸稈的NDF和ADF降解率。飼糧中添加2-甲基丁酸也同樣可以提高DM、NDF和ADF降解率[34-36]。邵廣[37]在奶牛飼糧中添加2-甲基丁酸，發(fā)現(xiàn)可顯著提高NDF和ADF降解率，DM降解率也有提高的趨勢，提示異位酸能提高纖維分解菌的活性，其促進飼料降解率的作用與異位酸種類、添加水平和飼料底物有關，且在體內飼養(yǎng)試驗作用效果優(yōu)于體外發(fā)酵試驗。

pH可以反映瘤胃環(huán)境的狀況，適宜的pH為6.2～7.0，在這區(qū)間瘤胃微生物能正常生長繁殖，在本試驗中，添加異位酸對pH無顯著影響，與前人研究結果[37-38]一致，表明添加異位酸不會改變瘤胃的發(fā)酵環(huán)境，微生物能正常生長繁殖。NH3-N和MCP可以反映瘤胃微生物對氮的轉化和利用，研究表明瘤胃適宜的NH3-N含量為6.3～27.5 mg/dL[39]。本試驗中，NH3-N含量均在適宜范圍內，并且添加異位酸能顯著降低NH3-N含量，這與前人的試驗結果[40-41]一致，表明添加異位酸能提高微生物對氮的利用。本試驗中，添加2-甲基丁酸能提高MCP含量，而添加異丁酸會降低MCP含量，這與前人的研究結果[42]不一致。NH3-N含量受到飼糧中CP降解速度和MCP合成速度的影響，NH3-N含量降低但MCP含量并未升高，這可能是由于異丁酸的添加水平較高，CP的降解速度受到了限制，導致NH3-N和MCP含量下降。

VFA是瘤胃微生物利用CHO發(fā)酵后的產物，能為反芻動物提供所需能量的70%～80%。本試驗中，添加2-甲基丁酸均顯著提高了各種VFA和TVFA含量，其中在提高乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸以及TVFA含量上效果優(yōu)于異丁酸和戊酸。李鶴瓊等[41]在犢牛飼糧中添加2-甲基丁酸，發(fā)現(xiàn)可顯著提高30日齡瘤胃乙酸含量。周勝花等[43]在荷斯坦奶牛飼糧中添加2-甲基丁酸，發(fā)現(xiàn)瘤胃乙酸、丁酸和TVFA含量顯著增加，與本試驗結果一致，表明2-甲基丁酸能增加VFA含量。添加異丁酸雖然對MCP合成有抑制作用，但對瘤胃中丙酸和異丁酸生成有促進作用，其中在0.6%添加水平時丙酸含量顯著增加，改善對能量的代謝和利用。上述結果提示，添加不同種類的異位酸對VFA含量的影響研究結果并不一致，主要受異位酸種類、添加水平和發(fā)酵底物營養(yǎng)成分差異影響。

4 結 論

箭筈豌豆蛋白質品質優(yōu)于燕麥，而CHO品質低于燕麥；50%箭筈豌豆+50%燕麥為牦牛瘤胃體外發(fā)酵最佳底物組合；添加0.3% 2-甲基丁酸或0.3%戊酸能夠改善牦牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)。