師俊華 王 森 王之盛 胡 瑞 王俊梅 郭逸芯 張曉紅 施麗媛 鄒華圍 彭全輝 薛 白 王立志

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，四川省牛低碳養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物抗病營養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130)

牦牛是牛屬動(dòng)物中的特有牛種，主要生活在高原寒冷氣候的環(huán)境中[1]。我國牦牛存欄量占世界牦牛養(yǎng)殖總量的92%左右，主要分布于青海、西藏、四川等地，是當(dāng)?shù)氐漠a(chǎn)業(yè)支柱[2-3]。但迄今為止，高原牦牛飼養(yǎng)模式大多為傳統(tǒng)的放牧方式。高原地區(qū)冷季放牧期長達(dá)8個(gè)月，寒冷的氣候致使牧草的產(chǎn)量和營養(yǎng)價(jià)值下降，而且適口性很差[4]。冷季期牦牛攝食不足使其遭受著冷季饑餓問題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，1個(gè)冷季枯草期牦牛體重下降達(dá)30%左右[5]。因此，冷季饑餓是目前牧區(qū)放牧牦牛面臨的主要問題。饑餓時(shí)機(jī)體的補(bǔ)償機(jī)制被激活，大量動(dòng)員機(jī)體脂肪等體貯以維持生命，體脂動(dòng)員是動(dòng)物應(yīng)對饑餓等逆境條件的生物適應(yīng)機(jī)制[6]，脂肪組織是機(jī)體主要的可逆的能量貯存器官[7]，饑餓狀態(tài)下，脂肪分解供能生成酮體[8-9]，其中超過70%為β-羥基丁酸(BHBA)，乙酰乙酸占比約30%，另有少量的丙酮。動(dòng)物在饑餓脅迫下，BHBA是產(chǎn)生的最主要的酮體，不僅是脂肪降解的重要產(chǎn)物，還能夠作為能源物質(zhì)在肌肉和大腦等重要組織器官氧化供能，同時(shí)還能夠參與乳脂的合成[10-13]。研究發(fā)現(xiàn)，BHBA可作為動(dòng)物饑餓應(yīng)激下的信號物質(zhì)[14]，影響胰島素的分泌，并產(chǎn)生胰島素抵抗，還可反饋調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝[15]。脂聯(lián)素(ADPN)是調(diào)節(jié)機(jī)體“脂肪穩(wěn)恒”的重要脂肪因子[16]，近年來有研究表明，在人和鼠脂肪細(xì)胞的細(xì)胞膜上，BHBA的受體G蛋白偶聯(lián)受體109A(GPR109A)活性與表達(dá)量同脂肪細(xì)胞分泌的ADPN具有很大聯(lián)系，GPR109A基因被敲除的小鼠，其血液中ADPN濃度沒有發(fā)生變化[17]，此研究結(jié)果表明BHBA與GPR109A結(jié)合后可顯著提高血液中ADPN的濃度。動(dòng)物通過長期進(jìn)化，形成了一種應(yīng)對饑餓脅迫的適應(yīng)機(jī)制，其脂肪細(xì)胞會分泌ADPN以應(yīng)對饑餓脅迫[18]。因此，饑餓時(shí)酮體BHBA會開始調(diào)節(jié)機(jī)體ADPN的基因表達(dá)和分泌過程，從而進(jìn)一步影響機(jī)體的脂肪代謝進(jìn)程，同時(shí)，酮體BHBA在能量儲存與消耗方面也具有十分重要且不可替代的巨大作用[19]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，對饑餓牦牛靜脈灌注BHBA能夠提高血清ADPN濃度及脂肪合成代謝相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，抑制脂肪分解酶活性，抑制脂肪分解[20]。但因體內(nèi)試驗(yàn)影響因素較多，且BHBA是否對ADPN分泌具有特殊的某種調(diào)控機(jī)制還尚待研究。鑒于此，本試驗(yàn)在從細(xì)胞水平研究饑餓處理下BHBA對牦牛脂肪代謝以及ADPN表達(dá)的調(diào)控作用，旨在從分子水平揭示牦牛應(yīng)對饑餓的適應(yīng)機(jī)制，豐富牦牛脂肪代謝營養(yǎng)調(diào)控理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)和胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、羅格列酮(RSG)購自Sigma公司；青/鏈霉素(雙抗)、地塞米松(DEX)、谷氨酰胺(Gln)、胰島素、Ⅰ型膠原酶購自索萊寶公司；油紅O染色試劑盒購自博奧森公司；RNA提取試劑盒購自美基生物科技公司；反轉(zhuǎn)錄和定量試劑盒購自艾科瑞公司。

1.2 樣品采集與處理

選擇4頭1歲左右的體況相近且健康的雄性麥洼牦牛[體重(211.25±27.10) kg]進(jìn)行屠宰。屠宰后迅速采集其腹股溝脂肪組織，用無菌PBS(2%雙抗)沖洗至組織表面無異物后，裝入盛有無菌PBS(2%雙抗)的自封袋中，將自封袋放入冰盒內(nèi)帶回細(xì)胞間內(nèi)準(zhǔn)備分離細(xì)胞。

1.3 前體脂肪細(xì)胞分離、培養(yǎng)及分化

按照郭紅芳等[21]的前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)方法分離和培養(yǎng)牦牛前體脂肪細(xì)胞，并進(jìn)行改進(jìn)。具體操作如下：將脂肪組織剔除筋膜及血管后用0.2%的Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴消化1 h，之后使用40 μm細(xì)胞篩過濾離心，將得到的細(xì)胞團(tuán)用完全培養(yǎng)基(2% Gln，1%雙抗，10% FBS)重懸細(xì)胞，接種在25 cm2培養(yǎng)瓶，放在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。采用半換液方式，每24 h更換1次完全培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)。

誘導(dǎo)分化方法在前人雞尾酒法[22-23]的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，具體為：當(dāng)細(xì)胞生長融合時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隨后使用無菌PBS清洗1遍細(xì)胞，換至成脂分化液(1 μmol/L RSG，2%醫(yī)用乳清注射劑，1%雙抗，1% Gln)，3 d后更換維持培養(yǎng)基(10 μg/mL胰島素，1 μmol/L RSG，1%雙抗，1% Gln)，之后每3 d更換1次維持培養(yǎng)基，直至脂肪細(xì)胞分化成熟。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將F3代前體脂肪細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞接種量為1×104個(gè)，誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后分為正常組、饑餓組，其中正常組使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，而饑餓組換為饑餓培養(yǎng)基(1%雙抗，2% Gln)培養(yǎng)48 h，之后分別使用0、4、8、16、32 mmol/L的BHBA再繼續(xù)處理24 h[24]，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

1.5 油紅O染色及光密度(OD)值測定

用油紅O染色試劑盒按照說明書中方法對脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴進(jìn)行染色，具體為：每孔加入1.5 mL 4%多聚甲醛固定液，室溫固定30 min。用60%異丙醇通透細(xì)胞后，每孔加入1.5 mL油紅O工作液，室溫避光孵育40 min，棄去染色液，用60%異丙醇漂洗10 s，最后晾干使用倒置顯微鏡進(jìn)行鏡檢。鏡檢結(jié)束后，使用色譜級異丙醇萃取20 min，并用酶標(biāo)儀檢測510 nm波長的OD值。

1.6 脂肪代謝關(guān)鍵酶與ADPN濃度的測定

收集細(xì)胞培養(yǎng)基樣品于1.5 mL離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用酶?lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(牛種屬，南京建成生物工程研究所)按照說明書中方法測定脂肪代謝關(guān)鍵酶與ADPN濃度。

1.7 總RNA提取與目的基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測

根據(jù)RNA提取試劑盒說明書，從每組脂肪細(xì)胞中提取總RNA，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反向轉(zhuǎn)錄為用于qRT-PCR的cDNA，對目的基因脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶(ACACA)、激素敏感脂酶(HSL)、脂聯(lián)素(ADPN)、二?；视王；D(zhuǎn)移酶1(DGAT1)、過氧化物酶增殖物激活受體α(PPARα)、過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARγ)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP1c)、叉頭框O蛋白1(FoxO1)、脂酰輔酶A氧化酶(ACOX)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。qRT-PCR所用引物序列如表1所示。本試驗(yàn)以泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子(UXT)為內(nèi)參基因，采用384孔板，反應(yīng)體系體積為10 μL，包含0.2 μL正向引物、0.2 μL反向引物、1.0 μL cDNA、5.0 μL SYBR Green染料、0.2 μL ROX(20 μmol/L)和3.4 μL RNase無酶水。反應(yīng)過程如下：在95 ℃下預(yù)變性30 s，在95 ℃下變性5 s，在60 ℃下延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：95 ℃下5 s，65 ℃下1 min。采用2-△△Ct法計(jì)算各組脂肪細(xì)胞中目的基因的表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列

1GenesAccession No. Primer sequences (5′—3′)1c SREBP1cXM_014477492F:AGTTGAATAAATCTGCCGTCTTR:GCTTCTGGTTGCTGTGCTO1 FoxO1XM_005900262F:CTTCAGCCAGAGCAGTATTTR:CTTTTTCCAGTTCCTTCATTCA ACOXXM_014479198F:TCCCCAGGGAGAACATGCTR:GCACTCCGAGCTTGACATAGGT UXTNM_001037471F:TGTGGCCCTTGGATATGGTTR:GGTTGTCGCTGAGCTCTGTG

1.8 Western blot檢測

用無菌PBS洗滌細(xì)胞后，用RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)[含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)]收集細(xì)胞，然后在冰水中對細(xì)胞進(jìn)行超聲波破碎，并在4 ℃下以13 000 r/min離心20 min，離心后收取上清液，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)檢測上清液的蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)樣品在98 ℃下變性10 min，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白質(zhì)上樣量為20 μg；電泳完成后，甲醇浸泡0.22 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜5 min，隨后用預(yù)冷轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡轉(zhuǎn)印濾紙和活化的PVDF膜2 min；組裝三明治轉(zhuǎn)膜夾，放入轉(zhuǎn)膜槽，注入預(yù)冷轉(zhuǎn)膜緩沖液，100 V進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜完成后，PVDF膜用1×TBST溶液快速漂洗1次，用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，用1×TBST溶液漂洗4次，每次5 min，用稀釋后的一抗(稀釋液為一抗稀釋液，稀釋比見表2)在4 ℃雜交過夜，第2天用1×TBST溶液漂洗4次，每次5 min，用稀釋二抗(稀釋液為5%脫脂奶粉，稀釋比見表2)室溫雜交1 h后，用1×TBST溶液漂洗4次，每次5 min。

表2 Western blot抗體

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2016整理所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布，使用one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并以Duncan氏法進(jìn)行多重比較；若不符合正態(tài)分布，使用非參數(shù)檢驗(yàn)，并進(jìn)行兩兩比較；其他數(shù)據(jù)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。其中，ADPN和GPR109A相關(guān)數(shù)據(jù)另使用ANOVA程序進(jìn)行線性、二次效應(yīng)分析，利用曲線估計(jì)程序進(jìn)行回歸分析，回歸結(jié)果以回歸方程、y極大值及對應(yīng)x值和R2表示，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞油紅O染色的影響

油紅O染色結(jié)果(圖1)表明，隨著BHBA濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量逐漸減少。將脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴油紅O染色進(jìn)行量化后(表2)發(fā)現(xiàn)，正常組隨著BHBA濃度的增加，OD值先升高后降低，BHBA濃度在8 mmol/L時(shí)OD值最高，顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)；而饑餓組隨著BHBA添加量的增加，OD值先降低后升高，且BHBA濃度為32 mmol/L時(shí)OD值最高，顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)。

使用油紅O染色后，倒置熒光顯微鏡在10×40倍鏡下觀察，圖中暗紅色部分表明油紅O將細(xì)胞內(nèi)脂滴染色。

表3 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴油紅O染色量化值(OD值)的影響

2.2 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量及濃度的影響

如表4所示，脂肪降解途徑中，隨BHBA濃度的升高，正常組ACOX的基因表達(dá)量先降低后升高再降低，而饑餓組則整體呈降低趨勢，且BHBA濃度分別在4和32 mmol/L時(shí)ACOX的基因表達(dá)量最低，顯著低于其他濃度時(shí)(P<0.05)；隨BHBA濃度的升高，正常組HSL的基因表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)，而饑餓組則先升高后降低，且BHBA濃度在32 mmol/L時(shí)HSL的基因表達(dá)量最低，顯著低于其他濃度時(shí)(P<0.05)。脂肪合成途徑中，隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組ACACA的基因表達(dá)量先降低后升高再降低，且BHBA濃度分別在16和8 mmol/L時(shí)ACACA的基因表達(dá)量最高，顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)；隨BHBA濃度的升高，饑餓組DGAT1的基因表達(dá)量無顯著變化，而正常組則整體呈先升高后降低趨勢，且BHBA濃度在4 mmol/L時(shí)DGAT1的基因表達(dá)量最高，顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)；隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組FASN的基因表達(dá)量先降低后升高再降低，且BHBA濃度分別在16和8 mmol/L時(shí)FASN的基因表達(dá)量最高，顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)。

表4 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響

如表5所示，脂肪降解途徑中，隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組ACOX和HSL的濃度均逐漸降低，且BHBA濃度在32 mmol/L時(shí)ACOX和HSL的濃度最低，顯著低于其他濃度時(shí)(P<0.05)。脂肪合成途徑中，隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組中ACACA和DGAT1的濃度均先降低后升高，且BHBA濃度在32 mmol/L時(shí)ACACA和DGAT1的濃度最高，顯著高于其他濃度時(shí)(饑餓組BHBA濃度8和32 mmol/L時(shí)DGAT1的濃度除外)(P<0.05)；隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組中FASN濃度先降低后升高，且BHBA濃度分別在32和16 mmol/L時(shí)FASN的濃度最高，顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)。

表5 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝關(guān)鍵酶濃度的影響

2.3 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因和蛋白表達(dá)量的影響

如表6所示，脂肪降解途徑中，隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組PPARα的基因表達(dá)量先降低后升高，且BHBA濃度分別在4和16 mmol/L時(shí)PPARα的基因表達(dá)量最低，在正常組中顯著低于濃度在0、16和32 mmol/L時(shí)(P<0.05)，在饑餓組中顯著低于濃度在0和8 mmol/L時(shí)(P<0.05)；隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組FoxO1的基因表達(dá)量呈降低趨勢，且BHBA濃度在32 mmol/L時(shí)FoxO1的基因表達(dá)量最低，顯著低于濃度在0、4和8 mmol/L時(shí)(P<0.05)。脂肪合成途徑中，隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組CEBPα的基因表達(dá)量先升高后降低，且BHBA濃度均在4 mmol/L時(shí)CEBPα的基因表達(dá)量最高，在正常組中顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)，在饑餓組中顯著高于濃度在0、8和16 mmol/L時(shí)(P<0.05)；隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組PPARγ的基因表達(dá)量先升高后降低再升高，且BHBA濃度分別在16和4 mmol/L時(shí)PPARγ的基因表達(dá)量最高，在正常組中顯著高于濃度在4、8和32 mmol/L時(shí)(P<0.05)，在饑餓組中顯著高于濃度在0、16和32 mmol/L時(shí)(P<0.05)；隨BHBA濃度的升高，正常組SREBP1c的基因表達(dá)量先降低后升高，而饑餓組先升高后降低，且BHBA濃度分別在16和8 mmol/L時(shí)SREBP1c的基因表達(dá)量最高，在正常組中顯著高于濃度在0、4和8 mmol/L時(shí)(P<0.05)，在饑餓組中顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)。

表6 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量的影響

如表7所示，脂肪降解途徑中，隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組PPARα的蛋白表達(dá)量先升高后降低，且BHBA濃度在32 mmol/L時(shí)PPARα的蛋白表達(dá)量最低，在正常組中顯著低于濃度在4、8和16 mmol/L時(shí)(P<0.05)，在饑餓組中顯著低于其他濃度時(shí)(P<0.05)；隨BHBA濃度的升高，正常組FoxO1的蛋白表達(dá)量先升高后降低，而饑餓組則呈降低趨勢，且BHBA濃度在32 mmol/L時(shí)FoxO1的蛋白表達(dá)量最低，顯著低于其他濃度時(shí)(P<0.05)。脂肪合成途徑中，隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組CEBPα的蛋白表達(dá)量先降低后升高，且BHBA濃度分別在16和32 mmol/L時(shí)CEBPα的蛋白表達(dá)量最高，在正常組中顯著高于濃度在0、4和8 mmol/L時(shí)(P<0.05)，在饑餓組中顯著高于濃度在4 mmol/L時(shí)(P<0.05)；隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組SREBP1c的蛋白表達(dá)量呈先升高后穩(wěn)定趨勢，且BHBA濃度分別在4和8 mmol/L時(shí)SREBP1c的蛋白表達(dá)量最高，在正常組中顯著高于濃度在0 mmol/L時(shí)(P<0.05)，在饑餓組中顯著高于濃度在0和4 mmol/L時(shí)(P<0.05)；隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組PPARγ的蛋白表達(dá)量整體上呈升高趨勢，且BHBA濃度分別在32和8 mmol/L時(shí)PPARγ的蛋白表達(dá)量最高，在正常組中顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)，在饑餓組中顯著高于濃度在0和16 mmol/L時(shí)(P<0.05)。

表7 不同濃度BHBA對脂肪細(xì)胞脂肪內(nèi)代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)量的影響

2.4 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞內(nèi)GPR109A基因和蛋白表達(dá)量以及ADPN基因表達(dá)量和分泌的影響

如表8和表9所示，隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組ADPN的基因表達(dá)量和濃度均先升高后降低，正常組中，BHBA濃度在4、8和16 mmol/L時(shí)ADPN的基因表達(dá)量和濃度較高，顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)，而饑餓組中，BHBA濃度在8和16 mmol/L時(shí)ADPN的基因表達(dá)量和

濃度較高，顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)。

如表8、表10所示，隨BHBA濃度的升高，正常組和饑餓組GPR109A的基因和蛋白表達(dá)量均先升高后降低，正常組中，BHBA濃度在4 mmol/L時(shí)GPR109A的基因和蛋白表達(dá)量最高，顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)，而饑餓組中，BHBA濃度在4和8 mmol/L時(shí)GPR109A的基因和蛋白表達(dá)量較高，顯著高于其他濃度時(shí)(P<0.05)。

表8 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞內(nèi)GPR109A和ADPN基因表達(dá)量的影響

表9 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞ADPN分泌的影響

表10 不同濃度BHBA對牦牛脂肪細(xì)胞內(nèi)GPR109A蛋白表達(dá)量的影響

2.5 BHBA濃度與GPR109A基因和蛋白表達(dá)量及ADPN基因表達(dá)量和濃度的回歸分析

如表11所示，正常組GPR109A的基因表達(dá)量與BHBA濃度無相關(guān)關(guān)系(R2<0.6，P>0.05)，而饑餓組GPR109A的基因表達(dá)量與BHBA濃度呈顯著三次相關(guān)關(guān)系(R2>0.6，P<0.01)。且饑餓組中，BHBA濃度在7.03 mmol/L時(shí)，GPR109A的基因表達(dá)量達(dá)到最大值5.09。正常組和饑餓組的GPR109A蛋白表達(dá)量與BHBA濃度均呈顯著三次相關(guān)關(guān)系(R2>0.6，P<0.01)，且BHBA濃度分別在4.13和4.60 mmol/L時(shí)，GPR109A的蛋白表達(dá)量分別達(dá)到最大值1.05和1.02。

正常組和饑餓組ADPN的基因表達(dá)量與BHBA濃度均呈顯著二次相關(guān)關(guān)系(R2>0.6，P<0.01)，且BHBA濃度分別在14.38和7.88 mmol/L時(shí)，ADPN的基因表達(dá)量分別達(dá)到最大值1.80和4.58。正常組ADPN的濃度與BHBA濃度呈顯著二次相關(guān)關(guān)系(R2>0.6，P<0.01)，而饑餓組ADPN的濃度與BHBA濃度則呈顯著三次相關(guān)關(guān)系(R2>0.6，P<0.01)，且正常組和饑餓組中BHBA濃度分別在15.38和7.56 mmol/L時(shí)，ADPN的濃度分別達(dá)到最大值78.49和82.30 ng/mL。

表11 BHBA濃度與GPR109A基因和蛋白表達(dá)量以及ADPN基因和濃度的回歸分析

3 討 論

近年來研究顯示，BHBA作為酮體的有效形式之一，同煙酸一樣能夠抑制脂肪細(xì)胞的脂解過程[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，人脂肪細(xì)胞中添加BHBA能夠顯著抑制脂肪分解過程[26]。用0.2、2、20 mmol/L的BHBA刺激體外培養(yǎng)小鼠脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)2和20 mmol/L的BHBA能夠顯著降低脂肪酸(FFA)和甘油的釋放，顯著抑制細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的釋放[27]。給大鼠口服BHBA能夠顯著提高高密度脂蛋白膽固醇濃度，使脂肪細(xì)胞體積減小[28]。本試驗(yàn)結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，檢測發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)TG含量的脂滴油紅O染色量化值(OD值)隨著BHBA濃度的升高而升高。BHBA對脂肪分解代謝的抑制作用離不開其對脂肪代謝相關(guān)酶及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。研究表明，體外培養(yǎng)的脂肪組織在分別添加煙酸和BHBA處理后，其脂肪分解代謝過程受到顯著抑制，同時(shí)HSL的活性及其磷酸化水平發(fā)生顯著下降[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，BHBA濃度超過1.2 mmol/L時(shí)，其能夠激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶(AMPK)信號通路，使PPARα的mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著升高，而使SREBP1c和CEBPα的mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著下降，同時(shí)高劑量的BHBA能夠使ACACA和FASN的mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著高于中劑量BHBA，也就是說，隨著BHBA濃度的升高，ACACA和FASN的mRNA和蛋白相對表達(dá)量先降低后升高[30]。Zhang等[31]在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中添加1.2 mmol/L的BHBA，發(fā)現(xiàn)BHBA能夠顯著提高DGAT1的表達(dá)，而敲除SREBP1c基因后再添加BHBA，ACACA、FASN和DGAT1的表達(dá)量均顯著下降，且脂肪酸合成及TG含量也受到顯著抑制。另外，PPARγ的活性也受到SREBP1c的調(diào)控[32]。本研究結(jié)果也表明，隨著BHBA濃度升高，PPARα和FoxO1以及ACOX和HSL的基因表達(dá)量下降，而PPARγ、SREBP1c和CEBPα以及ACACA、FASN和DGAT1的基因表達(dá)量升高。BHBA對脂肪代謝的調(diào)控作用，不僅依賴于其作為中間產(chǎn)物負(fù)反饋抑制脂肪分解，還依賴于其作為信號分子激活A(yù)MPK等信號通路，調(diào)節(jié)脂肪代謝調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，間接的調(diào)節(jié)TG合成與分解過程中關(guān)鍵酶的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)其對機(jī)體內(nèi)脂肪存儲及動(dòng)員的調(diào)控，以維持機(jī)體脂肪代謝平衡。

ADPN是脂肪組織特異性分泌的脂肪因子，它能夠通過其受體脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)、脂聯(lián)素受體2(AdipoR2)和T-鈣黏蛋白發(fā)揮其對脂肪代謝的調(diào)控作用[33]。研究發(fā)現(xiàn)，煙酸在促進(jìn)ADPN的分泌同時(shí)提高GPR109A的表達(dá)，而GPR109A基因敲除小鼠ADPN濃度無顯著變化，也就是說，煙酸通過GPR109A介導(dǎo)促進(jìn)ADPN的分泌[34]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BHBA是GPR109A的內(nèi)源性配體，能夠同煙酸一樣刺激GPR109A以促進(jìn)ADPN分泌[35]。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，BHBA濃度同GPR109A以及ADPN的基因表達(dá)量均呈現(xiàn)出顯著的二次方曲線增加，換句話說，隨著BHBA濃度的升高，GPR109A以及ADPN的基因表達(dá)量先升高后降低，在BHBA濃度為8 mmol/L的時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。也就是說，低濃度BHBA刺激脂肪細(xì)胞時(shí)，在其分解代謝并未完全得到抑制時(shí)，脂肪細(xì)胞將持續(xù)分泌ADPN，而高濃度BHBA(>8 mmol/L)將脂肪分解代謝顯著抑制后，ADPN的分泌量也出現(xiàn)顯著的下降，這種解釋同本試驗(yàn)中BHBA對脂肪代謝調(diào)控的結(jié)果相一致。至此，脂肪細(xì)胞分泌ADPN的多少是受到BHBA對脂肪細(xì)胞脂肪代謝過程的間接調(diào)控的，而BHBA是否對脂肪細(xì)胞分泌ADPN存在信號通路機(jī)制的調(diào)控還尚未有相關(guān)報(bào)道，還需進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，32 mmol/L BHBA能夠抑制脂肪細(xì)胞的脂肪分解代謝，增加TG的積累，加強(qiáng)脂肪合成代謝，且低濃度的BHBA能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞對ADPN的分泌，而高濃度的BHBA則會抑制ADPN的分泌。