姜奧宇 巴桑珠扎 李 斌 吳祎程 彭錦芬 呂小康 劉梓欣 黃喜妹 周傳社* 陳 亮 譚支良

(1.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理與代謝過(guò)程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410125；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩850000；4.中山市能和生物科技有限公司，中山528415；5.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略研究院，沈陽(yáng)110866)

西藏地區(qū)高寒、低氧，基礎(chǔ)物資十分匱乏，酥油(主要成分為乳脂)含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是藏族人民的生活必需品。2019年，西藏自治區(qū)奶牛存欄約44.02萬(wàn)頭，但產(chǎn)奶量?jī)H為42.39萬(wàn)t，鮮奶缺口約7.59萬(wàn)t，奶牛品種原始以及單產(chǎn)不足的問(wèn)題已嚴(yán)重制約西藏地區(qū)奶業(yè)發(fā)展。對(duì)此，西藏地區(qū)自2014年開(kāi)始引進(jìn)區(qū)外良種奶牛，但實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，高海拔低氧環(huán)境中的良種奶牛易出現(xiàn)脂質(zhì)和糖類(lèi)代謝紊亂等問(wèn)題，從而導(dǎo)致高原病的產(chǎn)生和惡化[1]。高原病常見(jiàn)于海拔2 000 m以上地區(qū)的奶牛群體，氧氣濃度降低誘發(fā)奶牛肺動(dòng)脈高壓，進(jìn)而導(dǎo)致胸部水腫和心衰竭等病變影響機(jī)體健康。研究表明，引進(jìn)到拉薩地區(qū)的荷斯坦奶牛高原病致死率為36.72%，并且冬季空氣中氧濃度降低與奶牛高死亡率存在相關(guān)性[2]，嚴(yán)重阻礙西藏地區(qū)奶業(yè)發(fā)展，因此防控奶牛高原病，提升其適應(yīng)性尤為重要。

精氨酸(Arg)作為一種條件性必需氨基酸和多功能性氨基酸，不僅可以調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞增殖以及酪蛋白合成過(guò)程，而且在精氨酸酶作用下可水解成尿酸和鳥(niǎo)氨酸，參與多胺的合成[3]。除此之外，作為體內(nèi)合成一氧化氮(NO)的唯一前體，Arg可通過(guò)多環(huán)鳥(niǎo)苷-3’, 5’-單磷酸依賴(lài)通路促進(jìn)線(xiàn)粒體的氧化磷酸化反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代謝[4]。但Arg直接添加到飼糧中，不僅成本高，而且易與賴(lài)氨酸在轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以及代謝通路中產(chǎn)生拮抗反應(yīng)[5]。N-乙酰谷氨酸(N-acetylglutamate，NAG)是一種氨基酸衍生物，可通過(guò)激活氨基甲酰磷酸合酶-Ⅰ(CPS-Ⅰ)促進(jìn)氨基甲酰磷酸合成，促進(jìn)L-脯氨酸和谷氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-瓜氨酸，在天冬氨酸以及精氨酸代琥珀酸裂解酶的參與下，最終轉(zhuǎn)化成L-Arg[6]。N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamate，NCG)作為NAG的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，其功能與NAG相似，而且在機(jī)體代謝中穩(wěn)定性較強(qiáng)，可以參與尿素循環(huán)來(lái)促進(jìn)內(nèi)源性Arg生成。Chacher等[7]通過(guò)24 h體外發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于Arg在瘤胃液環(huán)境中完全降解，NCG降解率僅為17.8%。因此，NCG作為穩(wěn)定高效的添加劑，其在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。

Chacher等[8]研究發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)奶牛飼糧中添加20 g/d NCG時(shí)，乳、血漿和尿液中的尿素氮含量達(dá)到最低值，代謝蛋白質(zhì)利用率提高。從圍產(chǎn)前期開(kāi)始飼喂NCG可以促進(jìn)奶牛機(jī)體內(nèi)源性Arg合成，顯著提高乳腺血漿流量和氨基酸含量，改善圍產(chǎn)后期奶牛肝臟功能和干物質(zhì)采食量(DMI)[9]。Gu等[10]在泌乳中期奶牛飼糧中添加40 g/(頭·d)NCG時(shí)，乳脂和乳蛋白含量分別提高7.89%和3.31%，血漿中內(nèi)源性Arg合成的增強(qiáng)導(dǎo)致必需氨基酸和生糖氨基酸總量提高，使得乳品質(zhì)得到明顯改善。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NCG在圍產(chǎn)期奶牛中應(yīng)用效果最佳，其次為泌乳高峰期、泌乳早期和泌乳中期[11]。然而,NCG在奶牛上的研究主要集中在低海拔地區(qū)泌乳期和圍產(chǎn)期奶牛上，針對(duì)NCG在高海拔低氧環(huán)境中奶牛的研究比較少見(jiàn)。

在高海拔低氧環(huán)境中，奶?？寡装Y以及葡萄糖和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，盲腸與結(jié)腸中厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)降低，導(dǎo)致機(jī)體糖類(lèi)和脂類(lèi)代謝異常，能量供應(yīng)不足，同時(shí)誘發(fā)奶牛體內(nèi)炎癥反應(yīng)，加劇高原病惡化[1]。因此，奶牛轉(zhuǎn)移到高原環(huán)境后需要提高其血液供氧能力，預(yù)防心血管系統(tǒng)障礙及其誘發(fā)的其他系統(tǒng)疾病，保障奶牛機(jī)體健康以維持正常泌乳水平。作為高效的血管舒張因子，NO早已被證實(shí)可抑制肺動(dòng)脈血管收縮，提升高原肺水腫大鼠的存活率[12]。NCG可以促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase，eNOS)的合成，增加血漿中NO含量，進(jìn)而改善肺血管壁結(jié)構(gòu)，有效降低奶牛肺血管壓力和心臟負(fù)荷[13]。因此，本研究旨在評(píng)價(jià)在泌乳期奶牛飼糧中添加NCG對(duì)奶牛養(yǎng)分表觀(guān)消化率、泌乳性能、血清抗氧化以及抗高原反應(yīng)指標(biāo)的影響，為提升高海拔地區(qū)泌乳奶牛的生產(chǎn)性能提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇20頭泌乳前期荷斯坦奶?！廖鞑攸S牛雜交第3代奶牛[胎次2.0±0.7，體重(413±42) kg，體況評(píng)分3.36±0.26]，隨機(jī)分為2組，每組10頭。對(duì)照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組(NCG組)在基礎(chǔ)飼糧中添加20 g/(頭·d)NCG(中山市某生物科技有限公司，含量≥80%)。試驗(yàn)期45 d，其中預(yù)試期15 d，正試期30 d。試驗(yàn)于2021年6月12日至2021年7月25日在西藏自治區(qū)山南市巴桑奶牛養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社(海拔3 700 m)進(jìn)行。

1.2 飼糧與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧為合作社固定飼糧，以精料混合料以及粗飼料形式(精∶粗=1∶9)分開(kāi)飼喂，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。試驗(yàn)?zāi)膛２捎盟ㄏ凳斤曫B(yǎng)，飼喂前將NCG與精料混合料預(yù)混合，然后與1/3粗飼料進(jìn)行混合飼喂，每天飼喂2次(07:00和18:00)，擠奶2次(06:30和17:00)，奶牛自由采食及飲水，剩料量控制在3%～5%，稱(chēng)取每日給料量和剩料量，用于計(jì)算DMI。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣品采集與檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 飼糧和糞便中養(yǎng)分含量

在正試期第28～30天，采用直腸取糞法連續(xù)收集2組奶牛糞樣6次，最后將每頭牛的糞樣均勻混合后取200 g左右，按照1/4糞重比例加入10%的酒石酸進(jìn)行固氮，用于測(cè)定糞中養(yǎng)分和酸不溶灰分(AIA)含量。將飼糧和糞便樣品置于65 ℃烘箱干燥72 h后，取出樣品自然回潮24 h，隨后將樣品放入105 ℃烘箱直至恒重，取200 g樣品粉碎后通過(guò)1 mm篩。飼糧和糞便中干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)和粗灰分含量分別按照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB 6438—2007方法進(jìn)行測(cè)定，鈣(Ca)含量按照GB/T 6436—2002的高錳酸鉀法進(jìn)行測(cè)定，磷(P)含量按照GB/T 6437—2002的分光光度法進(jìn)行測(cè)定，中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量分別按照GB/T 20806—2006和NY/T 1459—2007的方法進(jìn)行測(cè)定。參照Van Keulen等[14]提供的方法，利用糞和飼糧中的AIA做內(nèi)源指示劑，計(jì)算養(yǎng)分表觀(guān)消化率，計(jì)算公式如下:

養(yǎng)分表觀(guān)消化率(%)=100×[1-(Ad×Nf)/
(Af×Nd)]。

式中：Ad和Af分別為飼糧和糞中的AIA含量(g/kg)；Nd和Nf分別為飼糧和糞中某養(yǎng)分含量(g/kg)。

1.3.2 乳品質(zhì)

在正試期第30天，在擠奶時(shí)間點(diǎn)分別采集奶樣1次，將早、晚采集的奶樣按5∶5混合，取50 mL加重鉻酸鉀防腐劑混合均勻，樣品使用Milko Scan FT+200 76150型多功能乳成分分析儀(丹麥Foss Electric公司)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定指標(biāo)包括乳蛋白率、乳脂率、乳糖率及乳尿素氮、總固形物以及非脂乳固體含量，乳體細(xì)胞數(shù)量使用Fossomatic FC 79910體細(xì)胞分析儀(丹麥Foss Electric公司)測(cè)定。4%乳脂校正乳(FCM)產(chǎn)量計(jì)算公式[15]如下:

4%乳脂校正乳=M×(0.4+0.15F)。

式中：M為產(chǎn)奶量；F為乳脂率。

1.3.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

在正試期第30天，在試驗(yàn)?zāi)膛Ｎ购?和6 h，使用MDW-15型胃管式瘤胃液采樣器(中國(guó)上海硅狄科學(xué)儀器有限公司)通過(guò)奶?？谇徊杉鑫敢?。將采集的瘤胃液裝入10 mL離心管，使用UB-7型pH計(jì)(美國(guó)Denver Instrument公司)測(cè)定瘤胃液pH后，迅速放入-20 ℃冰箱保存，用于測(cè)定瘤胃液中氨態(tài)氮(NH3-N)含量。另取瘤胃液，4 ℃下15 000×g離心10 min，取上清液1.5 mL，加入0.15 mL 25%偏磷酸固定后置于-20 ℃冰箱保存，用于測(cè)定總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)及各揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量，瘤胃液中NH3-N和VFA含量分別參照Wang等[16]和Weatherburn等[17]方法測(cè)定。瘤胃液中微生物蛋白質(zhì)(MCP)含量使用紫外分光光度計(jì)(UV1901，波長(zhǎng)：260 nm)參照Z(yǔ)inn等[18]分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 血清生化與抗氧化指標(biāo)

在正試期第29～30天，連續(xù)2 d于晨飼前使用真空采血管進(jìn)行尾根靜脈采血10 mL，4 ℃下2 040×g離心15 min，取2 mL上層血清于離心管中，置于-20 ℃冰箱保存。

血清生化指標(biāo)：血清葡萄糖(GLU)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCHO)含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性采用CX-4型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman公司)測(cè)定，所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

血清抗氧化指標(biāo)：血清過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性分別采用相應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(中國(guó)江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)測(cè)定，測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)；血清丙二醛(MDA)含量和總抗氧化能力(T-AOC)采用北京盒子生工科技有限公司對(duì)應(yīng)試劑盒測(cè)定，測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)；活性氧(ROS)含量采用熒光探針DCFH-DA技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，所用試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3.5 血清抗高原反應(yīng)因子

血清促紅細(xì)胞生成素(EPO)、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、C型利鈉肽(CNP)含量和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、eNOS、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性分別使用相應(yīng)的ELISA試劑盒(中國(guó)江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)測(cè)定，測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)；血清NO含量采用北京盒子生工科技有限公司對(duì)應(yīng)試劑盒測(cè)定，測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步處理，使用SPSS 26.0軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異顯著性比較，P<0.05和0.05≤P<0.10分別表示具有顯著差異和差異趨勢(shì)，結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

2 結(jié) 果

2.1 DMI和養(yǎng)分表觀(guān)消化率

由表2可知，NCG組4% FCM和飼料轉(zhuǎn)化率比CON組分別提高39.35%和54.16%(P<0.05)，但NCG組和CON組DM、CP、EE、NDF、ADF表觀(guān)消化率以及DMI均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 NCG對(duì)奶牛DMI和養(yǎng)分表觀(guān)消化率的影響

2.2 泌乳性能

由表3可知，NCG組產(chǎn)奶量和乳總固形物含量顯著高于CON組(P<0.05)，CON組乳糖率相較于NCG組具有升高的趨勢(shì)(0.050.05)，但NCG組乳尿素氮含量相較于CON組降低19.61%，乳脂率相較于CON組提高8.53%。

2.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

由表4可知，與CON組相比，NCG組瘤胃液NH3-N含量降低38.11%(P<0.05)，同時(shí)MCP含量提高12.43%(P<0.05)，異戊酸含量顯著降低(P<0.05)，異丁酸含量具有降低的趨勢(shì)(P=0.07)，而乙酸/丙酸具有升高的趨勢(shì)(P=0.07)。2組試驗(yàn)?zāi)膛Ａ鑫敢篢VFA、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量以及pH均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 NCG對(duì)奶牛泌乳性能的影響

表4 NCG對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.4 血清生化指標(biāo)

由表5可知，與CON組相比，NCG組血清TCHO含量和ALT活性分別降低25.78%和15.62%(P<0.05)，TG含量顯著升高(P<0.05)，2組間血清GLU、ALB、UN含量和AST活性均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 NCG對(duì)奶牛血清生化指標(biāo)的影響

2.5 血清抗氧化指標(biāo)

由表6和圖1可知，與CON組相比，NCG組血清GSH-Px、SOD活性以及T-AOC顯著升高(P<0.05)，同時(shí)血清MDA含量顯著降低(P<0.05)，ROS含量顯著降低(P<0.05)，2組間血清CAT活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 NCG對(duì)奶牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

* 表示與CON組相比差異顯著(P<0.05)。

2.6 血清抗高原反應(yīng)因子

由表7可知，NCG組血清VEGF、NO含量以及eNOS、iNOS活性顯著高于CON組(P<0.05)，2組間血清EPO、HIF-1、ACE、ET-1和CNP含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 NCG對(duì)奶牛DMI和養(yǎng)分表觀(guān)消化率的影響

在海拔3 600 m左右的拉薩地區(qū)，大氣中氧分壓僅為海平面的60%，奶牛由于供氧不足導(dǎo)致心率增加，平均呼吸頻率和血氧飽和度低于健康水平，平均肺動(dòng)脈壓力陡增至健康水平近2倍，奶牛的生理機(jī)能面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)[1]。Qiao等[19]研究表明，高原地區(qū)的泌乳前期中國(guó)荷斯坦奶牛平均DMI為16.08 kg，而且DMI以及各養(yǎng)分消化率與低海拔地區(qū)奶牛相比無(wú)顯著差異。與此同時(shí)，任利圓[20]在平原地區(qū)飼喂奶牛不同劑量NCG發(fā)現(xiàn)，各養(yǎng)分表觀(guān)消化率相較對(duì)照組有所增加但差異不顯著。本試驗(yàn)中，2組奶牛DMI以及各養(yǎng)分表觀(guān)消化率無(wú)顯著差異，這可能是因?yàn)轱暭Z粗纖維水平較高，奶牛采食后瘤胃降解速率降低，容易產(chǎn)生飽腹感[21]。這些數(shù)據(jù)表明，奶牛對(duì)飼糧養(yǎng)分的消化吸收作用受海拔因素影響較小，并且在高纖維飼糧水平下，NCG對(duì)奶牛采食量無(wú)顯著增加效果。Cieslar等[22]研究發(fā)現(xiàn)，作為NCG代謝通路上的重要信號(hào)分子，NO可通過(guò)作用于環(huán)狀鳥(niǎo)苷酸促進(jìn)血管平滑肌松弛，增加奶牛乳腺血漿流量，促進(jìn)乳腺血管增生從而增加產(chǎn)奶量，推測(cè)為本試驗(yàn)中NCG組奶牛4% FCM顯著提升的原因之一，同時(shí)與下文中NCG提升奶牛泌乳性能的試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 NCG對(duì)奶牛泌乳性能的影響

高原環(huán)境中氧氣濃度低，而乳腺分泌乳汁能量需求較大，由此乳腺主要功能方式轉(zhuǎn)化為無(wú)氧呼吸，易誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞癌變和分化[23]，泌乳性能隨之受到影響。前人研究表明，荷斯坦奶牛在高原習(xí)服1年后，產(chǎn)奶量和乳蛋白率分別降低19.20%和4.22%，泌乳性能在低氧環(huán)境中受到抑制[24]。而董旭晟等[25]發(fā)現(xiàn)，在圍產(chǎn)期奶牛飼糧中添加NCG可分別提升4% FCM產(chǎn)量和乳蛋白率13.08%和6.46%以上，且圍產(chǎn)后期添加NCG的作用效果優(yōu)于圍產(chǎn)前期。本試驗(yàn)中，補(bǔ)充N(xiāo)CG提高了奶牛產(chǎn)奶量和總固形物含量，有效降低乳尿素氮含量，奶牛的氮素利用率得到改善，這可能是Arg參與機(jī)體氮素運(yùn)輸、儲(chǔ)存、排泄以及尿素循環(huán)的結(jié)果。在精氨酸酶的作用下，Arg轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)氨酸進(jìn)入線(xiàn)粒體促進(jìn)尿素循環(huán)，合成更多含氮化合物參與MCP以及乳蛋白合成[8]。同時(shí)NCG可提高奶牛血液中性粒細(xì)胞關(guān)鍵功能基因的表達(dá)，改善機(jī)體免疫系統(tǒng)的吞噬殺菌功能[11]，因此，本試驗(yàn)中NCG組牛乳中體細(xì)胞數(shù)量相較于CON組減少9.10%。除此之外，NCG可通過(guò)激活細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)的CPS-Ⅰ促進(jìn)氨甲酰磷酸合成，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步生成Arg及相關(guān)代謝產(chǎn)物，提升牛奶中Arg、脯氨酸和天冬氨酸含量[9]。丁洛陽(yáng)[26]研究表明，NCG可通過(guò)“Arg-鳥(niǎo)氨酸-腐胺”代謝途徑調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞合成酪蛋白。因此，后續(xù)試驗(yàn)可進(jìn)一步分析牛奶中各氨基酸以及蛋白質(zhì)組分，為提升高海拔地區(qū)奶牛的乳品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支撐。

表7 NCG對(duì)奶牛血清抗高原反應(yīng)因子含量的影響

3.3 NCG對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

研究表明，高海拔低氧環(huán)境會(huì)影響奶牛瘤胃微生物區(qū)系，降低瘤胃球菌屬和短桿真菌屬豐度，導(dǎo)致機(jī)體能量供應(yīng)不足以及抗炎癥作用減弱，加速奶牛高原病的產(chǎn)生[1]。瘤胃液pH是體現(xiàn)瘤胃內(nèi)發(fā)酵狀況的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)中，2組試驗(yàn)?zāi)膛Ａ鑫敢簆H均處于正常范圍(6.0～7.0)內(nèi)[27]，因此，在飼糧中添加NCG對(duì)奶牛瘤胃正常發(fā)酵無(wú)顯著影響。瘤胃微生物利用內(nèi)源和外源含氮物質(zhì)代謝產(chǎn)生的NH3-N是合成MCP的主要原料，瘤胃內(nèi)NH3-N以及MCP含量可反映微生物合成蛋白質(zhì)的效率[28]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加NCG可有效促進(jìn)奶牛尿素循環(huán)，顯著提升微生物利用NH3-N合成MCP的效率，并且滿(mǎn)足奶牛泌乳活動(dòng)的能量需求[29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NCG組奶牛瘤胃微生物對(duì)NH3-N的利用程度顯著高于CON組，這可能是因?yàn)镹CG促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞和十二指腸細(xì)胞吸收NH3-N，為合成MCP提供充足氮源，減少NH3-N降解導(dǎo)致的氮源損失[30]。

3.4 NCG對(duì)奶牛血清生化指標(biāo)的影響

作為血清中的主要脂類(lèi)物質(zhì)，TG和CHOL能夠反映機(jī)體吸收和代謝脂肪的狀況。血清GLU可促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖，增加酪蛋白和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白等基因表達(dá)量，改善乳腺上皮細(xì)胞對(duì)GLU的攝取能力[33]，健康動(dòng)物體內(nèi)GLU含量保持動(dòng)態(tài)平衡。姚琨[1]研究表明，患有高原病的奶牛體內(nèi)Lcat、Apoc4和Rbp4等脂類(lèi)、淀粉以及GLU代謝相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體糖酵解紊亂以及能量供應(yīng)不足。本試驗(yàn)中，NCG組奶牛的血清CHOL含量相較于CON組降低25.77%，同時(shí)GLU含量有所增加，這說(shuō)明補(bǔ)充N(xiāo)CG可促進(jìn)奶牛肝臟糖異生代謝過(guò)程，協(xié)助氨基酸代謝并且對(duì)預(yù)防代謝性酸中毒具有重要作用。

肝臟細(xì)胞內(nèi)ALT和AST貯存量較高，當(dāng)肝臟細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加導(dǎo)致ALT和AST釋放進(jìn)入血液，因此可作為肝臟功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)[34]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NCG組奶牛血清ALT顯著低于CON組，表明肝臟的生理功能得到改善，因此NCG對(duì)于高海拔低氧環(huán)境中奶牛的肝臟細(xì)胞具有良好的修復(fù)效果。白蛋白可穩(wěn)定體內(nèi)血漿滲透壓、協(xié)助運(yùn)輸代謝物質(zhì)，轉(zhuǎn)化為組織蛋白后可參與組織生長(zhǎng)以及受損組織修復(fù)。本試驗(yàn)中，2組試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ錋LB含量無(wú)顯著差異，結(jié)合DMI以及CP表觀(guān)消化率數(shù)據(jù)，說(shuō)明NCG對(duì)奶牛消化吸收飼糧蛋白質(zhì)無(wú)負(fù)面影響。

3.5 NCG對(duì)奶牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

Pena等[35]研究發(fā)現(xiàn)，低氧低壓可誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激，增加體內(nèi)ROS和MDA含量，并通過(guò)相關(guān)炎癥途徑誘發(fā)高原肺水腫和腦水腫等高原病，揭示了氧化應(yīng)激與高原病的相關(guān)性。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加NCG可顯著提升血清GSH-Px和SOD活性以及T-AOC，血清中MDA和ROS含量分別降低31.63%和12.99%，奶牛抗氧化能力得到增強(qiáng)，機(jī)體氧化代謝維持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。NCG進(jìn)入體內(nèi)后，可通過(guò)提升抗氧化基因表達(dá)以及核因子紅系2-相關(guān)因子2、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白等信號(hào)分子的含量，有效緩解脾臟氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)[36]。趙相洋等[37]研究表明，NCG可通過(guò)轉(zhuǎn)化成Arg抑制體內(nèi)脂質(zhì)氧化過(guò)程來(lái)降低MDA含量，同時(shí)下游產(chǎn)物NO也可中和血液中ROS，且飼糧中添加20 g/(頭·d)NCG對(duì)機(jī)體抗氧化能力的提升效果最為明顯。NCG組奶牛抗氧化性能得到提升，同時(shí)發(fā)生炎癥反應(yīng)以及高原病的概率降低，因此奶牛的泌乳性能和免疫性能得到保障，這與前人研究結(jié)果[10,29]一致。

3.6 NCG對(duì)奶牛血清抗高原反應(yīng)因子含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，高原病奶牛血液中鐵離子以及血細(xì)胞數(shù)含量顯著降低，機(jī)體氧氣輸送能力大幅減弱，并且血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)受損進(jìn)一步導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓和心臟衰竭等病變，難以適應(yīng)高海拔低氧環(huán)境[1-2]。NOS包含iNOS、eNOS和神經(jīng)型一氧化氮合成酶(nNOS)3種不同亞型，在NOS和四氫生物嘌呤的作用下，Arg代謝生成NO和瓜氨酸，NO可通過(guò)舒張血管平滑肌降低肺動(dòng)脈血管阻力[38]。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，患有肺動(dòng)脈高壓的奶牛eNOS活性降低進(jìn)而惡化病情，補(bǔ)充N(xiāo)CG可通過(guò)促進(jìn)eNOS和內(nèi)源性NO合成，降低奶牛平均肺動(dòng)脈壓力和外周收縮壓力，對(duì)預(yù)防低氧環(huán)境下奶牛的心血管損傷發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NCG組奶牛血清e(cuò)NOS、iNOS活性以及NO含量分別增加30.89%、31.45%和19.05%，說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)膛z取和轉(zhuǎn)運(yùn)NCG的能力未受到抑制，且NCG促進(jìn)eNOS和iNOS表達(dá)的同時(shí)增加血清中NO含量，有利于維護(hù)奶牛心血管完整性，緩解高原適應(yīng)癥，改善奶牛體況以及生產(chǎn)性能。

作為一種高效的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原和通透性因子，VEGF具有增強(qiáng)血管通透性、維持和重塑現(xiàn)有血管以及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等作用[39]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)充N(xiāo)CG可增加血清VEGF含量，促進(jìn)低氧環(huán)境下奶牛體內(nèi)新生毛細(xì)血管的形成，增強(qiáng)奶牛血液運(yùn)輸氧氣的能力。ET-1是動(dòng)物體內(nèi)具有收縮血管功能的生物活性多肽，主要在肺部發(fā)揮收縮血管、促進(jìn)腺體分泌和釋放炎性介質(zhì)等作用。本試驗(yàn)中，NCG組奶牛血清ET-1含量相比CON組增加12.25%，這可能是機(jī)體NO等舒張血管因子大量增加的原因?qū)е翬T-1含量代償性增加，有利于血管壓力保持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

4 結(jié) 論

高海拔低氧環(huán)境中，NCG可提升瘤胃微生物對(duì)NH3-N的利用效率，有效減少奶牛體內(nèi)氮源損失。同時(shí)，NCG可以維持機(jī)體GLU和脂質(zhì)代謝平衡，改善奶牛肝臟代謝以及氮素循環(huán)，提高機(jī)體抗氧化以及免疫性能，降低炎癥反應(yīng)和高原病的發(fā)生概率。在奶牛體內(nèi)，NCG可促進(jìn)eNOS、iNOS、NO和VEGF等抗高原反應(yīng)因子合成，不僅可通過(guò)促進(jìn)乳腺血管增生來(lái)增加奶牛產(chǎn)奶量，而且可以維持心血管通道完整性，對(duì)緩解奶牛高原適應(yīng)癥具有重要意義。