楊 蒙 沈宜釗 李 妍 王美美 張志宏 李秋鳳,4 曹玉鳳,4 李艷琴 李建國,4,5* 高艷霞,4,5*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，保定071001；3.河北樂源牧業(yè)有限公司，石家莊050000；4.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，保定071001；5.河北省乳制品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，石家莊050000)

哺乳犢牛機體發(fā)育不健全，容易發(fā)生多種疾病，從而影響其正常生長發(fā)育，嚴(yán)重者會造成終身發(fā)育受阻，甚至死亡[1]。哺乳期犢牛生長發(fā)育將決定奶牛的配種日齡甚至終生的生產(chǎn)性能[2-3]，因此，哺乳犢牛飼養(yǎng)管理是奶牛生產(chǎn)中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)?，F(xiàn)代集約化養(yǎng)殖模式下，犢牛容易發(fā)生氧化應(yīng)激，此時血液被重新分配，造成腸道血流量明顯減少[4]，而腸道黏膜組織對缺氧、缺血異常敏感，在短時間內(nèi)就會造成腸道黏膜功能損傷，使得腸道黏膜屏障發(fā)生破壞[5]，造成腸炎等胃腸道疾病，降低機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，嚴(yán)重時甚至?xí)斐蔂倥Ｋ劳鯷6]。5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)廣泛存在于地黃、黨參、山茱萸等中藥中，是其發(fā)揮藥理作用的重要成分。大鼠和小鼠上的研究表明，5-HMF有促采食、促生長及提高機體抗氧化能力的作用。李利芬[7]在大鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加5-HMF能夠提高采食量。給小鼠灌胃五味子中的活性成分5-HMF，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著降低小鼠肝臟中丙二醛(MDA)含量，提高過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性[8]。宋玉蓉等[9]研究也發(fā)現(xiàn)，添加5-HMF能夠顯著提高采食高脂飼糧小鼠血漿總抗氧化能力(T-AOC)，說明添加5-HMF可能對動物機體的氧化應(yīng)激有一定的緩解作用。而Jeong等[10]則發(fā)現(xiàn)，將富含5-HMF的地黃混合中草藥添加到生長豬飼糧中可以提高生長豬的日增重，說明5-HMF可能對動物生長發(fā)育有一定促進作用。此外，5-HMF的毒性很低，其半數(shù)致死量為小鼠口服1 910 mg/kg BW，大鼠口服3 100 mg/kg BW[11]。在動物試驗中顯示，即使添加量高達每天80～100 mg/kg BW也未觀察到急性和亞急性中毒癥狀[12]。因此，5-HMF可能有改善哺乳犢牛生長性能和提高其抗氧化能力的作用，然而相關(guān)研究未見報道。鑒于此，本試驗將通過動物試驗，研究不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、抗氧化能力及紅細(xì)胞功能的影響，以期篩選出5-HMF的適宜添加量，為犢牛的高效培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2021年4月至2021年6月在河北省樂源君享牧業(yè)威縣有限公司完成。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選取初生重相近、健康的中國荷斯坦母新生母犢牛60頭，采用完全隨機試驗設(shè)計，隨機分為4組，每組15頭。于2日齡開始在犢牛飼喂的牛乳中分別添加0(5-HMF0組)、1(5-HMF1組)、2(5-HMF2)、3 g/(d·頭)(5-HMF3組)的5-HMF產(chǎn)品，分早、晚2次添加。5-HMF產(chǎn)品購自某農(nóng)牧有限公司，5-HMF含量為10%。試驗期為56 d。

1.3 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

犢牛出生后2 h內(nèi)保證飼喂充足的初乳，初乳飼喂量保持一致，均為4 L/頭。2日齡后于每日07:30、17:30飼喂常乳。犢牛2～7日齡每頭每天飼喂常乳6 L，8～25日齡每頭每天飼喂常乳8 L，26～50日齡每頭每天飼喂常乳11 L，51～56日齡每頭每天飼喂常乳10 L，常乳經(jīng)巴氏消毒后飼喂。犢牛自由飲水。犢牛于3日齡開始自由采食顆粒型開食料，各組犢牛飼喂相同的開食料。開食料由石家莊博瑞正誠飼料有限公司提供。常乳和開食料營養(yǎng)水平見表1。

表1 常乳及開食料營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 開食料與糞便樣品的采集與處理

每2周采集1次開食料，-20 ℃冰箱保存，于試驗結(jié)束后混勻樣品并帶回實驗室，65 ℃烘干，粉碎分別過10、40目篩，待測。于試驗第54、55、56天連續(xù)采集糞便樣品3 d，采集糞便時飼喂新鮮常乳。每組隨機選擇8頭犢牛，通過直腸采糞法，每頭牛每天采集糞便樣品300 g，混勻后分成2份，一份65 ℃烘干，粉碎分別過10、40目篩，待測粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、粗灰分(Ash)、鈣(Ca)、磷(P)含量；另一份按每100 g糞便加10%的H2SO4進行處理，65 ℃烘干，粉碎分別過10、40目篩，待測粗蛋白質(zhì)(CP)含量。

1.4.2 血液樣品采集與處理

于犢牛飼喂初乳后48 h內(nèi)以及試驗第28、56天晨飼前，每組隨機選擇8頭犢牛，通過頸靜脈采集血液，用5 mL促凝管收集，室溫靜置30 min后，3 500×g離心15 min，分離血清，分裝于離心管中，存于-20 ℃冰箱中，待測。

1.5 樣品分析與測定

1.5.1 體重與體尺測定

犢牛出生當(dāng)天和試驗第56天晨飼前空腹稱重，計算平均日增重(ADG)，并進行體尺測量。體尺測量指標(biāo)包括體高、體斜長、胸圍、腹圍、管圍。體高為鬐甲最高處距水平地面的垂直高度，用測杖測量；體斜長為肩關(guān)節(jié)前端到坐骨結(jié)節(jié)的直線距離，用硬尺測量；胸圍是肩胛骨后角處體軀的垂直周徑，腹圍是后腿前部腹部的最大垂直周徑，管圍是左前肢最細(xì)處的水平周徑，均用卷尺測量。

1.5.2 采食量測定

準(zhǔn)確記錄每天每頭犢牛的牛乳飼喂量、開食料投喂量和剩料量，計算平均日采食量(ADFI)及料重比(F/G)。開食料投喂量根據(jù)前1天采食量設(shè)定，保證料槽中剩料不低于5%。

1.5.3 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率測定

開食料及糞便中CP、EE、Ash、Ca、P含量分別參照GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2002、GB/T 6437—2002測定，NDF和ADF含量參照Van Soest等[13]的方法測定。參考酸不溶灰分法(GB/T 23742—2009)測定營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，計算公式如下：

某營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=[(a/c-b/d)/
(a/c)]×100。

式中：a為飼糧中該營養(yǎng)物質(zhì)含量(%)；b為糞中該營養(yǎng)物質(zhì)的含量(%)；c為飼糧中酸不溶灰分含量(%)；d為糞中酸不溶灰分含量(%)。

1.5.4 血清指標(biāo)測定

用深圳邁瑞B(yǎng)S-420型全自動生化分析儀檢測血清葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)含量，檢測試劑為深圳邁瑞配套生化試劑盒。用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定血清免疫球蛋白G(IgG)、MDA、2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)含量及T-AOC與SOD、CAT、GSH-Px活性，試劑盒購自北京華悅昌生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計分析

犢牛ADG、F/G、體尺指標(biāo)、營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率數(shù)據(jù)用SAS 9.4軟件的MIXED模型進行分析，試驗處理為固定效應(yīng)，犢牛為隨機效應(yīng)，用Turkey法進行多重比較檢驗，用contrast語句對5-HMF添加量的線性、二次和三次效應(yīng)進行分析。將1日齡犢牛血清生化、免疫、抗氧化和紅細(xì)胞攜氧功能指標(biāo)數(shù)據(jù)作為協(xié)變量參與到MIXED模型中。試驗結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示差異有顯著趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛生長性能的影響

2.1.1 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛體重指標(biāo)的影響

由表2可知，添加5-HMF對犢牛56日齡體重和平均日采食量無顯著影響(P>0.05)，有提高ADG的趨勢(P=0.08)，且隨5-HMF添加量的增加，犢牛ADG呈現(xiàn)先升高后降低的二次曲線變化(P=0.02)，F(xiàn)/G呈現(xiàn)先降低后升高的二次曲線變化(P=0.04)。

2.1.2 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛體尺指標(biāo)的影響

由表3可知，1日齡時，各組犢牛的體高、體斜長、胸圍、腹圍、管圍均差異不顯著(P>0.05)。添加5-HMF對56日齡犢牛的體高、體斜長、胸圍、腹圍、管圍均無顯著影響(P>0.05)。

2.2 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表4可知，雖然添加5-HMF對哺乳犢牛DM、CP、EE、NDF、ADF、Ca和P的表觀消化率無顯著影響(P>0.05)，但添加5-HMF組犢牛除EE外的其他營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率均高于5-HMF0組。

表2 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛體重指標(biāo)的影響

表3 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛體尺指標(biāo)的影響

2.3 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛血清生化、免疫、抗氧化和紅細(xì)胞攜氧功能指標(biāo)的影響

2.3.1 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛血清生化及免疫指標(biāo)的影響

由表5可知，添加5-HMF對28、56日齡犢牛及全期血清GLU、ALB及GLB含量無顯著影響(P>0.05)。在犢牛28和56日齡時，添加5-HMF對血清TP含量有顯著影響的趨勢(P=0.07、P=0.08)。與5-HMF0組相比，5-HMF2組犢牛全期血清TP含量顯著升高(P<0.05)。添加5-HMF對28日齡犢牛血清UN含量無顯著影響(P>0.05)；與5-HMF0組相比，5-HMF2組56日齡犢牛血清UN含量顯著降低(P<0.05)；添加5-HMF對犢牛全期血清UN含量有顯著影響的趨勢(P=0.07)。添加5-HMF對56日齡犢牛血清IgG含量無顯著影響(P>0.05)，對28日齡犢牛血清IgG含量有顯著影響的趨勢(P=0.07)；與5-HMF0組相比，5-HMF2組犢牛全期血清IgG含量顯著升高(P<0.05)。

表4 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

表5 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛血清生化及免疫指標(biāo)的影響

5 Items Groups5-HMF05-HMF15-HMF25-HMF3SEMP P-value TreatmentLinearQuadraticCubicDay of age× Treatment×day of age28 28 days of age27.627.930.028.32.920.940.760.730.6756 56 days of age24.826.127.425.93.140.950.730.660.85 Overall26.227.028.727.12.180.880.650.580.680.270.97 UN/(mmol/L)1 1 day of age4.464.874.644.210.5070.830.670.420.8528 28 days of age4.234.154.014.150.3280.970.790.740.8156 56 days of age4.88a4.37ab3.56b4.51a0.3010.030.160.020.14 Overall4.564.263.784.330.2230.110.250.070.230.390.32G IgG/(g/L)1 1 day of age27.925.927.027.71.070.550.930.210.4828 28 days of age25.227.528.926.41.240.210.360.070.5856 56 days of age27.628.531.128.11.240.210.480.130.19 Overall26.4b28.0ab30.0a27.3b0.870.030.240.020.180.040.97

2.3.2 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表6可知，添加5-HMF對28日齡犢牛血清T-AOC無顯著影響(P>0.05)，但與5-HMF0相比，5-HMF2組56日齡犢牛血清T-AOC顯著升高(P<0.05)；此外，添加5-HMF對犢牛全期血清T-AOC有顯著影響的趨勢(P=0.05)。添加5-HMF對56日齡犢牛血清MDA含量無顯著影響(P>0.05)，但與5-HMF0組相比，5-HMF2組28日齡犢牛及全期血清MDA含量顯著降低(P<0.05)。添加5-HMF對56日齡犢牛血清GSH-Px活性無顯著影響(P>0.05)，但5-HMF0組28日齡犢牛及全期血清GSH-Px、CAT活性顯著低于其他3組(P<0.05)；此外，添加5-HMF對56日齡犢牛血清CAT活性有顯著影響的趨勢(P=0.08)。添加5-HMF對28、56日齡犢牛及全期血清SOD活性無顯著影響(P>0.05)。

2.3.3 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛血清紅細(xì)胞攜氧功能指標(biāo)的影響

由表7可知，添加5-HMF對28、56日齡犢牛及全期血清2，3-DPG含量無顯著影響(P>0.05)。與5-HMF0組相比，5-HMF1組28日齡犢牛血清EPO含量顯著降低(P<0.05)，5-HMF1組和5-HMF2組犢牛全期血清EPO含量顯著降低(P<0.05)；此外，添加5-HMF對56日齡犢牛血清EPO含量有顯著影響的趨勢(P=0.06)。

3 討 論

研究表明，5-HMF具有抗氧化、抗炎、抗缺氧等多種生物學(xué)功能[14]。5-HMF不在《飼料添加劑品種目錄》中，但其廣泛存在于多種中藥及中藥炮制品中，是中藥發(fā)揮其藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[15]，對動物具有安全性。

表6 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

3.1 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛生長性能的影響

犢牛生長發(fā)育直接影響奶牛的配種月齡及生產(chǎn)性能[2-3]，因此提高犢牛生長性能是奶牛培育的重要目標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然各組犢牛斷奶體重差異不大，但是隨著5-HMF添加量的增加，ADG二次升高，說明5-HMF可能有促進犢牛生長的作用，這與前人在豬[10]、牦牛[16]和鯉魚[17]上的研究結(jié)果一致。本研究中犢牛的ADG與F/G變化趨勢一致，因此ADG的提高可能是通過提高飼料效率實現(xiàn)的。前人在大鼠和豬上的研究都發(fā)現(xiàn)5-HMF有提高動物采食量的作用[7,10]，與本研究的結(jié)果一致。采食調(diào)節(jié)是一個非常復(fù)雜的過程，受多種因素調(diào)節(jié)，其中機體抗氧化能力是影響動物采食量的重要因素之一。王艷明[18]在圍產(chǎn)期奶牛上的研究發(fā)現(xiàn)，提高機體的抗氧化能力能提高奶牛的采食量，因此5-HMF提高犢牛采食量可能是通過提高犢?？寡趸芰崿F(xiàn)的。

表7 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛血清紅細(xì)胞攜氧功能指標(biāo)的影響

本試驗中，雖然添加5-HMF提高了犢牛的ADG，但是對犢牛的體尺指標(biāo)沒有顯著影響。犢牛的體型與其骨骼的生長發(fā)育有關(guān)，犢牛的體尺指標(biāo)不僅能夠反映犢牛各個部位及整體發(fā)育情況，還可以體現(xiàn)機體營養(yǎng)水平[19]。一般情況下，犢牛體尺的發(fā)育主要由遺傳因素決定[20]，當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)的攝入量能夠滿足機體的營養(yǎng)需要時，犢牛體尺一般差異不大[21]。本試驗中，犢牛自由采食開食料，保證了充足的營養(yǎng)攝入，因此體尺指標(biāo)無顯著變化可能與試驗?zāi)翀鰻倥５娘曫B(yǎng)水平較高有關(guān)。

3.2 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率能夠直接反映動物對飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用情況，是影響動物生長發(fā)育的重要因素。DM表觀消化率能夠反映動物機體對飼料的利用效果，犢牛胃腸道生長發(fā)育程度、采食量、飼糧組成、環(huán)境條件等是影響DM表觀消化率的主要因素[22-23]。本試驗中，各組犢牛DM表觀消化率差異不顯著，原因可能是各組犢牛的試驗飼糧和環(huán)境條件相同。CP表觀消化率能夠反映機體對飼糧中含氮營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用情況，NDF和ADF表觀消化率則是反映機體對飼糧中纖維消化利用情況的主要指標(biāo)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加5-HMF對哺乳犢牛的DM、CP、NDF、ADF表觀消化率無顯著影響，與犢牛飼料效率的提高結(jié)果不一致，這可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率數(shù)據(jù)是在犢牛56日齡時測定的，反映的是測定日的情況，而F/G為全期計算值，僅用56日齡當(dāng)天的結(jié)果可能無法全面反映犢牛整個試驗期的消化率。

3.3 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛血清生化及免疫指標(biāo)的影響

血清中的GLU含量能夠反映反芻動物機體能量平衡動態(tài)水平[25]。王麗華等[26]研究表明，即使?fàn)倥Ｓ休^高的ADG，其血清GLU含量也無顯著變化，與本試驗結(jié)果一致，這可能與動物機體復(fù)雜的血糖調(diào)節(jié)機制有關(guān)。王聰聰?shù)萚27]用5-HMF灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)血清TP含量升高，與本試驗結(jié)果一致。血清中TP含量升高表明機體蛋白質(zhì)的合成作用增強，在羔羊上的研究發(fā)現(xiàn)，較高的血清TP含量與生長性能升高有關(guān)，這可能是因為機體中氨基酸的脫羧基作用加強，促進了蛋白質(zhì)的消化吸收。本試驗中，添加5-HMF可提高犢牛血清TP含量，說明犢?？赡芾眠@部分蛋白質(zhì)用于肌肉合成，從而提高犢牛的ADG。血清UN含量是反映動物蛋白質(zhì)代謝的重要指標(biāo)，較低的UN含量往往意味著較高的蛋白質(zhì)利用效率[28]。本試驗中，添加5-HMF的犢牛血清UN含量降低，與王聰聰?shù)萚27]在小鼠上的試驗結(jié)果一致，說明添加5-HMF有提高犢牛蛋白質(zhì)利用率的作用。本試驗中，雖然添加5-HMF對CP表觀消化率無顯著影響，但使血清UN含量降低，且UN含量的變化規(guī)律與飼料效率的變化規(guī)律一致，意味著5-HMF提高犢牛的蛋白質(zhì)利用效率可能是提高飼料效率的原因之一。

谷巍等[29]用富含5-HMF的黨參灌胃免疫抑制小鼠，結(jié)果表明模型組小鼠血清中IgG含量顯著升高，與本試驗結(jié)果一致，說明5-HMF可能有提高犢牛免疫能力的作用。Liu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，血清MDA含量降低能夠提高小鼠血清中IgG含量，這可能是本試驗中犢牛血清IgG含量升高的原因。

3.4 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

機體抗氧化功能是反映動物健康狀況的重要指標(biāo)之一，機體過多的活性氧會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而造成組織損傷和機體炎癥。T-AOC由酶促和非酶促抗氧化防御體系共同組成，代表機體真正的抗氧化能力，MDA則是脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物之一。作為一種抗氧化酶，SOD能夠促進陰離子超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)，而CAT是清除機體內(nèi)H2O2的重要酶，GSH-Px則可防止自由基對磷脂膜、酶和其他重要分子的破壞[31]。在高脂飼糧中添加5-HMF能夠顯著降低小鼠血漿MDA含量，顯著提高T-AOC和CAT活性[9]。Li等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，給小鼠灌胃5-HMF能夠顯著降低小鼠肝臟中MDA含量，提高肝臟中CAT、SOD和GSH-Px活性，與本試驗結(jié)果一致。5-HMF能夠提高機體抗氧化能力可能與其結(jié)構(gòu)中的不飽和鍵有關(guān)，而抗氧化能力的提高能夠增強機體的抗應(yīng)激能力。王棟等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化能力較強的犢牛在斷奶期有更高的生長性能、飼料效率和較低的斷奶應(yīng)激，因此添加5-HMF可能有降低犢牛斷奶應(yīng)激的潛力。

3.5 不同添加量的5-HMF對哺乳犢牛血清紅細(xì)胞攜氧功能指標(biāo)的影響

血液中的2，3-DPG能夠與血紅蛋白結(jié)合，從而改變血紅蛋白構(gòu)象，導(dǎo)致其與氧的親和力下降[33]。研究表明，2，3-DPG含量升高是機體缺氧的代償反應(yīng)之一[34]。而EPO是一種由腎臟和肝臟產(chǎn)生的糖蛋白激素，能夠調(diào)節(jié)機體骨髓中紅細(xì)胞的產(chǎn)生[35]，當(dāng)機體感知到紅細(xì)胞中血紅蛋白攜氧能力下降或處于缺氧狀態(tài)時，其分泌量會升高，從而刺激機體產(chǎn)生更多的紅細(xì)胞來應(yīng)對缺氧狀態(tài)[36]。本試驗中，添加5-HMF使?fàn)倥Ｑ逯蠩PO含量降低，原因可能是5-HMF具有很高的紅細(xì)胞膜通透性，能通過穩(wěn)定血紅蛋白的R-態(tài)來增加血紅蛋白與氧的親和力[37]，從而提高血紅蛋白的攜氧能力。

4 結(jié) 論

本試驗中，每頭哺乳犢牛每天添加2 g 5-HMF產(chǎn)品(HMF含量為10%)對其平均日采食量、體尺指標(biāo)和營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率無顯著影響，但可以提高ADG和飼料效率，還能增強機體抗氧化和免疫能力。綜合分析，在本試驗條件下，哺乳犢牛的5-HMF適宜添加量為200 mg/(d·頭)。