趙慧穎 余詩強 賀李瑩 熊本海 王 慧* 蔣林樹*

(1.北京農(nóng)學院動物科學技術學院，奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

沙棘是胡頹子科、沙棘屬落葉性灌木，又稱醋柳果、酸刺等，具有耐旱、抗風沙和在鹽堿土地上生存的特性，因此在中國西北部常被用于沙漠綠化。同時沙棘也是一種藥食同源的植物，含有黃酮類、皂苷類、維生素、糖類和有機酸等多種功能性成分，具有抗氧化、抗應激、促生長、抗腫瘤、降血壓和降血脂等生理作用，其發(fā)揮作用的主要成分為黃酮類化合物[1-2]。沙棘黃酮還具有很強的體外抑菌作用，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等常見的病原菌都有抑制作用[3]。沙棘黃酮在人類生產(chǎn)生活中應用廣泛，并且其在綿羊、雞和豬上的應用已有報道[4-5]。有研究表明，沙棘黃酮可提高肉雞平均日增重，降低腹脂率[6]；提高斷奶仔豬血清中瘦素含量，有助于改善豬的胴體品質(zhì)[7]。在反芻動物方面，劉艷豐[8]在阿勒泰羊的飼糧中添加沙棘葉黃酮，發(fā)現(xiàn)其能顯著提高瘤胃揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的濃度，降低氨態(tài)氮(NH3-N)濃度，促進瘤胃代謝和微生物蛋白的合成，并提高其免疫性能。白齊昌等[9]通過體外產(chǎn)氣法研究表明，沙棘黃酮可以改善綿羊的體外發(fā)酵，提高干物質(zhì)降解率、有機物降解率和代謝能，添加水平過高會對纖維降解菌具有抑制作用，適宜添加水平為0.3%。目前，沙棘黃酮在反芻動物上多以羊為研究對象，并且大多進行體外試驗，無法真正反映出沙棘黃酮在動物體內(nèi)的作用效果。同時，在以往的研究中可知，黃酮對奶牛瘤胃發(fā)酵的改善及瘤胃微生物菌群的影響具有顯著效果[10-12]，而沙棘黃酮在奶牛上的應用卻鮮有文獻報道。本實驗室前期已探究了沙棘黃酮對奶牛生長性能、乳中生物活性成分、血清免疫指標的影響[13]，發(fā)現(xiàn)沙棘黃酮能夠提高奶牛產(chǎn)奶量和乳成分含量以及抗氧化能力。因此，本研究在前期研究的基礎上，進一步探討沙棘黃酮對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)、細菌菌群結構及代謝產(chǎn)物的影響，以期為今后沙棘黃酮在反芻動物上的相關研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用沙棘黃酮購自西安某科技有限公司，純度為40%，其他成分為沙棘多糖(20%)、灰分(20%)、粗蛋白質(zhì)(10%)、水分(3%)、其他(7%)。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

本試驗在北京奶牛中心延慶基地良種場進行，選擇產(chǎn)奶量[(35.5±3.6) kg/d]、泌乳日齡[(91.0±22.1) d]、胎次(1.3±0.5)相近的健康中國荷斯坦奶牛30頭，隨機分為3組，每組10頭，在飼喂全混合日糧(TMR)的基礎上，分別以口腔投喂方式飼喂0、60、100 g/(d·頭)的沙棘黃酮，依次標記為BC組、BL組和BM組(沙棘黃酮的添加量根據(jù)本實驗室前期對竹葉黃酮的研究經(jīng)驗及查閱沙棘黃酮的相關文獻[9,14-15]確定)。每組的試驗牛均單獨采用散欄帶臥床式飼養(yǎng)，每天07:00、13:00、18:00對奶牛進行投料，09:30、15:30、21:30進行擠奶。試驗期間奶牛自由采食，自由飲水，牛舍每天清掃、清糞。試驗期共計75 d，其中預試期15 d，正試期60 d?；A飼糧參照NRC(2001)奶牛飼養(yǎng)標準配制，以TMR形式飼喂，TMR組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 TMR組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

1.3 瘤胃液的采集

在正試期最后1天于晨飼前1 h使用口腔采液器采集瘤胃液。每頭奶牛采集200 mL瘤胃液，采集的前50 mL瘤胃液舍棄(避免奶牛口腔黏液和采液器中的殘留液體產(chǎn)生影響)，采集后立即用4層紗布過濾，測定pH，然后將濾液分裝到2 mL凍存管和10 mL離心管(按照瘤胃液體積與25%偏磷酸體積為10∶1的比例加入25%偏磷酸)。2 mL凍存管立即置于液氮中，于-80 ℃保存，用于測定瘤胃細菌菌群結構及代謝物含量；10 mL離心管置于-20 ℃冰箱中保存，用于測定NH3-N及VFA濃度。

1.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定

pH使用PHS-10型便攜式pH計測量。NH3-N濃度參照馮宗慈等[17]的比色法測定。使用安捷倫7890B氣相色譜儀檢測瘤胃中VFA的濃度，氣相色譜條件如下：硝基對苯二甲酸改性的聚乙二醇(DB-FFAP)填充柱，進樣量為2 μL，氮氣(N2)流速為30 mL/min，氫氣(H2)流速為40 mL/min，空氣流速為400 mL/min，總流量為54 mL/min，吹掃流量為3 mL/min，平均線速度為27.8 cm/s，分流比為50∶1，柱溫為180 ℃，檢測溫度為280 ℃，進樣口溫度為250 ℃。

1.5 瘤胃細菌多樣性的測定與分析

本實驗室前期研究結果表明，在飼糧中添加60 g/d的沙棘黃酮對生產(chǎn)性能的提高效果更佳[13]。因此，本研究只探究了0與60 g/d的沙棘黃酮對奶牛瘤胃細菌菌群及代謝物的影響。

瘤胃液在冰上解凍后使用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒進行DNA提取，使用PCR進行擴增(引物：V3～V4區(qū)域，338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，將特定的接頭序列拼接在目的DNA兩端，構建瘤胃微生物16S rRNA基因文庫?；贗llumina HiSeq雙端測序得到原始數(shù)據(jù)，經(jīng)堿基識別后轉(zhuǎn)為sequencedreads，結果以FASTQ(fq)格式保存。

將HiSeq測序得到的數(shù)據(jù)拼接(merge)成1條序列Tags，并對reads質(zhì)量和merge效果進行質(zhì)控過濾。具體步驟參照余詩強等[11]的方法進行分析。

1.6 瘤胃代謝產(chǎn)物的測定與分析

1.6.1 代謝物萃取及衍生化

瘤胃液室溫解凍后渦旋10 s混勻，取50 μL瘤胃液加入300 μL分析甲醇，渦旋3 min，12 000 r/min、4 ℃下離心10 min；取上清液200 μL，20 ℃下靜置30 min，12 000 r/min、4 ℃下離心3 min；取150 μL上清液用于上機分析。

1.6.2 代謝組學數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(UPLC)和四級桿飛行時間質(zhì)譜(AB SCIEX Triple TOF6600)。代謝物的定性定量分析使用三重四級桿質(zhì)譜的多反應監(jiān)測模式(MRM)完成，得到不同樣品的液相色譜數(shù)據(jù)，對所有代謝物的提取離子色譜峰的峰面積進行積分，并校正不同樣品中同一代謝物的色譜峰。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2021進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 25.0中one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，使用Duncan氏多重比較對組間差異進行分析，P≤0.05為差異顯著。16S rRNA高通量測序結果采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件中的獨立樣品t檢驗進行分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 沙棘黃酮對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表2可知，飼糧中添加沙棘黃酮對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃pH及NH3-N、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度均無顯著影響(P>0.05)。與BC組相比，BL組的乙酸濃度及乙酸/丙酸顯著升高(P<0.05)，但BL組及BM組的戊酸濃度顯著降低(P<0.05)。

2.2 沙棘黃酮對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃細菌菌群的影響

2.2.1 稀釋曲線及分類操作單元(OTU)的Venn圖分析

由圖1可以看出，隨著測量的樣本量的增加，稀釋曲線趨于平緩。由圖2可知，BC組和BL組泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃液中共含有8 399個OTU，2組共有5 933個OTU，BC組特有1 155個OTU，占總OTU的13.75%，BL組特有1 311個OTU，占總OTU的22.10%，2組之間OTU數(shù)目存在一定的差異，且BL組含有的OTU數(shù)目較多。

2.2.2 瘤胃細菌菌群的α多樣性指數(shù)分析

由表3可知，BL組的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)與BC組相比均無顯著差異(P>0.05)，與BC組相比，BL組的Simpson指數(shù)有下降的趨勢(P=0.06)，Coverage指數(shù)有上升的趨勢(P=0.09)。

2.2.3 瘤胃菌群結構分析

2.2.3.1 門水平分析

由圖3可知，BC組、BL組瘤胃液中共檢測出24個細菌菌門，其中擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetota)及Patescibacteria相對豐度>1%；擬桿菌門、厚壁菌門的相對豐度占比前2，為門水平上的優(yōu)勢菌門。與BC組相比，BL組的厚壁菌門、Patescibacteria相對豐度較高，其他菌門相對豐度較低，但差異均不顯著(P>0.05)。

表2 沙棘黃酮對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

橫坐標代表隨機抽取的測序數(shù)據(jù)量；縱坐標代表觀測到的物種數(shù)量。

2.2.3.2 屬水平分析

圖4可知，BC組、BL組瘤胃液中共檢測出334個細菌菌屬，其中18個菌屬的相對豐度>1%；普雷沃氏菌屬(Prevotella)、解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)和Muribaculaceae_norank的相對豐度占比前3，為屬水平上的優(yōu)勢菌屬。與BC組相比，BL組泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃液中擬桿目菌RF16菌群(Bacteroidales_RF16_group)、理研菌科_RC9_腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)的相對豐度顯著增加(P<0.05)，F(xiàn)082_norank的相對豐度有增加的趨勢(0.050.05)。

BC代表BC組；BL代表BL組。下圖同。

2.2.3.3 線性判別分析(LEFSE)

由圖5可知，豐佑菌目(Opitutales)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、紫紅球菌科(Puniceicoccaceae)、普雷沃氏菌屬_9(Prevotella_9)及菖苣屬(Psychrobium)這5種細菌在BC組中發(fā)揮重要作用；無膽甾原體目(Acholeplasmatales)、Ethanoligenenaceae、瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)、梭狀芽孢桿菌屬_vadinBB60_菌群(Clostridia_vadinBB60_group)、鞘氨醇桿菌科(Sphingobacteriaceae)、厭氧原體屬(Anaeroplasma)、理研菌科_RC9_腸道菌群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、理研菌科(Rikenellaceae)、膽質(zhì)菌科(Acholeplasmataceae)、擬桿菌目_RF16_菌群(Bacteroidales_RF16_group)、擬桿菌門_BD2_2(Bacteroidetes_BD2_2)、鞘氨桿菌屬(Sphingobacterium)、毛螺菌科_FCS020_菌群(Lachnospiraceae_FCS020_group)、鞘氨醇桿菌目(Sphingobacteriales)、噬糖厭氧產(chǎn)氫桿菌屬(Hydrogenoanaerobacterium)、毛螺菌科_FE2018_菌群(Lachnospiraceae_FE2018_group)、UCG-004、Allorhizobium_Neorhizobium_Pararhizobium_Rhizobium這18個細菌在BL組中發(fā)揮重要作用。

表3 沙棘黃酮對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃細菌多樣性指數(shù)的影響

Bacteroidota:擬桿菌門;Cyanobacteria:藍菌門;Desulfobacterota:脫硫桿菌門; Fibrobacterota:纖維桿菌門; Firmicutes:厚壁菌門; Others:其他; Proteobacteria:變形菌門; Spirochaetota:螺旋菌門; Unclassified:未分類序列。

2.3 沙棘黃酮對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃代謝物的影響

2.3.1 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

從圖6可以看出，BC組、BL組之間的分離是較好的，代表組間聚類差異顯著。

2.3.2 差異代謝產(chǎn)物分析

由表4可知，2組共篩選出25種差異代謝物。與BC組相比，BL組6種差異代謝物含量顯著下調(diào)(P<0.05)，包括(2S)-2-氨基-5-戊酮酸[(2S)-2-amino-5-oxopentanoic acid]、3-脫氫奎尼酸(3-dehydroquinic acid)、D-來蘇糖(D-lyxose)、磷酸高絲氨酸(o-phosphohomoserine)、5,6-二羥基-1,3-二烯-1-羧酸(5,6-dihydroxycyclohexa-1,3-diene-1-carboxylate)以及N-acetylpuromycin；19種差異代謝物含量顯著上調(diào)(P<0.05)，包括苯丙酮酸(phenylpyruvic acid)、鄰氨基苯甲酸(anthranilic acid)、巖白菜素(bergenin)、煙胺比林(nifenazone)、天竺葵色素(pelargonidin)、蘆丁(rutin)、7,8,4′-三羥基異黃酮(7,8,4′-trihydroxyisoflavone)、西阿尼醇(cianidanol)、順-3,4-白天竺葵甙元(cis-3,4-leucopelargonidin)、2-羥基-2,3-染料木素(2-hydroxy-2,3-dihydrogenistein)、(2S)-2-azaniumyl-3-[4-(3-methylbut-2-enyl)-1H-indol-3-yl]propanoate2-phenyl-1H-benzimidazole-5-sulfonic acid、大黃素(emodin)、2,3,7,9-tetrahydroxy-1-methyl-6H-benzo[c]chromen-6-one、2,6,7,4′-tetrahydroxyisoflavanone、2-[2-(1H-indol-3-yl)acetyl]amino]propanoate、香橙素(aromadendrin)、4-[(E)-2-carboxyethenyl]-2,6-dimethoxyphenolate及黃顏木素(fustin)。

[Eubacterium]coprostanoligenes group_norank:產(chǎn)糞甾醇真桿菌屬未分類群; [Eubacterium]ruminantium group:嚙齒真桿菌屬群; Anaeroplasma:厭氧枝原體屬; Anaerovibrio:厭氧弧菌屬; Bacteroidales RF16 group_norank:擬桿菌目RF16未分類菌群; Bacteroidales_norank:未分類擬桿菌目; Butyrivibrio:丁酸弧菌屬; Christensenellaceae R-7 group:克里斯滕森菌科R-7菌群; Clostridia UCG-014_norank:梭狀芽孢桿菌屬UCG-014未分類;Fibrobacter:絲狀桿菌屬; Lachnospiraceae_NK3A20_group:毛螺菌科_NK3A20_菌群; Lachnospiraceae_Unclassified:毛螺菌科_未分類序列; Others:其他; Prevotella:普雷沃氏菌屬; Prevotellaceae Ga6A1 group:普雷沃氏菌科Ga6A1菌群; Prevotellaceae UCG-001:普雷沃氏菌科UCG-001; Prevotellaceae UCG-003:普雷沃氏菌科UCG-003; Prevotellaceae UCG-004:普雷沃氏菌科UCG-004; Pseudobutyrivibrio:假丁酸弧菌屬; Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科_RC9_菌群; Ruminococcus:瘤胃球菌屬; Succiniclasticum:解琥珀酸菌屬; Succinivibrionaceae UCG-001:琥珀酸弧菌科UCG-001; Succinivibrionaceae UCG-002:琥珀酸弧菌科UCG-002; Treponema:密螺旋體屬; Unclassified:未分類序列; Veillonellaceae UCG-001:韋榮球菌科UCG-001。

2.3.3 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

從圖7、圖8可知，25種差異代謝物主要分布在與蛋白質(zhì)代謝、糖類代謝相關的9條代謝途徑上，其中代謝產(chǎn)物顯著富集在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑以及氨基酸生物合成途徑中。相比于其他代謝途徑，富集在上述2個代謝途徑上的差異代謝物相對較多，分別為3和5個。

3 討 論

3.1 沙棘黃酮對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

VFA包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和異戊酸等，是淀粉等碳水化合物在瘤胃內(nèi)發(fā)酵的終產(chǎn)物，也是反芻動物維持正常生命活動及生產(chǎn)所需的主要能量來源[18]。乙酸是動物合成脂肪的前體，也是合成乳脂的主要成分[19-20]。丙酸主要被轉(zhuǎn)移到肝臟通過糖異生作用生成葡萄糖，為葡萄糖合成提供80%～90%的原料[21]。戊酸與異戊酸、異丁酸等含4～5個碳原子的短鏈VFA稱為異位酸，異位酸可以提高瘤胃內(nèi)微生物蛋白的合成，抑制脲酶活性，增加非蛋白氮的利用，同時，還可以促進瘤胃內(nèi)乙酸的合成[22-24]。白齊昌等[9]通過體外產(chǎn)氣法研究沙棘黃酮對綿羊體外產(chǎn)氣、瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物菌群的影響，結果發(fā)現(xiàn)添加0.3%的沙棘黃酮顯著增加了乙酸和丙酸的濃度。此結果與本研究相似，添加60 g/d的沙棘黃酮使泌乳奶牛瘤胃內(nèi)乙酸濃度及乙酸/丙酸顯著升高，戊酸濃度顯著下降。這說明添加60 g/d的沙棘黃酮促進了瘤胃微生物中有益菌的生長，促進乙酸生成菌的繁殖與代謝，有助于其對碳水化合物的發(fā)酵與分解，進而促進泌乳奶牛對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝與吸收；并且沙棘黃酮并沒有改變奶牛的發(fā)酵類型，奶牛仍是乙酸型發(fā)酵，甚至使乙酸生成量升高，在后續(xù)的研究中可知沙棘黃酮可促進奶牛瘤胃內(nèi)能生成乙酸的纖維素分解菌生長，并促進氨基酸代謝。而對于某些纖維素分解菌來講氨是唯一合成自身蛋白質(zhì)的氮源[25]。這說明沙棘黃酮有利于瘤胃內(nèi)產(chǎn)生乙酸的纖維素分解菌的生長，進而使乙酸生成增加。同時作為異位酸的戊酸含量下降、乙酸含量升高，也可進一步推測沙棘黃酮可促進異位酸向乙酸轉(zhuǎn)化，乙酸可進一步轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A作為脂肪酸合成的前體參與合成脂肪酸，乙酸的增加可為乳脂的合成提供前體物質(zhì)。

Opitutales:豐佑菌目; Shewanellaceae:希瓦氏菌科; Puniceicoccaceae:紫紅球菌科; Prevotella_9:普雷沃氏菌屬_9; Psychrobium:菖苣屬; Acholeplasmatales:無膽甾原體目; Ruminiclostridium:瘤胃梭菌屬; Clostridia_vadinBB60_group:梭狀芽孢桿菌_vadinBB60_菌群; Sphingobacteriaceae:鞘氨醇桿菌科; Anaeroplasma:厭氧原體屬; Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科_RC9_腸道菌群; Rikenellaceae:理研菌科; Bacteroidales_RF16_group:擬桿菌目_RF16_菌群; Bacteroidetes_BD2_2:擬桿菌門_BD2_2; Sphingobacterium:鞘氨桿菌屬; Lachnospiraceae_FCS020_group:毛螺菌科_FCS020_菌群; Sphingobacteriales:鞘氨醇桿菌目; Hydrogenoanaerobacterium:噬糖厭氧產(chǎn)氫桿菌屬; Lachnospiraceae_FE2018_group:毛螺菌科_FE2018_菌群; Acholeplasmataceae:膽質(zhì)菌科。

3.2 沙棘黃酮對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃細菌菌群的影響

反芻動物瘤胃內(nèi)的微生物復雜多樣，包括細菌、古菌、真菌、原蟲以及少量噬菌體，這些微生物可以幫助宿主消化和同化食物，為宿主提供能量和營養(yǎng)，與動物機體存在著共生關系[26-27]。本研究以泌乳中期荷斯坦奶牛為研究對象，利用16S rRNA高通量測序技術探討飼糧中添加沙棘黃酮對奶牛瘤胃細菌多樣性的影響。本研究中樣本覆蓋率高達98%，且稀釋曲線趨于平緩，說明樣本量充足能夠真實地反映泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃細菌的種類和多樣性。α多樣性指數(shù)分析表明，BL組Simpson指數(shù)有降低的趨勢，其他指數(shù)均無顯著變化，說明飼糧添加60 g/d的沙棘黃酮可使瘤胃內(nèi)細菌多樣性增加，而對其豐富度無顯著影響。研究表明，黃酮類化合物具有抑菌活性，能夠抑制一些對動物有害的細菌、真菌等[10,28]。瘤胃細菌多樣性增加可能是因為沙棘黃酮可以抑制一些病原菌生長，從而使一些與其競爭、拮抗的細菌數(shù)量增加。

前人研究表明，瘤胃細菌主要由擬桿菌門和厚壁菌門2個門組成，它們共同構成了瘤胃內(nèi)容物中約90%的16S rRNA基因豐度，且不會隨品種、飼糧和飼養(yǎng)環(huán)境的改變而改變[29]。本研究中泌乳中期荷斯坦奶牛的優(yōu)勢菌門也為擬桿菌門和厚壁菌門。擬桿菌主要通過分泌碳水化合物反應酶來分解飼糧中的碳水化合物，但對纖維素不起作用[30]。而厚壁菌門主要起到降解纖維素的作用[31]。本研究中，與BC組相比，BL組厚壁菌門的相對豐度較高。Zhan等[32]的研究表明，在初產(chǎn)荷斯坦母牛的飼糧中添加苜蓿黃酮提取物可以改變瘤胃微生物組成，使擬桿菌門相對豐度降低，厚壁菌門相對豐度升高，但差異不顯著，此結果與本研究相似。De Nardi等[33]飼喂100 g/d的多酚精油(主要成分為黃酮)給荷斯坦奶牛，增加了厚壁菌門和擬桿菌門的豐富度，說明黃酮可在一定程度上促進厚壁菌的生長與增殖，進一步促進瘤胃內(nèi)纖維素的降解，提升荷斯坦奶牛對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收功能。本試驗中添加沙棘黃酮后，瘤胃中厚壁菌門和擬桿菌門等優(yōu)勢菌門的豐富度并沒有顯著變化，說明沙棘黃酮對瘤胃菌群無不良影響。

橫坐標表示預測成分得分值，橫坐標方向可以看出組間的差距；縱坐標表示正交成分得分值，縱坐標方向可以看出組內(nèi)的差距；百分比表示成分對數(shù)據(jù)集的解釋度。

從屬水平上分析，本次研究2組的優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬，這與前人研究結果[34-36]一致。普雷沃氏菌屬主要代謝瘤胃中的半纖維素、果膠、蛋白質(zhì)等，主要產(chǎn)生乙酸、甲酸等[37]。本研究中，BL組較BC組的普雷沃氏菌屬、解琥珀酸菌屬的相對豐度有所下降，可能是由于厚壁菌門的相對豐度升高，厚壁菌門中纖維降解菌的相對豐度升高抑制了普雷沃氏菌的生長。有研究表明，解琥珀酸菌屬中的產(chǎn)琥珀酸桿菌相對豐度與乙酸的生成呈負相關與戊酸的生成呈正相關[38]。與本試驗的研究結果一致，產(chǎn)琥珀酸菌相對豐度的下降使乙酸的生成增加，戊酸的生成減少。毛螺菌科_FE2018_菌群、毛螺菌科_FCS020_菌群和Tuzzerella 3個菌屬同屬于毛螺菌科厚壁菌門，均為BL組中發(fā)揮重要作用的菌群，能夠降解多糖、纖維生成乙酸[39]。并且與BC組相比，BL組的泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃細菌中氫氧桿菌屬、瘤胃梭菌屬及理研菌科_RC9_腸道菌群的相對豐度顯著增加。研究表明，理研菌科主要在降解纖維多糖方面發(fā)揮作用，瘤胃梭菌屬也具有降解纖維素的功能，二者均能生成乙酸，而氫氧桿菌屬也具有降解葡萄糖生成乙酸的功能[40-43]。占今舜[10]在奶牛飼糧中添加苜蓿黃酮，發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌屬、琥珀酸菌屬的相對豐度隨著苜蓿黃酮添加量的升高呈線性下降趨勢，該結果與本研究相似。這說明沙棘黃酮可以提高瘤胃內(nèi)細菌的豐富度和多樣性，并且通過提高瘤胃內(nèi)纖維降解菌的相對豐度，提高乙酸的濃度，進而提高乳脂率。

表4 差異代謝物

4ItemsVIP2) Fold change Type Nifenazone3.1311 067.32up2,3,7,9-tetrahydroxy-1-methyl-6H-benzo[c]chromen-6-one3.1349 084.33up7,8,4′-trihydroxyisoflavone1.902.36up Aromadendrin2.9716.99up Cianidanol2.7215.94up-3,4- cis-3,4-leucopelargonidin2.8012.63up Fustin1.0520.85up Pelargonidin2.9816.87up Rutin1.016.94up2,6,7,4′-tetrahydroxyisoflavanone2.9116.30up2--2,3- 2-hydroxy-2,3-dihydrogenistein1.0622.09upN-acetylpuromycin2.100.43down5,6--1,3--1-5,6-dihydroxycyclohexa-1,3-diene-1-carboxylate1.030.32down(2S)-2-azaniumyl-3-[4-(3-methylbut-2-enyl)-1H-indol-3-yl]propanoate3.0171.69up2-[2-(1H-indol-3-yl)acetyl]amino]propanoate2.8727.77up4-[(E)-2-carboxyethenyl]-2,6-dimethoxyphenolate3.139 216.32up

Tryptophan metabolism:色氨酸代謝; Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成; Phenylalanine metabolism:苯丙氨酸代謝; Pentose and glucuronate interconversions:戊糖和葡糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化; Metabolic pathways:代謝途徑; Glycine serine and threonine metabolism:甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝; Biosynthesis of amino acids:氨基酸的生物合成; Arginine and proline metabolism:精氨酸和脯氨酸代謝; 2-oxocarboxylic acid metabolism:2-氧代羧酸代謝。下圖同 the same as below。

橫坐標表示每個通路對應的Rich factor，縱坐標為通路名稱，點的顏色為P值，越紅表示富集越顯著。點的大小代表富集到的差異代謝物的個數(shù)多少。

3.3 沙棘黃酮對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃代謝物的影響

相對于一些傳統(tǒng)的研究方法，代謝組學可以通過核磁共振、液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)等高通量技術更加清晰直觀地檢測到機體代謝物和代謝通路的變化[44]。與BC組相比，BL組的泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃中6種差異代謝物含量顯著下調(diào)，19種差異代謝物含量顯著上調(diào)。對上述25種差異代謝物進行KEGG富集分析，結果表明，25種代謝物分別分布在9條代謝通路上，代謝物顯著富集的通路有2條，分別是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路、氨基酸的生物合成通路。

與氨基酸代謝相關的通路中共檢測到5種代謝產(chǎn)物，其中2種代謝物在BL組中峰值更高，分別是苯丙酮酸以及鄰氨基苯甲酸；剩余3種代謝物在BC組的峰值更高，分別是谷氨酰胺、3-脫氫奎尼酸以及高絲氨酸鄰磷酸。芳香族氨基酸是高等動物所必需的，通常在細菌和植物中通過莽草酸途徑由葡萄糖合成[45]。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，在蛋白質(zhì)生產(chǎn)和糖原合成等過程中都發(fā)揮著重要的作用[46]。苯丙氨酸為生糖生酮氨基酸，主要通過不可逆的羥基化反應生成酪氨酸，還可通過轉(zhuǎn)氨基作用先生成對羥基苯乙酸之后再生成苯丙酮酸，苯丙酮酸可以轉(zhuǎn)化為富馬酸鹽進入三羧酸循環(huán)供能，若生成過多則會損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)或出現(xiàn)苯丙酮尿癥[47]。

3-脫氫奎尼酸、谷氨酰胺和鄰氨基苯甲酸均為莽草酸代謝途徑的中間產(chǎn)物，在微生物合成芳香族氨基酸過程中發(fā)揮著重要作用[48]。首先，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤蘚糖-4-磷酸發(fā)生縮合作用生成3-脫氫奎尼酸，之后轉(zhuǎn)化為莽草酸，再與PEP結合生成分支酸，一部分分支酸在羧甲基變位酶(CM)的催化下轉(zhuǎn)化為預苯酸，另一部分則經(jīng)脫羧、脫水、脫羥基等過程生成苯丙氨酸、酪氨酸等氨基酸。預苯酸可被鄰氨基苯甲酸合成酶(AS)催化生成谷氨酰胺后轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸，之后進一步生成色氨酸[49]。本研究中觀察到3-脫氫奎尼酸和谷氨酰胺的生成下調(diào)，苯丙酮酸和鄰氨基苯甲酸的生成上調(diào)，說明沙棘黃酮對芳香族氨基酸的代謝過程具有調(diào)節(jié)作用。苯丙酮酸含量適當上調(diào)有助于能量的生成，而鄰氨基苯甲酸含量上調(diào)有助于色氨酸的生成，進而有助于動物性蛋白質(zhì)的補充，有利于奶牛對蛋白質(zhì)的吸收利用。

4 結 論

本研究表明，在泌乳中期荷斯坦奶牛飼糧中添加60 g/(d·頭)沙棘黃酮提高了乙酸濃度和乙酸/丙酸，降低了戊酸濃度，提高了奶牛瘤胃中擬桿菌目RF16菌群、理研菌科_RC9_腸道菌群、瘤胃梭菌屬的相對豐度，同時提高了泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃中與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路相關的代謝物含量，為脂質(zhì)的合成提供了更多的前體物。