李金燕 聶存喜 南珊珊 ?？←?李佳橙

(石河子大學動物科技學院，石河子832000)

硫辛酸是一種類維生素物質(zhì)，兼具脂溶性和水溶性特性，可清除引起慢性疾病和衰老的自由基和活性氧，增強生物體腸道內(nèi)消化酶活性，調(diào)節(jié)腸道菌群，進而維持腸道健康狀態(tài)，起到促進動物健康生長的作用[1]。研究表明，飼糧中添加硫辛酸后可在一定程度上增強肉雞抗氧化能力，并可提高其免疫功能[2]。El-Senousey等[3]研究發(fā)現(xiàn)，與維生素C和維生素E相比，肉雞飼糧中添加500 mg/kg硫辛酸具有更好的抵抗地塞米松誘導的氧化應激的效果。楊國宇等[4]在肉雞飼糧中添加0、20、60和100 mg/kg硫辛酸的研究表明，60和100 mg/kg的添加量可以降低肉雞肝臟中脂肪及血液中甘油三酯和總膽固醇含量。Hamano等[5]研究了飼喂50 mg/kg硫辛酸對肉雞翅靜脈注射異丙腎上腺素的代謝響應，結果表明硫辛酸可降低其血漿中總膽固醇的含量，在維持血漿葡萄糖含量正常的情況下，促進肉雞脂肪酸動員。有研究報道，硫辛酸能夠有效清除生物體內(nèi)的活性氧自由基，讓生物體內(nèi)肝臟抗氧化酶活性獲得提升，同時還能夠顯著降低肝臟中鎘的含量，避免肝臟脂肪出現(xiàn)大量累積，讓肝臟擁有更強的解毒能力[6]。在肉雞飼糧中添加硫辛酸的最新研究表明，400～1 200 mg/kg硫辛酸可以改善肉品質(zhì)[7]，400和800 mg/kg均可改善肉雞生長性能和胴體性狀且二者無顯著差異[8]。

不過，硫辛酸對肉雞生長性能、屠宰性能、脂肪代謝和腸道菌群的系統(tǒng)研究未見報道，尤其是從腸道菌群的角度解析硫辛酸對肉雞生產(chǎn)的調(diào)控作用還屬于空白?；诖?，本文以白羽肉雞為試驗對象，研究飼糧添加硫辛酸對肉雞的應用效果，以期從腸道微生物角度探究硫辛酸對肉雞生產(chǎn)的代謝響應，為硫辛酸的合理利用和以腸道健康為靶點的肉雞健康養(yǎng)殖提供理論和生產(chǎn)指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用硫辛酸購自江蘇某生物技術有限公司，純度為99%；所用玉米、豆粕等飼料原料均購自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2 試驗設計和飼養(yǎng)管理

試驗選取14日齡體重相近、健康的白羽肉雞128只，隨機分為2個組，即對照組和試驗組，每組4個重復，每個重復16只雞。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組飼喂在基礎飼糧的基礎上添加400 mg/kg硫辛酸的飼糧。肉雞基礎飼糧參考NRC(1994)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗期28 d，期間肉雞自由采食和飲水，并按照標準免疫流程完成疫苗接種工作。

1 Items Content Nutrient levels2) ME/(MJ/kg)12.85 CP19.43 Ca1.06 TP0.65 Lys1.02 Met0.38 Thr0.70

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長性能

在試驗開始和試驗結束時，以重復為單位，在肉雞空腹的狀態(tài)下稱重，每日記錄肉雞采食量和健康狀況。分別計算15～28日齡和29～42日齡肉雞的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 屠宰性能

分別于肉雞28和42日齡，從每個重復中隨機抽取體重相近的2只雞，即每組8只雞，2組共計16只雞進行屠宰性能測定。屠宰性能指標的測定根據(jù)家禽的生產(chǎn)性能評價統(tǒng)計方法[9]進行，包括肉雞的屠宰率、全凈膛率、半凈膛率、胸肌率、腿肌率、腹脂率以及肝臟重等相關指標。皮下脂肪厚度測定是將尾椎結合處橫向切開，再從背正中線縱向切一刀，用游標卡尺測量交叉處的脂肪厚度，每只雞重復測量3次，取平均值，單位用mm表示。

1.3.3 脂肪代謝相關指標

分別于肉雞28和42日齡，從每個重復中隨機抽取體重相近的2只雞，即每組8只雞，2組共計16只雞進行脂肪代謝相關指標測定。頸靜脈采血5 mL，在室溫中放置30 min后，3 000 r/min離心15 min制備血清，置于-20 ℃保存。屠宰放血后采集胸肌、腿肌樣品各5 g，剔去肉眼可見的表面脂肪與筋膜，迅速分裝樣品并編號置于自封塑料袋中，將胸肌、腿肌剪碎，置于培養(yǎng)皿中，65 ℃烘至恒重，粉碎，即制備成胸肌、腿肌風干樣。肉雞血清、胸肌和腿肌中總膽固醇和甘油三酯的含量采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行測定，測定方法參照試劑盒說明書進行。

1.3.4 腸道菌群

分別于肉雞28和42日齡，進行屠宰性能測定時收集肉雞盲腸內(nèi)容物于凍存管中，液氮冷凍后，置于-80 ℃保存待測。提取盲腸內(nèi)容物微生物總DNA，以總DNA為模板，采用通用引物(338F，5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；806R，5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA V3～V4區(qū)進行PCR擴增，然后在HiSeq 2500高通量測序平臺進行16S rDNA高通量測序分析，檢測工作委托上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2019對肉雞生長性能、屠宰性能以及脂肪代謝相關指標等數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗，結果采用“平均值±標準差”的方式表示，以P<0.05為差異顯著性水平。

腸道菌群測序原始數(shù)據(jù)下機后，首先采用QIIME 1.9.1軟件進行數(shù)據(jù)質(zhì)控，通過序列拼接、過濾和去嵌合體后得到優(yōu)化序列，利用USEARCH 7.0軟件將優(yōu)質(zhì)序列進行操作分類單元(OTU)聚類分析，序列相似性閾值為97%；參考SILVA 128數(shù)據(jù)庫利用RDP Classifier 2.11軟件貝葉斯算法進行OTU序列分類學分析，并按照界、門、綱、目、科、屬、種的分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成；利用R語言完成糞便菌群門主坐標分析(PCoA)的數(shù)據(jù)分析工作，之后使用STAMP 2.1.3軟件實現(xiàn)數(shù)據(jù)的可視化展示；利用Mothur 1.30.2數(shù)據(jù)處理軟件計算α多樣性指數(shù)，其中主要包含Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)。

2 結果與分析

2.1 飼糧添加硫辛酸對肉雞生長性能的影響

由表2可知，在整個試驗期不同階段，與對照組相比，飼糧添加硫辛酸對肉雞ADG、ADFI和F/G均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。但與對照組相比，試驗組肉雞15～28日齡的ADFI降低了6.61%，F(xiàn)/G降低了3.78%；29～42日齡的ADFI提高了1.20%，F(xiàn)/G提高了4.23%。

表2 飼糧添加硫辛酸對肉雞生長性能的影響

2.2 飼糧添加硫辛酸對肉雞屠宰性能的影響

由表3可知，28日齡，試驗組肉雞屠宰率較對照組顯著提高了0.81%(P<0.05)；42日齡，試驗組全凈膛率較對照組顯著降低了0.83%(P<0.05)，胸肌率較對照組顯著提高了9.34%(P<0.05)；28和42日齡，與對照組相比，飼糧添加硫辛酸對肉雞半凈膛率、腿肌率、腹脂率、皮下脂肪厚度和肝臟重均無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧添加硫辛酸對肉雞屠宰性能的影響

2.3 飼糧添加硫辛酸對肉雞脂肪代謝相關指標的影響

由表4可知，28日齡，試驗組肉雞血清總膽固醇含量較對照組顯著提高了19.78%(P<0.05)；試驗組和對照組腿肌、胸肌總膽固醇含量之間均無顯著性差異(P>0.05)。42日齡，試驗組腿肌總膽固醇含量較對照組顯著降低了47.62%(P<0.05)，而胸肌總膽固醇含量較對照組顯著提高了33.33%(P<0.05)；與對照組相比，試驗組血清總膽固醇含量降低了5.25%，但差異不顯著(P>0.05)。

28日齡，與對照組相比，試驗組肉雞血清、腿肌和胸肌甘油三酯含量均無顯著性差異(P>0.05)。42日齡，試驗組腿肌甘油三酯含量較對照組顯著降低了14.94%(P<0.05)，而胸肌甘油三酯含量較對照組顯著提高了24.05%(P<0.05)；與對照組相比，試驗組血清甘油三酯含量降低了3.57%，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 飼糧添加硫辛酸對肉雞脂肪代謝相關指標的影響

2.4 飼糧添加硫辛酸對肉雞腸道菌群的影響

2.4.1 肉雞腸道菌群OTU分析

通過維恩(Venn)圖可以清晰地展示出組間樣本存在的獨有以及特有的OTU數(shù)，這樣能夠客觀地評價生物體內(nèi)微生物群落相似度。由圖1-A可知，28日齡，肉雞盲腸共鑒定出1 529個OTU，其中對照組和試驗組共有OTU 812個，占53.11%；由圖1-B可知，42日齡，肉雞盲腸共鑒定出1 726個OTU，其中對照組和試驗組共有OTU 860個，占49.83%。

2.4.2 肉雞腸道菌群α多樣性分析

微生物群落的豐富度和多樣性可以通過α多樣性分析來表示。由表5可知，各組的Coverage指數(shù)均在1左右，說明測序數(shù)據(jù)約覆蓋100%的微生物，覆蓋度較好。28日齡，與對照組相比，試驗組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別顯著提高了27.15%和20.55%(P<0.05)；42日齡，與對照組相比，試驗組α多樣性指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。

N-C-28和N-C-42分別表示對照組28和42日齡，N-L-28和N-L-42分別表示試驗組28和42日齡。下圖同。

表5 飼糧添加硫辛酸對肉雞腸道菌群α多樣性的影響

2.4.3 肉雞腸道菌群差異分析

為了便于觀察各組之間的腸道菌群差異，應用非度量多維尺度(NMDS)圖對各組糞便微生物群落進行測試。圖2中每個點代表1個樣本，利用樣品點之間的距離來評判個體以及群體兩者存在的不同和差異性，其距離越小，則表明微生物群落具有更強的相似性。由圖2可知，28和42日齡，對照組和試驗組各樣品之間均可區(qū)分開來，表明組間微生物群落組成差異明顯。

2.4.4 肉雞腸道菌群在門水平上的組成

由圖3可知，28日齡，對照組和試驗組在門水平上的優(yōu)勢菌群為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)；42日齡，對照組和試驗組在門水平上的優(yōu)勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)和變形菌門。

2.4.5 肉雞腸道菌群在屬水平上的組成

由圖4可知，28日齡，對照組和試驗組在屬水平上的優(yōu)勢菌群均為理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃球菌科UCG_014(Ruminococcaceae_UCG_014)和考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)；42日齡，對照組和試驗組在屬水平上的優(yōu)勢菌群均為擬桿菌屬、理研菌科RC9腸道群、考拉桿菌屬和瘤胃球菌科UCG_014。

NMDS:非度量多維尺度 non-metric multidimensional scaling。

圖3 肉雞腸道菌群在門水平上的組成

圖4 肉雞腸道菌群在屬水平上的組成

2.4.6 肉雞腸道菌群在屬水平上的差異

由圖5可知，28日齡，對照組和試驗組在屬水平上的差異菌群為不可培養(yǎng)菌(uncultured)、Shuttleworthia、腸球菌屬(Enterococcus)、理研菌屬(Rikenella)、薩特氏菌屬(Sutterella)、Tyzzerella和Harryflintia；其中，與對照組相比，試驗組中不可培養(yǎng)菌、Shuttleworthia、腸球菌屬和理研菌屬的相對豐度顯著升高(P<0.05)，薩特氏菌屬、Tyzzerella、Harryflintia的相對豐度顯著降低(P<0.05)。42日齡，對照組和試驗組在屬水平上的差異菌群為脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、丁酸球菌屬(Butyricicoccus)和Dielma；其中，與對照組相比，試驗組中脫硫弧菌屬和Dielma的相對豐度顯著升高(P<0.05)，丁酸球菌屬的相對豐度顯著降低(P<0.05)。

圖5 肉雞腸道菌群在屬水平上的差異

2.4.7 肉雞脂肪代謝相關指標與腸道菌群的相關性分析

由圖6可知，肉雞胸肌甘油三酯含量與薩特氏菌屬、脫硫弧菌屬和Dielma呈極顯著正相關(P<0.01)；胸肌總膽固醇含量與不可培養(yǎng)菌呈極顯著正相關(P<0.01)，而與丁酸球菌屬呈顯著負相關(P<0.05)。肉雞腿肌甘油三酯含量與Shuttleworthia呈顯著正相關(P<0.05)，與理研菌屬和Harryflintia呈顯著負相關(P<0.05)。

BMTG和BMTC分別表示肉雞胸肌甘油三酯和總膽固醇含量；TMTG和TMTC分別表示肉雞腿肌甘油三酯和總膽固醇含量。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

3 討 論

3.1 飼糧添加硫辛酸對肉雞生長性能的影響

生長性能是反映肉雞生長最直接的指標，提高生長性能是增加經(jīng)濟效益的關鍵。硫辛酸作為一種功能性的飼料添加劑，可有效地減緩氧化應激給肉雞生長性能帶來的不利影響[3]。李杏[2]在飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸后，未引起21～52日齡黃羽肉雞生長性能的改變。El-Senousey等[7]在22～42日齡愛拔益加(AA)肉雞飼糧中添加硫辛酸表明，400和800 mg/kg的添加量顯著降低了肉雞ADG和ADFI，但不影響飼料轉化效率，1 200 mg/kg的添加量與800 mg/kg的添加量也無顯著差異。然而，楊瀟等[8]研究發(fā)現(xiàn)，1～42日齡肉雞飼糧中添加400和800 mg/kg 硫辛酸時，肉雞的ADFI和F/G均顯著降低且二者之間無顯著差異，但200 mg/kg的添加量未產(chǎn)生顯著影響。郭志有等[10]研究發(fā)現(xiàn)，硫辛酸添加量達到1 000 mg/kg時，肉雞的ADFI和體重都顯著下降。由此可知，飼糧中添加適量硫辛酸能夠促進動物生長，而過低劑量和過高劑量硫辛酸對動物的生長無促進作用。本試驗結果表明，在肉雞飼糧中添加400 mg/kg的硫辛酸對肉雞生長性能無顯著影響，這說明硫辛酸對肉雞生長性能的影響與使用劑量和使用時間密切相關。

3.2 飼糧添加硫辛酸對肉雞屠宰性能的影響

屠宰性能是衡量家禽產(chǎn)肉性能的重要指標。有研究表明，硫辛酸添加劑量在200～800 mg/kg時，對肉雞屠宰率、胸肌率和腿肌率等屠宰性能的影響不顯著[8]。也有研究表明，1～42日齡肉雞飼糧中添加250～1 000 mg/kg硫辛酸并沒有影響其屠宰率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率[10]。而本研究結果表明，飼糧添加400 mg/kg的硫辛酸可顯著提高肉雞28日齡屠宰率、42日齡胸肌率，顯著降低42日齡全凈膛率。這說明，硫辛酸對屠宰性能的影響在肉雞生長后期效果更明顯，且作用效果與肉雞添加日齡和添加時間有關。本試驗的結果顯示，硫辛酸的添加不影響肉雞腿肌率和腹脂率，這與文獻報道結果[7]一致。

3.3 飼糧添加硫辛酸對肉雞脂肪代謝相關指標的影響

體內(nèi)脂肪代謝情況可以通過血清和組織總膽固醇和甘油三酯含量反映。本試驗結果顯示，與對照組相比，肉雞42日齡腿肌中總膽固醇和甘油三酯含量分別顯著降低了47.62%和14.94%，而胸肌中總膽固醇和甘油三酯含量分別顯著提高了33.33%和24.05%。對于胸肌和腿肌脂肪代謝的差異變化說明硫辛酸的調(diào)控作用可能存在組織特異性，硫辛酸可促進胸肌脂質(zhì)沉積而抑制腿肌脂質(zhì)沉積。有研究發(fā)現(xiàn)，硫辛酸能夠對脂肪代謝產(chǎn)生影響的主要原因是對腸道內(nèi)糖的轉運過程造成影響[11]，也可能與腸道菌群的變化存在密切關系，為此本研究也進行了腸道菌群相關的研究。生物體內(nèi)的脂質(zhì)代謝的平衡與增強氧化供能有著緊密的關系。脂質(zhì)沉積主要和甘油三酯儲存與合成以及脂質(zhì)氧化有關[12]。研究表明，飼糧添加100 mg/kg硫辛酸能夠顯著降低大鼠血脂和肝臟總膽固醇和游離脂肪酸含量，調(diào)節(jié)血脂紊亂，改善脂質(zhì)沉積[13]。Koh等[14]研究發(fā)現(xiàn)，硫辛酸可以抑制脂肪細胞的分化，并在肥胖受試者中誘導體重減輕。

3.4 飼糧添加硫辛酸對肉雞腸道菌群的影響

生物體內(nèi)的腸道微生態(tài)系統(tǒng)對生物的消化吸收能力有著顯著影響，確保腸道菌群處于平衡狀態(tài)能夠明顯增強生物體的消化和吸收能力，有利于保持動物機體的健康[15]。本試驗中，28日齡，與對照組相比，試驗組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別顯著提高了27.15%和20.55%，表明該階段的菌群物種多樣性顯著增加。42日齡，試驗組各α多樣性指數(shù)較對照組均無顯著性差異，但試驗組的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于對照組，這表明硫辛酸可增加肉雞腸道菌群多樣性。

雞腸道中的菌群主要以厚壁菌門為主，其次為擬桿菌門、變形菌門和放線菌門(Actinobacteria)[16]，腸道菌群改變可導致腸道的消化吸收功能發(fā)生改變[17]。當腸道中的厚壁菌門相對豐度提高時，能夠幫助機體獲取食物里的能量和熱量[18]，微生物代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸也能確保生物體的腸道處于健康狀態(tài)[19]。擬桿菌門是第2大主要門類，擬桿菌菌群發(fā)酵的終產(chǎn)物丙酸鹽和乙酸鹽，為宿主和腸道微生物所需[20]；并影響胃腸道的正常發(fā)育和蛋白質(zhì)、碳水化合物代謝[21]。研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門與脂肪沉積存在一定的相關性，這2類微生物都能促進機體脂肪的沉積，且厚壁菌門比例升高時更有利于脂肪沉積[22]。在本試驗中，肉雞盲腸中擬桿菌屬、理研菌科RC9腸道群、考拉桿菌屬和瘤胃球菌科UCG_014為優(yōu)勢菌群；且與對照組相比，試驗組理研菌屬的相對豐度顯著升高，試驗組薩特氏菌屬、Tyzzerella、Harryflintia等細菌的相對豐度顯著降低。這表明，硫辛酸可通過影響腸道菌群來調(diào)控肉雞脂肪沉積。

本研究對腸道差異性菌屬與脂肪代謝相關指標進行相關性分析結果顯示，在屬水平，與胸肌或腿肌甘油三酯和總膽固醇含量呈正相關的菌群有Shuttleworthia、薩特氏菌屬、脫硫弧菌屬和Dielma，呈負相關的有丁酸球菌屬、理研菌屬和Harryflintia。丁酸球菌屬是可以產(chǎn)生丁酸鹽的一種腸道益生菌，而丁酸鹽可以促進機體的生長發(fā)育。有研究表明，產(chǎn)丁酸的丁酸梭菌可以通過調(diào)節(jié)腿肌肌激素敏感脂肪酶和脂蛋白脂酶等脂肪代謝相關酶活性以及甘油三酯脂肪酶mRNA表達量起到調(diào)控脂肪沉積的作用[23]。機體的生長發(fā)育與各種代謝變化密切相關，其中尤以脂肪代謝較為旺盛[24]。本試驗結果表明，胸肌總膽固醇含量與丁酸球菌屬呈顯著負相關，表明丁酸球菌屬能夠促進胸肌膽固醇的代謝。Dielma是一種目前報道較少的菌屬，在人的糞便中首次被發(fā)現(xiàn)[25]。脫硫弧菌屬在雞的盲腸中起著氫庫的作用，而氫有抑制短鏈脂肪酸生成的作用[26]。張培培[27]發(fā)現(xiàn)脫硫弧菌屬與體重、腰圍呈顯著正相關，與體脂分布存在潛在聯(lián)系，和本試驗中脫硫弧菌屬與胸肌甘油三酯含量呈顯著正相關的結果一致。本試驗中，理研菌屬與腿肌甘油三酯含量呈顯著負相關，表明理研菌屬對腿肌甘油三酯的代謝有促進作用。研究表明，理研菌屬與脂肪代謝、肥胖等疾病密切相關[28]。此外，腸道微生物代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸是畜肉脂肪合成過程中最重要的前體物質(zhì)，其含量不僅顯著影響腸道微生物的組成，還直接通過影響胸肌、腿肌中脂肪的含量[29]。硫辛酸通過腸道菌群對胸肌和腿肌脂肪的沉積也可能存在組織特異性，因而表現(xiàn)出胸肌和腿肌總膽固醇和甘油三酯含量變化的差異，且這種差異性變化可能與脂肪代謝相關酶活和基因表達有關[23]，其詳細機理有待進一步研究。

4 結 論

① 飼糧添加400 mg/kg硫辛酸對肉雞生長性能無顯著影響，但可提高肉雞28日齡屠宰率以及42日齡胸肌率和胸肌脂肪沉積，降低42日齡全凈膛率以及腿肌脂肪沉積。

② 飼糧添加400 mg/kg硫辛酸可以提高肉雞28日齡盲腸不可培養(yǎng)菌、Shuttleworthia、腸球菌屬和理研菌屬的相對豐度，提高42日齡盲腸脫硫弧菌屬和Dielma的相對豐度。

③ 硫辛酸調(diào)控肉雞胸肌和腿肌的脂肪沉積作用與腸道菌群存在顯著相關性。