郭燕珊 鄒晨浩 趙陸原 曹久愛 葛超悅 羅鑫宇 劉莉君 占秀安 陳少杰 劉 兵* 余東游*

(1.浙江大學海南研究院，三亞572025；2.浙江大學動物科學學院，杭州310058；3.浙江省畜牧技術推廣與種畜禽監(jiān)測總站，杭州310029；4.浙江新銀象生物工程有限公司，臺州317200)

ε-聚賴氨酸(ε-PL)是一種由白色鏈霉菌(Streptomycesalbulus)經(jīng)發(fā)酵產生的多肽類物質，由25～35個賴氨酸殘基通過α-羥基和ε-氨基之間的酰胺鍵構成同型均聚多肽[1]，呈高聚合多價陽離子態(tài)，具有廣譜抑菌活性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌的生長繁殖都有較好的抑制作用[2]。ε-PL的安全性已在大鼠試驗中得到證實，其對生物體無毒副作用[3-4]，是一種天然、安全、高效的食品添加劑，目前已被美國、日本、韓國和中國等國家批準為安全的食品防腐劑使用。

ε-PL作為營養(yǎng)防腐劑和抗菌劑，在食品行業(yè)發(fā)揮著重要作用，如在日本，ε-PL已被廣泛應用于米飯、面條、醬油和生魚片等的保鮮防腐中，在我國，ε-PL也被批準作為烘焙食品、熟肉制品和果蔬汁的食品添加劑。此外，ε-PL在醫(yī)療和制藥方面也得到廣泛應用與研究，由于其對生物膜具有良好的穿透力，可作為某些藥物的載體提高藥物療效[1]。然而，ε-PL在禽畜營養(yǎng)方面的應用尚未見報道，且ε-PL對動物健康、生長性能和肉蛋品質的影響仍有待探索。因此，本試驗以1日齡肉仔雞為研究對象，以苯甲酸鈉為對照組，研究ε-PL對肉雞生長性能、肉品質、血清生化指標與氮代謝率等的影響，以期評價ε-PL在肉雞飼糧中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ε-PL來源于ε-聚賴氨酸鹽酸鹽，有效成分標示值≥96.2%(以干品計)，實測值為96.5%，購自浙江某生物工程有限公司。

1.2 試驗設計

試驗選擇遺傳背景相同、同一批次、發(fā)育正常的1日齡健康雄性黃羽公雞(梅黃1號)640羽，隨機分為4個組，每組8個重復，每個重復20羽。試驗以正常賴氨酸水平的基礎飼糧(賴氨酸含量前期為1.15%，后期為1.00%)為空白對照組(CON組)，苯甲酸鈉組(SB組)在基礎飼糧中添加500 mg/kg苯甲酸鈉，ε-PL組在基礎飼糧中分別添加250 (ε-PL1組)和500 mg/kg (ε-PL2組)的ε-PL。試驗期為10周，分為1～5周和6～10周2個階段。

1.3 試驗飼糧

試驗選用玉米-豆粕型基礎飼糧，1～35日齡和36～70日齡基礎飼糧參照NRC(1994)和《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)中黃羽肉雞營養(yǎng)建議量，根據(jù)中國飼料成分表(2020年第31版)配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。配制飼糧時，通過以苯甲酸鈉或ε-PL適量替代預混料中沸石粉，以實現(xiàn)不同試驗組的設置。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1 Items1～351 to 35 days of age36～7036 to 70 days of age NaCl0.300.30 Limestone1.501.50 CaHPO41.201.20 Zeolite powder3.303.30L- L-lysine·HCl(78.8%)0.250.25 Premix1)0.450.45 Total100.00100.00 Nutrient levels2) ME/(MJ/kg)12.3812.64 CP22.28(22.30)20.72(20.75) Lys1.15(1.18)1.00(1.02) Met0.50(0.52)0.48(0.50)+ Met+Cys0.87(0.90)0.84(0.85) Thr0.82(0.84)0.75(0.76) Trp0.22(0.22)0.19(0.20) Arg1.20(1.21)1.12(1.13) Ca1.04(1.06)1.02(1.05) TP0.63(0.65)0.61(0.62) AP0.400.40

1.4 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在浙江大學飼料科學研究所試驗基地密閉式雞舍進行，試驗雞采用4層立體籠養(yǎng)，每籠10羽雞，單籠尺寸為120 cm×80 cm×60 cm，同一組各重復均勻分布于雞舍。雞舍內溫度、濕度、光照和衛(wèi)生學指標符合《商品肉雞生產技術規(guī)程》(GB 19664—2005)。試驗采用整舍育雛，暖風爐水暖控溫，最初進雛時舍溫為32 ℃，以后每周降低2 ℃至26 ℃為止，相對濕度保持在50%～60%，光照制度為16 h∶8 h(L/D)，光照強度為15～20 lx，自然通風結合縱向負壓通風。手工喂料，粉料飼喂，自由采食。通過乳頭式飲水器自由飲水。每天清糞2次，每周帶雞消毒1次，常規(guī)防疫和免疫。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 飼糧營養(yǎng)成分的測定

飼糧中粗蛋白質含量按照GB/T 6432—2018的方法測定；氨基酸含量按照GB/T 18246—2000的方法測定；鈣含量按照GB/T 6436—2018的方法測定；磷含量按照GB/T 6437—2018的方法測定。

1.5.2 生長性能的測定

試驗第1、35和70天，以重復為單位對空腹12 h肉雞稱重，記錄重量，計算平均日增重(average daily gain, ADG)；于試驗第35和70天，以重復為單位統(tǒng)計階段耗料量，計算平均日采食量(average daily feed intake, ADFI)和料重比(feed/gain, F/G)。

1.5.3 肉品質的測定

試驗第70天時，每個重復隨機選取1羽肉雞，屠宰解剖后，統(tǒng)一取左側整塊胸肌，測定pH、肉色和持水能力等肉品質指標，具體方法如下：屠宰后24 h，采用便攜式pH計(HANNA Instruments，HI99171，意大利)測定其pH；采用日本美能達CR410色差計測定胸肌的肉色亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值；取約30 g肌肉沿肌纖維方向修整后，準確稱重(W1)后置于一次性PE手套內，懸吊于4 ℃冰箱內，于24 h后取出肉樣，拭去表面液體后稱重(W2)，計算滴水損失，公式如下：

滴水損失(%)=100×[(W1-W2)/W1]。

另取約30 g肌肉修去外部脂肪和結締組織，準確稱重(W3)后裝密封袋中加熱至中心溫度70 ℃，冷卻后稱重(W4)，計算蒸煮損失，公式如下：

蒸煮損失(%)=100×[(W3-W4)/W3]。

1.5.4 全血和血清生化指標的測定

試驗第35天和第70天，從每個重復內隨機選取1羽肉雞，翅靜脈采集7 mL血液樣品。采集的血液樣品分為2部分，其中2 mL置于抗凝管中，采用全自動分析儀(Sysmex microcell counter CL-180，美國)進行血常規(guī)檢測，測定指標主要包括白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細胞壓積(HTC)和血小板計數(shù)(PLT)。剩余5 mL置于促凝管中，在室溫中放置30 min后，3 000×g離心15 min制備血清，血清儲存在-80 ℃冰箱，利用全自動生化分析儀(HITACHI Automatic Aralyzer 7600, 日本)測定血清中谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)活性及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量。

1.5.5 腸道形態(tài)的觀察與測定

將固定后的回腸組織，用常規(guī)方法制作石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后在光學顯微鏡(Nikon 80i，日本)下觀察測定絨毛高度(villus height, VH)、隱窩深度(crypt depth, CD)和絨毛高度與隱窩深度比值(VH/CD)。每個切片隨機選取5個非連續(xù)性視野，每個視野統(tǒng)計4組數(shù)據(jù)，整體平均值為最終測定結果。

1.5.6 糞氮含量和氮代謝率的測定

試驗第33～35天和第68～70天，分別采用全收糞法以重復為單位連續(xù)收集各組排泄物，剔除羽毛、飼糧等。將雞的排泄物混勻，以四分法縮樣(200 g左右)后，按照每100 g鮮糞加入10 mL 10%鹽酸溶液以固定揮發(fā)性氮，收集完畢后在65 ℃烘箱內烘干，粉碎后制備成待測樣品，用凱氏定氮法測定氮的含量，計算氮代謝率，公式如下：

氮表觀代謝率(%)=100×[(飼糧氮攝入量-
糞便氮排泄量)/飼糧氮攝入量]。

1.6 統(tǒng)計分析

采用Excel 2019軟件對試驗數(shù)據(jù)進行初步處理，SPSS 26.0版軟件的ANOVA程序對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，LSD檢驗進行多重比較，P<0.05時差異顯著。

2 結果與分析

2.1 飼糧中添加ε-PL對肉雞生長性能的影響

由表2可知，與CON組和SB組相比，飼糧中添加250和500 mg/kg ε-PL顯著提高了肉雞試驗前期(1～35日齡)、后期(36～70日齡)和全期(1～70日齡)平均日增重(P<0.05)；飼糧中添加250和500 mg/kg的ε-PL不同程度地降低了試驗前期、后期和全期料重比，與CON組相比，飼糧添加250 mg/kg的ε-PL顯著降低了后期和全期的料重比(P<0.05)。各飼糧處理對試驗前期、后期和全期平均日采食量均無顯著影響(P>0.05)。在本試驗條件下，飼糧中添加250和500 mg/kg的ε-PL可顯著提高肉雞平均日增重，降低料重比，且添加250 mg/kg的ε-PL效果最佳。

表2 飼糧中添加ε-PL對肉雞生長性能的影響

2.2 飼糧中添加ε-PL對肉雞肉品質的影響

由表3可知，各組間70日齡肉雞pH24 h，L*、a*和b*值，滴水損失和蒸煮損失均無顯著差異(P>0.05)，表明飼糧中添加250和500 mg/kg的ε-PL對肉品質無顯著影響。

表3 飼糧中添加ε-PL對肉雞肉品質的影響(70日齡)

2.3 飼糧中添加ε-PL對肉雞血常規(guī)指標的影響

由表4可知，各組間70日齡肉雞的全血WBC、RBC、HGB、HCT和PLT無顯著差異(P>0.05)，表明肉雞飼糧中添加ε-PL不會對肉雞機體造成不利影響。

2.4 飼糧中添加ε-PL對肉雞血清生化指標的影響

由表5可知，各組間70日齡肉雞血清AST、ALT和ALP活性及GLU、TG和TC含量均無顯著差異(P>0.05)；與CON組和SB組相比，飼糧中添加250和500 mg/kg ε-PL顯著提高了血清TP含量(P<0.05)，顯著降低了血清UA含量(P<0.05)；飼糧中添加250 mg/kg ε-PL顯著提高了血清GLB含量(P<0.05)。此結果提示飼糧中適量添加ε-PL可促進蛋白質的合成與利用。

表4 飼糧中添加ε-PL對肉雞血常規(guī)指標的影響(70日齡)

表5 飼糧中添加ε-PL對肉雞血清生化指標的影響(70日齡)

2.5 飼糧中添加ε-PL對肉雞腸道黏膜形態(tài)的影響

由表6可知，飼糧中添加ε-PL對35和70日齡肉雞空腸黏膜形態(tài)無顯著影響(P>0.05)。各組間35和70日齡肉雞回腸絨毛高度差異顯著(P<0.05)，與CON組和SB組相比，飼糧中添加250 mg/kg ε-PL顯著提高了35和70日齡肉雞回腸絨毛高度(P<0.05)，飼糧中添加500 mg/kg ε-PL顯著提高了70日齡肉雞回腸絨毛高度(P<0.05)。在本試驗條件下，飼糧中添加適量的ε-PL可顯著改善肉雞回腸黏膜的形態(tài)結構。

表6 飼糧中添加ε-PL對肉雞腸道黏膜形態(tài)的影響

6 Items GroupsCONSBε-PL1ε-PL2SEMPP-value CD/μm191.5185.1189.6188.05.720.892VH/CD5.045.155.685.390.180.05570 70 days of age Jejunum VH/μm1 277.01 222.51 295.51 303.333.000.311 CD/μm200.6201.1206.5203.46.700.931 VH/CD6.426.136.316.440.220.769 Ileum VH/μm1 050.9b1 049.3b1 130.3a1 133.7a24.800.006 CD/μm181.5177.0179.6192.65.500.204 VH/CD5.825.936.345.900.120.139

2.6 飼糧中添加ε-PL對肉雞氮代謝率的影響

由表7可知，與CON組和SB組相比，飼糧處理對試驗前期和試驗后期飼糧氮攝入量、糞便氮排泄量和氮表觀代謝率無顯著影響(P>0.05)。

表7 飼糧中添加ε-PL對肉雞氮代謝的影響

3 討 論

3.1 飼糧中添加ε-PL對肉雞生長性能的影響

生長性能是反映肉仔雞生長最直接的指標，提高生長性能是增加經(jīng)濟效益的關鍵。目前尚未有ε-PL影響肉雞生長性能的研究見報，但有研究表明，寧鄉(xiāng)豬飼糧中添加ε-PL可顯著改善回腸菌群結構，增加腸道中參與碳水化合物、氨基酸和多糖代謝的菌群基因相對豐度，進而提高機體對碳水化合物、氨基酸和多糖的吸收利用程度，改善寧鄉(xiāng)豬的健康水平[5]。而本試驗結果表明，飼糧中添加250和500 mg/kg的ε-PL顯著提高平均日增重，降低料重比，且添加250 mg/kg的ε-PL促生長效果最佳，原因可能是ε-PL在機體內降解為L-賴氨酸[6]，L-賴氨酸參與合成酶、骨骼肌、多肽激素和賴氨酸加壓素等體內蛋白質合成，促進機體生長發(fā)育[7]；此外，有研究表明，飼糧添加抗菌肽可以降低肉雞的料重比、提高平均日增重，進而提高生長性能[8-9]，與上述研究結果一致，本試驗中ε-PL也是一種抗菌肽，其通過改善腸道形態(tài)結構、增強機體免疫力、改善腸道菌群結構、提高營養(yǎng)物質消化率，進而促進機體生長發(fā)育[10-11]。

3.2 飼糧中添加ε-PL對肉雞肉品質的影響

pH，肉色L*、a*和b*值，滴水損失和蒸煮損失是肉品質評定的重要指標，對于肉的風味、貨架壽命有重要影響[12]。肌肉pH反映動物死后肌肉糖原酵解速率，直接影響肉產品的外觀和貨架壽命[13-14]。肉色是評價雞肉外觀最直接的感官特性指標，是影響消費者認可并購買肉品的決定因素之一，通常以L*、a*和b*值作為評價的依據(jù)[15]。滴水損失和蒸煮損失是衡量肌肉持水能力的重要指標，影響肉的嫩度和色澤，當?shù)嗡畵p失和蒸煮損失越小，肉的系水力越高[12,16]。以往關于ε-PL相關研究均是體外將ε-PL作為防腐抑菌劑直接添加到肉品中以延長肉品的貨架期[17]，而肉雞飼糧中添加ε-PL對肉品質的影響尚未見報道，本試驗在肉雞飼糧中添加250和500 mg/kg的ε-PL對pH，肉色L*、a*和b*值，滴水損失和蒸煮損失均無顯著影響，表明肉雞飼糧中ε-PL對肉品短期貯藏肉品質無顯著影響，但飼糧中添加ε-PL對雞肉長期貯藏的影響結果有待進一步探究。

3.3 飼糧中添加ε-PL對肉雞血常規(guī)指標的影響

血常規(guī)指標可通過反映血液中各類細胞組分的變化來評估機體的健康水平[18]，當機體處于健康、亞健康或疾病狀況時，其血常規(guī)數(shù)據(jù)存在顯著差異[19]。ε-PL被批準作為食品添加劑以來，尚未出現(xiàn)過因食用ε-PL而產生不良反應的報道。Ishii等[3]對大鼠進行了ε-PL亞慢性中毒試驗，結果顯示低劑量ε-PL組血常規(guī)指標有零星變化，但不具有毒理學意義。本試驗的結果與前人的研究結果一致，ε-PL對肉雞全血WBC、RBC、HGB、HCT和PLT等血常規(guī)指標均無顯著影響，表明肉雞飼糧中添加ε-PL不會對肉雞機體造成不利影響。Hiraki等[6]推測ε-PL缺乏毒性的原因，一是由于ε-PL在腸道中吸收量較低：通過14C放射性標記的ε-PL藥代動力學和代謝研究發(fā)現(xiàn)，口服48 h后，97%以上的放射性物質通過糞便、尿液或呼出氣體排出體外；二是ε-PL中不存在可能造成危害的因子：根據(jù)ADME試驗的結果可推測ε-PL在腸道中會被聚賴氨酸降解酶和微生物降解為不同長度的均聚物，之后繼續(xù)降解為L-賴氨酸,吸收入血后很快又參與到肽鏈和蛋白質的合成中去，其余一部分L-賴氨酸代謝產生α-氨基乙二酸和α-酮己二酸等內源性副產物[6]，因此ε-PL并不會對機體產生毒性。

3.4 飼糧中添加ε-PL對肉雞血清生化指標的影響

血清生化指標可反映機體的營養(yǎng)代謝、應激和健康狀態(tài)[20]。AST和ALT主要存在于肝臟、心臟和骨骼肌中，肝細胞或某些組織損傷或壞死，都會使血液中AST和ALT的活性升高[21]。ALP存在于機體的各個組織中，以骨骼、肝臟、腎臟中活性較高，血清ALP活性升高預示著肝臟異常，ALP活性降低可見于慢性腎炎、貧血等。TG和TC含量可以反映出動物機體的脂類代謝情況。本試驗中，各組70日齡肉雞血清AST、ALT和ALP活性及GLU、TG和TC含量等指標均無顯著差異，此結果提示肉雞飼糧中添加ε-PL不會對機體健康造成不利影響。此外，血清中TP、ALB和UA含量可反映動物體內蛋白質的代謝情況，TP含量提高，UA含量降低，表示機體蛋白質合成增強，蛋白質利用率提高[22-23]。本試驗中，飼糧添加250和500 mg/kg ε-PL顯著提高了血清TP含量，顯著降低了血清UA含量，不同程度提高了血清GLB含量，提示飼糧中適量添加ε-PL可促進蛋白質的合成與利用，這可能是因為飼糧添加ε-PL可提高機體氨基酸代謝、蛋白質輸出、蛋白質折疊和相關加工的代謝活性，進而提高蛋白的合成與利用[5]。

3.5 飼糧中添加ε-PL對肉雞腸道黏膜形態(tài)的影響

腸道形態(tài)學是評估腸道營養(yǎng)效果的常用研究工具[24]，因為小腸是消化吸收的最主要場所，小腸腸道形態(tài)變化可以揭示腸道的健康狀況，其中絨毛高度、隱窩深度和VH/CD是衡量腸黏膜消化吸收功能的重要指標。在適當范圍內，小腸絨毛高度越高，腸吸收表面積越大，腸道對營養(yǎng)的消化吸收能力越強[25]；隱窩深度越淺，表示腸上皮細胞成熟率越高，對營養(yǎng)物質的消化吸收能力越強[26]；VH/CD與腸道黏膜結構的健康相關，VH/CD降低，表示腸道黏膜結構受損，進而影響消化吸收能力[27]。本試驗中，飼糧中添加250 mg/kg ε-PL顯著提高了35和70日齡肉雞回腸絨毛高度，飼糧中添加500 mg/kg ε-PL顯著提高了70日齡肉雞回腸絨毛高度，結果說明在肉雞飼糧中添加適量ε-PL有利于改善肉雞腸道黏膜形態(tài)。原因可能與ε-PL對腸道菌群結構的調節(jié)有關：Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加ε-PL顯著提高了寧鄉(xiāng)豬回腸中的乳桿菌屬相對豐度，乳桿菌已被證實對維持腸道菌群平衡至關重要，該屬中的唾液乳桿菌還是一種益生菌，可激活細胞因子和趨化因子，誘導免疫反應；ε-PL增加了羅氏菌屬的相對豐度，羅氏菌可產生包括丁酸鹽在內的短鏈脂肪酸(SCFA)，進而改善腸道免疫；此外，ε-PL還抑制了一些有害菌的生長，如微球菌、不動桿菌、密螺旋體等。ε-PL作為抗菌肽，減少了有害菌對腸道的損害，增加了腸道中的有益菌，從而改善了回腸的腸道形態(tài)[28-29]。

3.6 飼糧中添加ε-PL對肉雞氮代謝的影響

目前，由于畜禽糞尿中含氮物質的過量排放，導致了嚴重的環(huán)境污染問題，而飼糧蛋白質水平與氮素排放密切相關。本試驗結果表明，飼糧中添加適量的ε-PL對肉雞飼糧氮攝入量、糞便氮排出量和氮表觀代謝率并無顯著影響。此外，家禽的氨基酸代謝以嘌呤核苷酸循環(huán)為主，氨基酸代謝終產物主要為尿酸[30]，血清UA和TP含量反映畜禽機體的蛋白質合成代謝水平，TP含量提高，UA含量降低，表示機體蛋白質合成增強，蛋白質利用率提高，結合飼糧添加250和500 mg/kg ε-PL顯著提高了血清TP含量，顯著降低了血清UA含量的結果，提示飼糧添加適量ε-PL可以提高蛋白質利用率，降低糞尿氮排放。

4 結 論

本試驗條件下，飼糧中添加250和500 mg/kg的ε-PL可改善肉雞腸道黏膜形態(tài)，增強肉雞蛋白質的合成代謝，進而提高肉雞平均日增重，降低料重比，且添加250 mg/kg的ε-PL效果最佳。