韓萌萌 龔賽明 殷運(yùn)菊 羅 杰 舒劍成 鄧 敦 沈 康 郭秋平 李鳳娜*
(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,動(dòng)物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙410125;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京100049;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長沙410128;4.唐人神集團(tuán)股份有限公司,株洲412007)
硒和鐵是維持人和動(dòng)物健康必需的微量元素,在機(jī)體內(nèi)參與多種生物學(xué)過程,如維持機(jī)體免疫、調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)等。硒是25種硒蛋白的主要成分,其中大部分具有抗氧化和免疫功能[1]。通常來說,有機(jī)硒比無機(jī)硒有更高的生物利用度和生物功能價(jià)值[2-3]。白雪等[4]研究表明,酵母硒相對(duì)于亞硒酸鈉在提高機(jī)體臟器硒含量及維持肉質(zhì)保鮮儲(chǔ)存方面效果更佳。鐵在體內(nèi)主要存在于血液、肝臟、脾臟和肌肉中,60%~70%的鐵元素分布在血紅蛋白中,2%~20%的鐵元素分布在肌紅蛋白(myoglobin,Mb)中,剩余的鐵以鐵蛋白(轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白等)、血鐵黃素和各種酶、細(xì)胞色素等形式存在[5]。氨基酸螯合鐵具有氨基酸和鐵元素雙重營養(yǎng)作用,生物利用效價(jià)高,更易被機(jī)體吸收[6]。研究表明,適量添加氨基酸螯合鐵可顯著改善豬的生產(chǎn)性能、免疫機(jī)能和肉色[7]。隨著生活水平的不斷提高,消費(fèi)者更加追求優(yōu)質(zhì)豬肉,不僅要求肉品外觀表現(xiàn)好,而且對(duì)營養(yǎng)價(jià)值也有著更高的要求。因此,本試驗(yàn)以育肥豬為研究對(duì)象,通過在基礎(chǔ)飼糧中添加酵母硒和甘氨酸亞鐵,探討有機(jī)硒和鐵對(duì)育肥豬肉品質(zhì)、組織硒含量、抗氧化特性以及鐵、硒關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)水平的影響,旨在為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)豬肉產(chǎn)品提供理論依據(jù)。
試驗(yàn)用添加劑酵母硒、甘氨酸鐵、亞硒酸鈉和硫酸亞鐵均為市購。
試驗(yàn)選用體況良好、體重約70 kg的“杜×長×大”三元雜交育肥豬240頭,采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),按體重及遺傳背景基本一致的原則隨機(jī)分成2個(gè)組,每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20頭豬(公母各占1/2)。
本試驗(yàn)在湖南省群豐試驗(yàn)豬場(chǎng)進(jìn)行。參照NRC(2012)豬營養(yǎng)需要配制飼糧,對(duì)照組飼糧中添加亞硒酸鈉和硫酸亞鐵,試驗(yàn)組飼糧中添加酵母硒和甘氨酸亞鐵,硒含量均為0.30 mg/kg,鐵含量均為100 mg/kg。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)豬自由采食和飲水,消毒和免疫等按照豬場(chǎng)常規(guī)程序進(jìn)行。試驗(yàn)預(yù)試期3 d,正試期60 d。
表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
1 Items Content Total100.00 Nutrient levels2) DE/(MJ/kg)13.56 CP13.51 Lys0.94 Met0.28 Thr0.59 Try0.17 AP0.35 Ca0.69
試驗(yàn)結(jié)束時(shí),每組隨機(jī)選取10頭豬運(yùn)往當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)(唐人神集團(tuán))進(jìn)行屠宰和樣品采集。頸靜脈采血后,血液樣品靜置0.5 h后離心分離血清,用于后續(xù)檢測(cè)血清抗氧化酶活性和微量元素含量;取右半邊胴體的背最長肌和股二頭肌組織用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)肉品質(zhì)感官指標(biāo)和后續(xù)肌肉化學(xué)組成、微量元素含量的分析,另取背最長肌樣品于液氮速凍后保存于-80 ℃,用于分子生物學(xué)檢測(cè)。
1.5.1 生長性能的測(cè)定
試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí),稱量并記錄各組豬的體重,統(tǒng)計(jì)出每個(gè)重復(fù)的總采食量,計(jì)算得出平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
1.5.2 胴體性狀的測(cè)定
空腹稱量宰前活重,電擊后屠宰開膛并稱量胴體重(去頭、蹄、尾及內(nèi)臟,保留板油和腎臟的軀體重量),計(jì)算屠宰率(胴體重與宰前活重之比);測(cè)量吊掛左半胴體的胴體斜長(由第1肋骨與胸骨結(jié)合處至恥骨聯(lián)合中線的距離)和胴體直長(由枕寰關(guān)節(jié)底部前緣至恥骨聯(lián)合前緣中線的距離)。用手術(shù)刀分離2片胴體上的板油,稱量重量后計(jì)算板油率[100×(板油重/胴體重)]。用游標(biāo)卡尺測(cè)量背膘厚(第1肋骨、第6~7肋骨及最后腰椎處,計(jì)算3處背部皮下脂肪厚度的平均值)。用游標(biāo)卡尺測(cè)量第6~7肋骨背最長肌橫斷面的寬度和高度,計(jì)算眼肌面積(寬度×高度×0.7)。
1.5.3 肉品質(zhì)的測(cè)定
參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 821—2019《豬肉品質(zhì)測(cè)定技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行背最長肌肉色評(píng)分和大理石紋評(píng)分;采用手持pH計(jì)(Matthaus pH Star,德國)、色差計(jì)(CR-410,Kinica Minolta Sensing Inc.,Osaka,日本)分別測(cè)定宰后背最長肌45 min和24 h的pH以及肉色亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值;采用質(zhì)構(gòu)儀(TMS-Pro,FTC,美國)測(cè)定宰后背最長肌的剪切力;采用懸掛法測(cè)定滴水損失,以及采用蒸煮法測(cè)定蒸煮損失。
1.5.4 肌肉化學(xué)組成的測(cè)定
肌肉樣品的干物質(zhì)(DM)、肌內(nèi)脂肪(IMF)和粗蛋白質(zhì)(CP)含量分別參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》、GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》和GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。
1.5.5 血清抗氧化指標(biāo)的測(cè)定
血清總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的商業(yè)試劑盒檢測(cè),血清過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量均采用長沙奧基生物科技有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒檢測(cè),并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
1.5.6 微量元素含量的測(cè)定
微量元素鐵、硒含量測(cè)定采用微波消解法進(jìn)行樣品前處理,鐵元素含量采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(Agilent 5110 ICP-OES,美國)測(cè)定,硒元素含量采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Agilent 7900 ICP-MS,美國)測(cè)定,步驟如下:肌肉樣品切薄片凍干72 h,粉碎后稱取0.25 g左右,記錄數(shù)值,然后用稱量紙將樣品送入消解管底部(血清樣品直接取1 mL左右于消解管中)。在通風(fēng)櫥內(nèi)用玻璃注射器加入5 mL濃硝酸,1 mL過氧化氫(H2O2),然后將樣品放入微波消解儀,消解程序設(shè)定為150 ℃ 10 min、180 ℃ 5 min、200 ℃ 25 min。消解結(jié)束后每管加0.4 mL高氯酸,并用趕酸儀(BHW-09A45)繼續(xù)操作,冷卻后用超純水沖洗并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容,用0.45 μm水系濾膜過濾雜質(zhì),4 ℃冰箱保存待測(cè)。
1.5.7 肌肉中鐵、硒關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的測(cè)定
采用TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,美國)提取肌肉組織中的總RNA,用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies,Inc.,Wilmington,DE,美國)測(cè)定總RNA濃度及在260和280 nm處的吸光度(OD)值,所有樣品的RNA濃度用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水調(diào)至1 000 ng/μL左右,利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Biotechnology Co., Ltd.,大連),按照說明書步驟合成cDNA,以合成的cDNA為模板采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方法測(cè)定背最長肌組織中鐵、硒關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平,引物序列(表2)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因,按照2-ΔΔCt法(ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCtGAPDH)計(jì)算各目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量[8]。
利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差異性比較,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,0.05
由表3可知,與對(duì)照組相比,飼糧添加有機(jī)硒和鐵對(duì)育肥豬平均日增重、平均日采食量和料重比均無顯著影響(P>0.05)。
表2 RT-PCR引物序列
表3 飼糧添加有機(jī)硒和鐵對(duì)育肥豬生長性能的影響
由表4可知,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組育肥豬胴體斜長有增加的趨勢(shì)(P=0.08);試驗(yàn)組育肥豬胴體重、屠宰率和眼肌面積等均略有增加,而背膘厚和腎周脂肪含量均有所降低,但差異均不顯著(P>0.05)。
表4 飼糧添加有機(jī)硒和鐵對(duì)育肥豬胴體性狀的影響
由表5可知,與對(duì)照組相比,飼糧添加有機(jī)硒和鐵顯著提高育肥豬宰后24 h背最長肌的肉色a*值和肉色評(píng)分(P<0.05),對(duì)其他肉品質(zhì)感官指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)。
表5 飼糧添加有機(jī)硒和鐵對(duì)育肥豬肉品質(zhì)的影響
由表6可知,與對(duì)照組相比,飼糧添加有機(jī)硒和鐵顯著提高育肥豬股二頭肌中的CP含量(P<0.05),同時(shí)有提高背最長肌中的DM含量的趨勢(shì)(P=0.05),對(duì)背最長肌和股二頭肌的IMF含量無顯著影響(P>0.05)。
由表7可知,與對(duì)照組相比,飼糧添加有機(jī)硒和鐵顯著或極顯著提高育肥豬血清T-AOC(P<0.05)和GSH-Px活性(P<0.01);試驗(yàn)組血清SOD活性有所提高,血清MDA含量有所降低,但均無顯著差異(P>0.05)。
表6 飼糧添加有機(jī)硒和鐵對(duì)育肥豬肌肉化學(xué)組成的影響
表7 飼糧添加有機(jī)硒和鐵對(duì)育肥豬血清抗氧化指標(biāo)的影響
由表8可知,與對(duì)照組相比,飼糧添加有機(jī)硒和鐵顯著或極顯著提高育肥豬血清、背最長肌和股二頭肌中硒含量(P<0.05或P<0.01),同時(shí)極顯著提高血清中鐵含量(P<0.01),有提高股二頭肌中鐵含量的趨勢(shì)(P=0.08)。鐵元素在肌肉組織中高低順序?yàn)椋汗啥^肌>背最長肌;硒元素在肌肉組織中高低順序?yàn)椋罕匙铋L肌>股二頭肌。
表8 飼糧添加有機(jī)硒和鐵對(duì)育肥豬血清和肌肉組織中礦物元素含量的影響
由表9可知,與對(duì)照組相比,飼糧添加有機(jī)硒和鐵顯著或極顯著提高育肥豬肌肉組織中Mb、鐵調(diào)節(jié)蛋白1(IRP1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TFR1)的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05或P<0.01),同時(shí)顯著提高肌肉組織中谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)、硒蛋白W(SELENOW)和硒蛋白P(SELENOP)的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。
表9 飼糧添加有機(jī)硒和鐵對(duì)育肥豬肌肉中鐵、硒關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響
硒、鐵作為動(dòng)物必需的2種微量元素,對(duì)豬的生長、免疫和繁殖等方面都有著重要作用,機(jī)體缺乏這2種微量元素將會(huì)產(chǎn)生各種不良癥狀[5,9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼糧添加有機(jī)硒和鐵對(duì)育肥豬的生長性能并無顯著影響,這與Mahan等[10]和卓釗等[11]的研究結(jié)果一致。胴體重、胴體斜長及屠宰率是衡量動(dòng)物屠宰性狀的重要指標(biāo),背膘厚度和眼肌面積則反映胴體瘦肉率[12]。部分研究表明,飼糧添加不同硒源和硒水平(0.1~0.5 mg/kg)都不會(huì)對(duì)豬的生長性能或胴體性狀產(chǎn)生顯著影響[10,13-14]。Szudzik等[15]對(duì)不同品種、不同生長階段的豬進(jìn)行補(bǔ)鐵,發(fā)現(xiàn)可有效改善仔豬缺鐵性貧血和維持正常的生長性能,但對(duì)生長育肥豬胴體性狀沒有顯著影響。本試驗(yàn)中,試驗(yàn)組和對(duì)照組育肥豬胴體性狀均無顯著差異,與上述研究報(bào)道結(jié)果一致。但也有研究顯示,飼糧添加有機(jī)硒可顯著改善育肥豬胴體相關(guān)指標(biāo),顯著增加眼肌面積[16-17]。不同動(dòng)物個(gè)體對(duì)微量元素的需求量和利用率不同,微量元素添加劑的量和形式不同可能是導(dǎo)致結(jié)果存在差異的原因。
肉色、pH、系水力和大理石紋等是反映豬肉品質(zhì)的表觀指標(biāo),這些指標(biāo)直接影響消費(fèi)者的購買選擇。肉色是最直觀的肉質(zhì)指標(biāo),肌肉中的Mb含量是肉色a*值的決定因素,鐵是合成Mb必需的微量元素,相比于無機(jī)鐵,在飼糧中添加有機(jī)鐵可有效改善斷奶仔豬的肉色a*值[11]。Lin等[18]研究發(fā)現(xiàn),提高飼糧中的鐵含量(150 mg/kg FeSO4)可顯著改善黃羽肉雞肌肉的肉色a*值。硒是GSH-Px的重要組成部分,可促進(jìn)清除自由基,有效防止Mb或氧合肌紅蛋白(MbO2)氧化成高鐵肌紅蛋白(MetMb),改善肉色[9]。與無機(jī)硒相比,飼糧添加酵母硒可更好地改善豬背最長肌的顏色[19-20],但也有研究發(fā)現(xiàn)飼糧添加不同硒源對(duì)育肥豬背最長肌45 min a*值和24 h a*值無顯著影響[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),飼糧添加有機(jī)硒和鐵可顯著提高育肥豬背最長肌24 h a*值、肉色評(píng)分以及Mb的mRNA相對(duì)表達(dá)量,推測(cè)鐵元素的利用率提高,并通過調(diào)節(jié)Mb的表達(dá)水平從而影響豬肉的肉色a*值,而有機(jī)硒則可能通過改善肌肉的抗氧化性能,對(duì)肉色的保護(hù)發(fā)揮促進(jìn)作用。
本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組育肥豬股二頭肌中的CP含量顯著升高。有研究表明,給豬飼喂高硒飼糧會(huì)激活單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)相關(guān)通路和硒蛋白在不同組織間的不同反應(yīng),在調(diào)節(jié)機(jī)體蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮作用,最終提高肌肉中的蛋白質(zhì)含量[22]。王力[23]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加一定劑量的酵母硒可以通過上調(diào)魚類肌肉中SELENOW的表達(dá),加快蛋白質(zhì)的沉積,這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。鐵元素是合成鐵硫蛋白(Fe-S)必備的微量元素,F(xiàn)e-S對(duì)高效合成蛋白質(zhì)所需的線粒體中轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的修飾有著極其重要的作用[24]。由此推測(cè),硒和鐵元素相互關(guān)聯(lián),協(xié)同提高肌肉組織的蛋白質(zhì)含量。
生物體內(nèi)有SOD、CAT和GSH-Px等酶類抗氧化系統(tǒng),部分微量元素參與抗氧化酶的活性構(gòu)成。硒通過硒蛋白的形式在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能,其中抗氧化是硒蛋白的重要功能之一[1]。研究表明,飼糧中添加不同水平的酵母硒能顯著提高育肥豬血清中T-AOC和總超氧化物歧化酶(T-SOD)、GSH-Px、CAT的活性并降低MDA含量[20],有機(jī)硒在改善肉兔、湖羊和魚類等不同動(dòng)物機(jī)體抗氧化性能上也具有明顯效果[4,25-26]。GSH-Px是常見的含硒抗氧化酶之一,國內(nèi)外學(xué)者均發(fā)現(xiàn)給動(dòng)物飼喂有機(jī)硒,可提高其體內(nèi)GSH-Px的表達(dá)量,進(jìn)而提高此酶活性,增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力[4,27-28]。鐵是CAT、SOD發(fā)揮正常功能的必需元素[29],SOD的作用是將活性氧基團(tuán)轉(zhuǎn)化為H2O2,而CAT負(fù)責(zé)破壞過量的H2O2。Kwiecień等[29]研究發(fā)現(xiàn),用蛋氨酸螯合鐵代替50% FeSO4提高了雞胸肉的T-AOC。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組育肥豬血清GSH-Px活性極顯著提高,肌肉組織中GPX1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高,推測(cè)硒是影響此酶活性的關(guān)鍵元素;而試驗(yàn)組血清T-AOC顯著提高,說明飼糧中同時(shí)添加有機(jī)硒和鐵比無機(jī)硒和鐵在提高機(jī)體抗氧化能力上更有優(yōu)勢(shì)。
飼糧添加不同硒源可顯著影響豬肌肉和血清中硒的沉積部位及含量。張少濤[21]報(bào)道,飼喂0.3 mg/kg酵母硒的生長育肥豬肝臟、腎臟和背最長肌硒沉積量顯著提高;與亞硒酸鈉相比,酵母硒可以顯著提高奶牛全血硒含量[30],本試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道相符。另有研究表明,飼糧添加100 mg/kg的甘氨酸亞鐵相比于硫酸亞鐵有提高斷奶仔豬血清鐵含量的趨勢(shì)[11],這與本試驗(yàn)有機(jī)鐵顯著提高育肥豬血清中鐵含量結(jié)果一致,同時(shí)本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)股二頭肌中鐵含量也有提高的趨勢(shì)。
鐵是構(gòu)成Mb的必要元素,Mb對(duì)肉色的a*值起著決定性作用。鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)是細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)重要調(diào)節(jié)蛋白,其可以通過與鐵反應(yīng)元件(IRE)的結(jié)合,對(duì)TFR1 mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)[31];腸道吸收的鐵與TF、TFR1結(jié)合成holo-TF/TFR1復(fù)合物,經(jīng)過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化,進(jìn)入細(xì)胞參與生化反應(yīng)[32-33]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組育肥豬肌肉組織中IRP1、TF和TFR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高,說明有機(jī)鐵的利用效率更高,機(jī)體鐵代謝增強(qiáng)。GPX1和SELENOW可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化環(huán)境,廣泛存在于機(jī)體各組織中[28,34],SELENOP在生物體內(nèi)起轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存硒的作用[35]。本研究結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組育肥豬肌肉組織中GPX1、SELENOP和SELENOW的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高,這與Zhang等[36]和張凱[3]的研究結(jié)果一致。有機(jī)硒的生物利用率比無機(jī)硒更高,攝入同等水平的有機(jī)硒和無機(jī)硒,前者會(huì)顯著上調(diào)關(guān)鍵硒蛋白的基因表達(dá)水平。
與無機(jī)硒和鐵相比,飼糧中同時(shí)添加酵母硒和甘氨酸鐵可提高育肥豬背最長肌24 h a*值和肉色評(píng)分,提高血清中硒和鐵元素含量,促進(jìn)肌肉組織中硒元素的沉積,提高機(jī)體抗氧化能力,同時(shí)提高肌肉組織中與鐵、硒相關(guān)的部分轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA表達(dá)水平。