黃 菲 王 曦 曹云鶴

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

近年來，動(dòng)物飼料中抗生素的濫用引起的環(huán)境污染與細(xì)菌耐藥性等問題愈發(fā)嚴(yán)重。為了實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，包括中國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家已明確禁止抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑在飼料中添加。為了適應(yīng)現(xiàn)代綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展，以獲得高質(zhì)量、無公害的畜產(chǎn)品，抗生素替代品的研究成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是部分真菌、昆蟲和植物產(chǎn)生的一種需氧脫氫酶。早在1999年，GOD就被納入我國(guó)允許使用的飼料添加劑品種目錄[1]。多項(xiàng)研究已證明，GOD在畜禽飼料中的添加可以改善動(dòng)物生產(chǎn)性能、繁殖性能、機(jī)體免疫水平和抗氧化能力，還可以調(diào)節(jié)腸道屏障功能，維持腸道菌群平衡。本文將對(duì)GOD的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理、在動(dòng)物飼料中發(fā)揮作用的機(jī)制以及應(yīng)用效果作一綜述。

1 GOD的結(jié)構(gòu)

截至目前，晶體結(jié)構(gòu)已在美國(guó)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank，PDB)(www.rcsb.org)中得到報(bào)道的GOD主要來自黑曲霉(1GAL、3QVP、3QVR、5NIT、5NIW和1CF3)、尼崎青霉(1GPE)和黃曲霉(4YNT和4YNU)。GOD的相對(duì)分子質(zhì)量為130×103～175×103，以糖基化的同源二聚體的形式存在，每個(gè)亞基非共價(jià)結(jié)合1個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)分子，2個(gè)亞基之間通過鹽橋和氫鍵等作用力結(jié)合在一起[2-3]。來自黑曲霉的GOD亞基晶體結(jié)構(gòu)如圖1所示[4-5]。

圖1 來自黑曲霉的GOD亞基晶體結(jié)構(gòu)

2 GOD的催化機(jī)理

GOD能以分子氧為電子受體，特異性地催化β-D-葡萄糖生成過氧化氫和葡萄糖酸(gluconic acid，GA)，反應(yīng)方程式如圖2所示[6]。

圖2 GOD催化反應(yīng)示意圖

在此過程中，GOD分子中的FAD充當(dāng)輔酶，通過電子與氫的得失參與氧化還原反應(yīng)。該反應(yīng)可分為還原和氧化2個(gè)步驟：在還原半反應(yīng)中，GOD催化β-D-葡萄糖氧化為D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，后者能夠通過自發(fā)的水解形成GA；隨后，GOD的FAD環(huán)被還原，成為還原型黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)。在氧化半反應(yīng)中，還原型GOD被分子氧氧化，生成過氧化氫[3]。

3 GOD的作用

3.1 清除分子氧作用

在飼料加工、運(yùn)輸與儲(chǔ)存過程中，氧氣不僅有利于好氧微生物(如霉菌等)的生長(zhǎng)與繁殖，還會(huì)使得飼料中易被氧化的有益成分失活，引起飼料形態(tài)、顏色和味道等一系列的變化，導(dǎo)致其保質(zhì)期縮短，影響動(dòng)物對(duì)飼料的采食。GOD的催化反應(yīng)可以利用底物葡萄糖，清除分子氧，產(chǎn)生具有殺菌作用的過氧化氫，因此它在食品和飲料上已被廣泛用于去除殘余的葡萄糖和氧氣，以延長(zhǎng)保質(zhì)期[7-8]。Sagi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GOD-過氧化氫酶(catalase，CAT)制劑在室溫下能在約30 min內(nèi)將新鮮橙汁中的溶解氧降低到1 mg/L以下，由此可以抑制微生物的生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)果汁貨架期。

應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，GOD的催化作用使得消化道內(nèi)分子氧減少，有利于腸道厭氧環(huán)境的維持，并能促進(jìn)厭氧有益菌的生長(zhǎng)。Wu等[10]研究表明，GOD可以顯著增加愛拔益加(Arbor Acres，AA)肉雞盲腸中厭氧抗炎益生菌普氏棲糞桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii)的數(shù)量。

3.2 酸化作用

消化道的酸度與飼糧、腸道微生物組成以及消化液的分泌等有很大的關(guān)系。GOD催化葡萄糖生成的產(chǎn)物GA是一種有機(jī)弱酸，它可以作為益生元改變腸道菌群，其經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)可進(jìn)一步降低腸道pH[11]。Biagi等[12]使用GA進(jìn)行了豬體外盲腸發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，GA在體外系統(tǒng)中調(diào)節(jié)了盲腸菌群，增加了SCFA的產(chǎn)生，降低了氨濃度；并通過體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證明GA傾向于增加仔豬空腸中的總SCFA。

胃腸道的pH會(huì)影響蛋白酶原轉(zhuǎn)化為蛋白酶的過程以及消化酶的活性，進(jìn)而影響飼糧的消化率。楊久仙等[13]研究了GOD對(duì)斷奶仔豬的影響，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加0.1%～0.2%的GOD能夠降低斷奶仔豬胃腸道pH。劉亞娟等[14]研究了GOD對(duì)生長(zhǎng)獺兔腸道消化酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)十二指腸和空腸部分的胰蛋白酶活性有隨GOD添加量的增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)，并認(rèn)為GOD催化產(chǎn)生的GA降低了腸道pH，形成了有利于消化酶活性的弱酸性環(huán)境。

3.3 抑菌作用

體外試驗(yàn)已證明，GOD對(duì)多種細(xì)菌和真菌都有抑菌作用。此外，GOD對(duì)一些植物病原菌引起的植物病害也有預(yù)防和治療效果[15-16]。GOD的體外抑菌效果見表1[16-26]。

Leiter等[17]研究了產(chǎn)黃青霉GOD的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)在D-葡萄糖存在下，所有受試細(xì)菌、酵母菌和絲狀真菌都對(duì)GOD敏感。GOD的抑菌效果主要是依靠催化反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫完成的，在葡萄糖存在的條件下，GOD催化反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫可通過引起胞膜脂質(zhì)過氧化、干擾細(xì)胞內(nèi)電子傳遞系統(tǒng)、破壞蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)或損傷遺傳物質(zhì)等方式影響細(xì)菌或真菌的正常生理功能[19]。塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)產(chǎn)生的GOD可以引起極腐霉(Pythiumultimum)和茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)菌絲的變形并抑制其孢子的產(chǎn)生，對(duì)其造成致死性損傷[15,25]。GOD對(duì)不同微生物的抑菌效果取決于微生物固有的抗氧化能力。Dobbenie等[19]研究表明，微生物分解過氧化氫的能力存在顯著差異，在其研究的4種細(xì)菌中，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)具有最高的CAT活性，同時(shí)對(duì)GOD/葡萄糖抗菌系統(tǒng)具有最強(qiáng)的抵抗能力。GOD催化反應(yīng)導(dǎo)致的碳源減少[16]、反應(yīng)產(chǎn)物GA引起的細(xì)菌膜的去極化、內(nèi)部pH的變化以及細(xì)菌內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸和合成的改變也可對(duì)部分微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制[11,22,24]。Kantt等[24]研究發(fā)現(xiàn)，GOD和GA對(duì)致病菌水生棒桿菌(Corynebacteraquaticum)的生長(zhǎng)均有抑制作用，但是僅加入過氧化氫對(duì)該菌的生長(zhǎng)沒有影響，說明GOD對(duì)其抑制作用是由GA導(dǎo)致的。

表1 GOD的體外抑菌效果

1 BacteriaGeneraSpeciesReferences FungiGeneraSpeciesReferencesErwinia(Erwinia carotovora)Kim[18](Aspergillus terreus)Leiter[17]Micrococcus(Micrococcus luteus)Dobbenie[19](Emericella nidulans)Leiter[17]Salmonella(Salmonella enteritidis)Dobbenie[19]Rhizoctonia(Rhizoctonia bataticola)Kriaa[25](Salmonella infantis)Tiina[20](Rhizoctonia solani)Kim[18],Kriaa[25](Salmonella derby)Massa[22]Fusarium(Fusarium solani)Kriaa[25]Clostridium(Clostridium perfringens)Tiina[20]Pythium(Pythium ultimum)Kriaa[25],Kim[18]Campylobacter(Campylobacter jejuni)Tiina[20](Pythium aphanidermatum)Kim[18]Listeria(Listeria monocytogenes)Tiina[20]Verticillium(Verticillium dahliae)Kim[18],Kriaa[25]Yersinia(Yersinia enterocofitica)Tiina[20]Alternaria(Alternaria solani)Kriaa[25]Lactobacillus(Lactobacillus plantarum)Tiina[20]Gliocladium(Gliocladium virens)Kim[18]Corynebacterium(Corynebacterium xerosis)Kahin[21]Sclerotinia(Sclerotinia minor)Kim[18](Corynebacterium aquaticum)Kantt[24](Sclerotium rolfsii)Kim[18]Pasteurella(Pasteurella multoida)Zia[23]Talaromyces(Talaromyces flavus)Kim[18]Paemibacillus(Paenibacillus larvae)Sagona[26]Trichoderma(Trichoderma hamatum)Kim[18]

1 BacteriaGeneraSpeciesReferences FungiGeneraSpeciesReferencesAcinetobacter(Acinetobacter calcoaceticus)Kantt[24]Botrytis(Botrytis cinerea)Li[16]

4 GOD在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果

4.1 改善生產(chǎn)性能

GOD改善生產(chǎn)性能的效果因其來源、使用劑量、試驗(yàn)動(dòng)物以及試驗(yàn)條件等不同而有所差異。表2中列出了部分近年來飼糧中添加GOD對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能的作用效果[27-33]。

表2 GOD對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響

生產(chǎn)性能的改善對(duì)提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益十分重要。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，在動(dòng)物飼糧中添加適宜劑量的GOD可以改善動(dòng)物對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、鈣、磷、粗脂肪和粗纖維等的消化率，顯著提高小腸的消化酶活性[10,14,34-35]，并因此改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在AA肉雞飼糧中添加GOD可以提高21日齡肉雞的平均日增重(ADG)并降低料重比(F/G)。Tang等[36]在仔豬飼糧中添加100 U/kg GOD進(jìn)行飼喂試驗(yàn)，結(jié)果顯示，補(bǔ)充GOD后仔豬的ADG和飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)與對(duì)照組相比有所提高，血清中三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素和生長(zhǎng)激素濃度升高，糞便菌群也得到改善，表明GOD可能通過提高生長(zhǎng)激素水平或調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)來改善生長(zhǎng)性能。

4.2 改善肉質(zhì)

肉質(zhì)的改善對(duì)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的提升十分重要。除遺傳因素外，肉質(zhì)主要受到飼糧營(yíng)養(yǎng)成分和飼養(yǎng)管理水平的影響。飼糧中添加GOD有改善畜禽肉質(zhì)的效果。Wu等[10]研究表明，與對(duì)照組相比，在AA肉雞飼糧中添加GOD可顯著提高屠宰后24 h雞胸肉的pH和紅度，GOD改善肉質(zhì)可能與提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和改善抗氧化能力有關(guān)。GOD誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為血漿中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性提高，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量顯著降低，這是GOD調(diào)節(jié)肉質(zhì)的潛在原因。GOD通過消除腸道分子氧、產(chǎn)生GA來改善腸道厭氧和酸性環(huán)境，并由此調(diào)節(jié)腸道菌群，不同腸道菌群的代謝活動(dòng)對(duì)宿主肉質(zhì)的影響也各不相同。Wu等[31]對(duì)肉雞分別飼喂來自黑曲霉和尼崎青霉的GOD或抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑(antibiotic growth promoters，AGP)，并對(duì)其肉質(zhì)和腸道菌群進(jìn)行了相關(guān)分析，研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的變化介導(dǎo)了不同來源的GOD或AGP對(duì)肉質(zhì)的不同作用；與AGP組相比，GOD組腸道菌群中顯著增加的Brenneria、Faecalibacterium和Holdemania與MDA含量呈負(fù)相關(guān)，與21日齡肉雞肉質(zhì)的顯著提高呈正相關(guān)，Anaerofilum、Coprobacillus和Dorea的顯著增加與42日齡肉雞肉質(zhì)的顯著提高呈正相關(guān)；與飼喂黑曲霉產(chǎn)生的GOD相比，飼喂尼崎青霉產(chǎn)生的GOD顯著增加了42日齡肉雞腸道中的Anaerofilum。GOD與一些飼料添加劑聯(lián)合使用時(shí)對(duì)肉質(zhì)的改善效果更佳。Wang等[33]研究表明，GOD和解淀粉芽孢桿菌SC06在飼糧中聯(lián)用與單獨(dú)使用相比較，顯著降低了嶺南黃羽肉雞胸肌的剪切力，使肉的嫩度有所改善。

4.3 改善繁殖性能

動(dòng)物的繁殖性能與遺傳因素、營(yíng)養(yǎng)水平、管理水平等密切相關(guān)。孫穎雪[37]研究發(fā)現(xiàn)，GOD可提高妊娠母豬后期平均日采食量(ADFI)以及斷奶后7 d發(fā)情率，降低母豬在泌乳期的背膘損失，對(duì)母豬生產(chǎn)具有重要意義。尤瑞祺等[38]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，妊娠母豬飼糧中添加600 mg/kg GOD可以顯著提高大河烏豬仔豬的初生重和20日齡體重。GOD對(duì)繁殖性能的改善作用可能是通過提高抗氧化能力并減輕氧化應(yīng)激水平[38-39]、影響機(jī)體能量代謝[37]、提高繁殖相關(guān)激素的水平[40]以及減少生殖器官細(xì)胞凋亡[28]等來實(shí)現(xiàn)的。李嘉輝等[39]研究表明，產(chǎn)蛋后期蛋種雞飼糧添加350和500 mg/kg GOD后，產(chǎn)蛋率、種蛋蛋殼厚度和哈氏單位顯著增加，料蛋比顯著降低，血清和肝臟谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、SOD活性顯著提高，血清和肝臟MDA含量顯著降低。由此可見，GOD可能是通過緩解種雞的氧化應(yīng)激、減輕脂質(zhì)過氧化水平來提高其產(chǎn)蛋性能的。血液中適宜的繁殖相關(guān)激素的水平對(duì)蛋種雞產(chǎn)蛋后期繁殖性能的維持十分重要。李生杰[40]研究表明，飼糧中添加200、350、500 mg/kg的GOD均提高了產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋種雞血清中雌二醇、促卵泡素和孕酮含量，并不同程度地提高了產(chǎn)蛋率、種蛋受精率以及大白卵泡數(shù)量，降低了試驗(yàn)各階段的料蛋比。Sun等[28]研究表明，飼糧中添加GOD可提高泌乳母豬的ADFI，顯著提高斷奶時(shí)仔豬的窩重，并通過減少細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來減輕肝臟、卵巢和子宮的細(xì)胞凋亡，對(duì)這些器官起保護(hù)作用。

4.4 改善機(jī)體免疫水平

飼糧中添加適宜劑量的GOD可改變動(dòng)物的免疫器官指數(shù)、血液或腸道中細(xì)胞因子和抗體的含量或表達(dá)水平，由此改善機(jī)體的免疫水平，且與抗生素有類似的效果。GOD對(duì)部分動(dòng)物免疫水平的影響見表3[10,29,32-33,41-45]。

GOD可通過增強(qiáng)機(jī)體免疫水平、降低機(jī)體促炎因子水平等方式緩解外界應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)。劉嬌等[46]研究表明，飼糧中添加200 U/kg的GOD可通過降低大腸桿菌O88攻毒肉鴨血液白細(xì)胞數(shù)、提高淋巴細(xì)胞百分比來增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫，且其降低空腸促炎細(xì)胞因子含量的效果與抗生素組無顯著差異，這表明GOD能夠緩解機(jī)體的炎癥反應(yīng)，減少外來病原對(duì)機(jī)體的損傷。Wang等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激之前補(bǔ)充GOD會(huì)刺激腸道氧化應(yīng)激并產(chǎn)生補(bǔ)償反應(yīng)，從而防止腸道炎癥因子的快速增加。Qu等[30]研究表明，與發(fā)霉玉米組相比，同時(shí)補(bǔ)充GOD可通過提高肉雞回腸分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)水平和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)水平，并降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)水平，由此減少霉菌毒素引起的炎癥反應(yīng)；該研究還表明GOD可能通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路發(fā)揮其作用。

表3 GOD對(duì)動(dòng)物免疫水平的影響

4.5 改善抗氧化能力

當(dāng)機(jī)體的酶促和非酶促抗氧化機(jī)制不足以抵御活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)的產(chǎn)生時(shí)，細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)被打亂，繼而發(fā)生氧化應(yīng)激[47-48]。在動(dòng)物生產(chǎn)中，誘發(fā)氧化應(yīng)激的因素包括出生、斷奶、飼糧組成及質(zhì)量、飼養(yǎng)環(huán)境以及社會(huì)環(huán)境等[49]。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能與繁殖性能等的降低，進(jìn)而影響?zhàn)B殖的經(jīng)濟(jì)效益。多項(xiàng)研究已證明，GOD可以通過提高抗氧化酶的活性和降低機(jī)體氧化水平等方式改善機(jī)體的抗氧化能力(表4)[10,27-28,31,33-34,38-41,45-46,50-53]。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是一種基本的堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper，bZip)轉(zhuǎn)錄因子，可通過誘導(dǎo)和上調(diào)抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)依賴性基因的表達(dá)來影響谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成和機(jī)體氧化還原狀態(tài)[54-55]。李嘉輝等[39]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GOD使產(chǎn)蛋后期蛋種雞的肝臟和血清中MDA、SOD、GSH-Px等抗氧化指標(biāo)得到改善，且提高了肝臟抗氧化相關(guān)基因[Nrf2、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)]的mRNA相對(duì)表達(dá)量。這說明GOD可能是通過激活核因子Nrf2/ARE信號(hào)通路基因的表達(dá)，進(jìn)而提高下游GSH-Px等抗氧化酶的水平以提高抗氧化能力的。Zhang等[56]研究表明，八角提取物(IVE)和添加GOD的益生菌(PGO)能通過激活肝臟和空腸中的Nrf2/Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Keap1)信號(hào)通路來提高斷奶仔豬的抗氧化能力，且IVE與PGO的互作效應(yīng)顯著。轉(zhuǎn)錄因子p53是一種具有多種細(xì)胞功能的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，它的持續(xù)激活將上調(diào)ROS的表達(dá)[48]，使氧化應(yīng)激水平升高。B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)是細(xì)胞凋亡中線粒體途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也可以促進(jìn)ROS的產(chǎn)生[57]。Wang等[33]在肉雞上的試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GOD顯著降低肝臟中p53和Bax的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。這表明GOD可通過降低促氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá)水平來減少ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響，與單獨(dú)的GOD組相比，飼糧添加75 U/kg GOD和1×105CFU/g解淀粉芽孢桿菌SC06的組合能更顯著地降低p53和B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的轉(zhuǎn)錄，表明其對(duì)抗氧化活性和抗細(xì)胞凋亡的效果更好。Sun等[28]研究表明，與飼糧只添加60 U/kg GOD的經(jīng)產(chǎn)母豬相比，同時(shí)添加75 U/kg CAT和60 U/kg GOD可以降低泌乳第1天母豬血漿中的ROS水平。這說明GOD降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平的能力受飼糧CAT活性的影響，GOD聯(lián)合CAT可以更好地緩解哺乳母豬的氧化損傷。

表4 GOD對(duì)動(dòng)物抗氧化能力的影響

4Experimental animalsEnzyme activity/(U/g)Supplemental doseEffectsReferencesMultiparous sows—60 U/kgT-SODGSH-PxT-AOC,MDA、8-OHdG;T-AOCT-SOD,MDASun[28]O88Peking ducks challenged with Escherichia coli O881 000200 U/kgMDA,T-AOC[46]Weaned piglets20040 U/kg6 h,MDA,SOD,SOD、CAT、HO-1、Nrf2、Keap1Sun[51]Mice—0.1%、0.3%0.5%T-SOD,MDA[52]Weaned piglets2 000150 g/tSOD,MDA[53]Weaned piglets1 0000.01%、0.03%0.05%GSH-PxGSHDang[27]AAAA broilers—60 U/kgMDAWu[31]

4.6 改善腸道健康

4.6.1 改善腸道屏障功能

動(dòng)物腸道屏障包括微生物屏障、物理屏障、化學(xué)屏障和免疫屏障[58-59]。腸道的物理屏障由緊密連接蛋白構(gòu)成，包括咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudin)及閉合小帶蛋白(zonula occludens，ZOs)，它們形成了腸道屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[60]。黏蛋白-2(mucin-2，MUC-2)，在腸道中由杯狀細(xì)胞分泌，與水、電解質(zhì)和脂質(zhì)等一起在腸道中形成黏稠的凝膠狀網(wǎng)絡(luò)[61]，構(gòu)成腸道的化學(xué)屏障。研究表明，GOD能夠通過提高緊密連接蛋白[29-30,32-33,51,62-63]、黏蛋白[33]、分泌型免疫球蛋白[62]等在腸道中的表達(dá)水平改善動(dòng)物的腸道的屏障功能，阻止不利因素影響下腸道通透性的提高[29-30,46]。Liu等[29]研究了飼糧中添加200 U/kg GOD對(duì)大腸桿菌O88攻毒北京鴨的影響，發(fā)現(xiàn)GOD可以增強(qiáng)緊密連接蛋白ZO-1、claudin-1和claudin-2的基因表達(dá)，并降低鴨血漿中二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)的活性和D-乳酸(D-lactic acid，D-LA)的含量，這說明攻毒肉鴨的腸道通透性降低，物理屏障得到改善，攻毒造成的腸道損傷被減輕。

4.6.2 維持腸道菌群平衡

在人和動(dòng)物的消化道中，存在著數(shù)以萬(wàn)億計(jì)的微生物，它們可通過發(fā)酵食物成分影響胃腸道的消化與吸收，其產(chǎn)生的信號(hào)還會(huì)經(jīng)由腦腸軸影響機(jī)體的神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫通路[64]。微生物群進(jìn)化出了復(fù)雜的機(jī)制，包括營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、競(jìng)爭(zhēng)性代謝相互作用、生態(tài)位排斥和宿主免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)來抑制病原體的生長(zhǎng)[65]，由此減少有害菌對(duì)機(jī)體的影響。

研究已證明，飼糧中補(bǔ)充GOD可提高腸道菌群多樣性[32,50,63,66]、減少有害菌數(shù)量并提高有益菌數(shù)量[28,67-69]，由此來維持動(dòng)物腸道菌群的平衡。Zhao等[32]在北京油雞上的研究證明，飼糧補(bǔ)充200 U/kg GOD有增加回腸菌群香農(nóng)-韋弗指數(shù)的趨勢(shì)，且在屬水平上降低了致病菌埃希氏-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)的相對(duì)豐度；添加GOD后，F(xiàn)aecalibacterium和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對(duì)豐度增加，這有利于77日齡北京油雞的增重、飼料利用率和腸道屏障功能。Wu等[10]研究表明，飼糧GOD誘導(dǎo)的不同腸道微生物，特別是普氏棲糞桿菌，可能作為改善生長(zhǎng)性能和腸道健康的重要調(diào)節(jié)因子，與AGP相比，GOD能在提高生長(zhǎng)性能的同時(shí)保持腸道細(xì)菌多樣性。GOD改變腸道菌群結(jié)構(gòu)的功能主要是通過消耗氧氣、產(chǎn)酸以及產(chǎn)生過氧化氫來完成的。GOD催化大量消耗腸道中的氧氣，有利于腸道厭氧環(huán)境的維持，并促進(jìn)厭氧益生菌的生長(zhǎng)，抑制好氧有害菌的生長(zhǎng)。GOD催化反應(yīng)的產(chǎn)物GA經(jīng)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸和乙酸酯能被利用酸的細(xì)菌[如埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)]用來生成丁酸[70]，而丁酸是結(jié)腸細(xì)胞的主要能量來源，可維持健康的腸道微生物群[71]，從而對(duì)動(dòng)物的腸道產(chǎn)生積極影響。

4.6.3 改善腸道形態(tài)

腸道形態(tài)不僅反映了腸道的健康水平，也能在一定程度上反映腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。腸絨毛高度(villus height，VH)越長(zhǎng)，則其與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接觸的表面積越大，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收越有利[72]。新的腸細(xì)胞需要從隱窩遷移到絨毛尖端，在此遷移過程中，細(xì)胞成熟且吸收營(yíng)養(yǎng)的能力更完善[73]，較淺的隱窩代表著細(xì)胞的成熟度較高。腸道VH越長(zhǎng)、隱窩深度(crypt depth，CD)越小、絨毛高度/隱窩深度(VH/CD)值越大通常代表著腸道吸收能力越好。GOD能在有害微生物攻毒[29,63]、氧化應(yīng)激[51]等對(duì)腸道功能不利的條件下不同程度地增加腸道的VH、降低CD或增大VH/CD。Zhao等[63]使用產(chǎn)氣莢膜梭菌從第14天到第20天對(duì)AA肉雞進(jìn)行攻毒，探究了GOD對(duì)壞死性腸炎的預(yù)防和緩解作用，結(jié)果表明，GOD能顯著增加第21天回腸VH和VH/CD，表明GOD可以改善腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)，這種改善作用可能是通過GOD催化產(chǎn)生的GA的益生作用完成的。

4.7 其他作用

4.7.1 緩解霉菌毒素中毒

霉菌毒素是飼料中的主要污染物，飼料中霉菌毒素包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏馬菌素、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等[74]。霉菌毒素對(duì)動(dòng)物具有腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性等多種毒性[75]，會(huì)影響動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、繁殖性能以及肉質(zhì)等多種與經(jīng)濟(jì)效益關(guān)系密切的指標(biāo)。

飼糧中添加GOD一方面可以抑制黃曲霉等多種產(chǎn)生霉菌毒素的真菌的生長(zhǎng)，另一方面也能緩解霉菌毒素暴露對(duì)動(dòng)物的影響。Qu等[30]研究了飼糧添加0.01% GOD對(duì)飼喂含有10%霉變玉米飼糧的AA肉雞的影響，結(jié)果表明，補(bǔ)充GOD可以防止絨毛破裂、維持腸道通透性和屏障功能來保護(hù)腸道免受霉菌毒素的損害，對(duì)肉雞的生長(zhǎng)、炎癥反應(yīng)、抗氧化活性和免疫功能具有保護(hù)作用，其有益作用可能是微生物群介導(dǎo)的。

4.7.2 抗仔豬腹瀉

飼糧中補(bǔ)充氧化鋅是一種常用的抗仔豬腹瀉手段，但是它有污染環(huán)境、傳播抗生素抗性基因和影響腸道正常微生物群的風(fēng)險(xiǎn)[76]。因此，氧化鋅替代品的開發(fā)至關(guān)重要。陳成[77]進(jìn)行了GOD替代高劑量氧化鋅的研究，并綜合試驗(yàn)結(jié)果中GOD的促生長(zhǎng)和抗腹瀉作用得出結(jié)論：斷奶仔豬飼糧中添加30 mg/kg活性為1 000 U/g的GOD可替代3 000 mg/kg氧化鋅，且經(jīng)濟(jì)效益顯著。

4.7.3 緩解熱應(yīng)激

家禽生產(chǎn)過程中，熱應(yīng)激是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)，會(huì)導(dǎo)致家禽生長(zhǎng)性能降低，肉質(zhì)變差[78]。Wang等[45]研究了在熱應(yīng)激前后的飼糧中添加GOD對(duì)肉雞生長(zhǎng)、腸道炎癥等的影響，結(jié)果顯示，飼糧中添加GOD(100 g/t)提高了高溫下肉雞的生長(zhǎng)性能，顯著降低了腸道炎癥因子增加率。熱應(yīng)激之前，在肉雞飼糧中添加GOD會(huì)引起腸道氧化應(yīng)激和炎癥因子的產(chǎn)生，激活免疫系統(tǒng)并刺激機(jī)體產(chǎn)生代償效應(yīng)，從而防止熱應(yīng)激后腸道炎癥因子的迅速增加，使動(dòng)物免受嚴(yán)重傷害。

5 小結(jié)與展望

GOD在包括豬、雞和鴨等多種動(dòng)物上的應(yīng)用效果已得到廣泛的研究，其催化過程中耗氧、產(chǎn)酸以及產(chǎn)過氧化氫的特性賦予了它在動(dòng)物體外發(fā)揮的抑菌保鮮作用以及在動(dòng)物體內(nèi)的促生長(zhǎng)、助消化、提高繁殖性能、改善肉質(zhì)、抗氧化、提高免疫水平、改善腸道健康以及緩解應(yīng)激的效果。目前，GOD在動(dòng)物飼料中的使用還存在著一些問題，有待通過進(jìn)一步研究提升其應(yīng)用效果：1)GOD的來源、酶學(xué)性質(zhì)以及使用GOD的動(dòng)物品種、年齡、飼糧組成等都會(huì)影響GOD在動(dòng)物中的應(yīng)用效果。因此，在對(duì)不同動(dòng)物使用不同來源的GOD時(shí)，應(yīng)當(dāng)遵循規(guī)定的使用劑量或進(jìn)行合理的試驗(yàn)以確定適宜劑量。2)GOD發(fā)揮作用時(shí)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)氧化劑過氧化氫，飼糧中單獨(dú)添加過量的GOD可能會(huì)使機(jī)體局部氧化應(yīng)激水平升高從而降低其有益效果。因此，需要研究GOD與一些能夠減輕機(jī)體氧化應(yīng)激水平的飼料添加劑(如植物提取物、益生菌和CAT等)的合理配伍，以提升GOD在飼料中的應(yīng)用價(jià)值。3)部分飼料加工步驟(如膨化、制粒等)中的高溫環(huán)境以及動(dòng)物消化道內(nèi)的低pH、胃蛋白酶及胰蛋白酶等的消化會(huì)破壞酶制劑的正常結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其功能。為得到更適合作為飼料添加劑的GOD，可發(fā)掘耐酸、耐熱、耐受蛋白酶消化的新酶或基于工程技術(shù)對(duì)現(xiàn)有酶進(jìn)行合理改造。