趙玉超 余詩強(qiáng) 蔣林樹

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

與單胃動物腸道微生物在消化養(yǎng)分上的角色不同，瘤胃微生物群落的組成和功能更加復(fù)雜，這使得反芻動物能夠消化植物纖維。瘤胃微生物的功能與宿主生理狀況密切相關(guān)，如其發(fā)酵飼料所產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)能為宿主提供能量、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成以及調(diào)節(jié)瘤胃上皮發(fā)育等[1]。由于反芻動物對其微生物的典型依賴，瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)被認(rèn)為是了解宿主與微生物之間生態(tài)和進(jìn)化關(guān)系的理想模型。

然而，瘤胃微生物也是溫室氣體(greenhouse gas，GHG)之一甲烷(CH4)的主要“貢獻(xiàn)者”。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)估計(jì)，2050年人類對肉類和奶產(chǎn)品的需求將比2010年分別提高73%和58%[2]。動物生產(chǎn)帶來的GHG排放已成為生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。CH4是全球第二大GHG，其增溫效應(yīng)是二氧化碳(CO2)的28倍。Maasakkers等[3]估算，2010—2015年，全球平均每年CH4排放量約為548百萬t，其中100百萬～117百萬t來源于畜禽飼養(yǎng)，而后者的約95%來自于反芻動物生產(chǎn)[4]。瘤胃CH4排放不僅加劇了溫室效應(yīng)，同樣也造成了飼料能量浪費(fèi)，CH4能量損失占到反芻動物飼糧總能的2%～12%[5]，是反芻動物生產(chǎn)效率低下的原因之一[6]。因此，瘤胃CH4減排對反芻動物生產(chǎn)具有重要的生態(tài)和營養(yǎng)意義。

天然植物功能組分在調(diào)控瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)、降低瘤胃CH4生成、改善宿主健康和生產(chǎn)性能方面具有潛在作用[7-8]。最常見的天然植物功能組分是酚類化合物，其中最大的一類是類黃酮，其種類超過8 000種，且廣泛分布于各種植物中[9]。畜禽上的研究已證明，類黃酮具有抗氧化、抗菌和抗炎等生物活性[10]。諸多研究結(jié)果顯示，類黃酮還能夠通過抑制原蟲或產(chǎn)甲烷菌來降低瘤胃CH4排放，是潛在的CH4抑制劑。因此，揭示類黃酮在瘤胃內(nèi)的代謝規(guī)律及其與瘤胃微生物的相互作用，廣泛評價其抑制CH4效果，對應(yīng)用類黃酮作為瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑具有重要意義。

1 瘤胃代謝與CH4生成

瘤胃內(nèi)包含細(xì)菌、真菌、原蟲和古菌等大量微生物，在嚴(yán)格厭氧的環(huán)境中保持共生關(guān)系。飼糧碳水化合物可通過瘤胃微生物廣泛發(fā)酵產(chǎn)生多種最終產(chǎn)物，主要包括VFA、CO2、氫氣(H2)和CH4[11]。具體而言，瘤胃代謝可分為3個層級(圖1)：第1層級主要是纖維素和半纖維素的降解和代謝，微生物利用不同的糖基水解酶將這些聚合物分解成可溶的葡萄糖和戊糖等單體或低聚體[12]；第2層級中，可溶性糖通過特定方式進(jìn)入微生物細(xì)胞，通過糖酵解和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生各種有機(jī)酸、VFA及其他代謝物如CO2和H2[13]；最后1個層級是一些代謝物如乳酸、琥珀酸、H2和CO2，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丙酸、丁酸、乙酸和CH4等。

圖1展示了瘤胃CH4生成的關(guān)鍵途徑，其中最主要的第1條途徑是氫(H)還原CO2生成CH4，1 mol CO2和4 mol H2生成1 mol CH4和2 mol H2O，涉及7步反應(yīng)及一系列的輔酶因子和酶[14]。此途徑產(chǎn)生的CH4占到了CH4總產(chǎn)量的82%[15]，能夠有效降低H2的分壓，從而有利于持續(xù)發(fā)酵[14]。第2條途徑是利用乙酸鹽作為底物，雖然乙酸鹽在瘤胃內(nèi)含量較高，但乙酸發(fā)酵型產(chǎn)甲烷菌——甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)的生長速率較低，瘤胃流出率較高，且乙酸鹽與H的結(jié)合力較低，因此，乙酸鹽對CH4排放的貢獻(xiàn)較小[16]。第3條途徑是甲基化合物如甲醇、甲胺等作為供體，此途徑產(chǎn)生的CH4占瘤胃總排放量的3%～5%[17]。

Methanol：甲醇；Acetate：乙酸；Butyrate：丁酸；Propionate：丙酸；Lactate：乳酸；Succinate：琥珀酸；Hydrogenotrophs：氫營養(yǎng)菌；Formate：甲酸；Formyl-MF：甲酰甲烷呋喃 formylmethanofuran；Formyl-H4SPt：甲酰四氫八疊蝶呤 formyl-tetrahydrosarcinapterin；Methenyl-H4SPt：甲川四氫八疊蝶呤 methenyl-tetrahydrosarcinapterin；Methylene-H4(S)Pt：甲叉四氫(八疊)蝶呤 methylene-tetrahydro(sarcina)pterin；Methyl-H4SPt：甲基四氫八疊蝶呤 methyl-tetrahydrosarcinapterin；Methyl-SCoM：甲基輔酶M methyl-coenzyme M；Methylotrophs：甲基營養(yǎng)菌；Methythiol：甲硫醇；Methylamine：甲胺；Acetoclastic methanogens：乙酸發(fā)酵產(chǎn)甲烷菌；Acetyl-Pi：乙酰磷酸 acetyl phosphate；Acetyl-CoA：乙酰輔酶A。

所有產(chǎn)甲烷菌都是古菌廣古菌門(Euryarchaeota)的成員，包括7個目、28個屬和113個種[11]，其中目水平上甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷馬賽球菌目(Methanomassiliicoccales)和甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)在瘤胃中最常見[18]；而甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)是瘤胃中最主要的產(chǎn)甲烷菌，占古菌群落的比例可高達(dá)70%[20]。目前，從瘤胃中分離得到的產(chǎn)甲烷菌種只有少數(shù)一部分，如反芻獸甲烷短桿菌(Methanobrevibacterruminantium)、米氏甲烷短桿菌(Methanobrevibactermillerae)、奧氏甲烷短桿菌(Methanobrevibacterolleyae)、甲酸甲烷桿菌(Methanobacteriumformicicum)、布氏甲烷桿菌(Methanobacteriumbryantii)、活動甲烷微菌(Methanomicrobiummobile)、奧蘭湯基甲烷囊菌(Methanoculleusolentangyi)、史氏甲烷短桿菌(Methanobrevibactersmithii)和甲烷八疊球菌(Methanosarcinaspp.)[11]。根據(jù)瘤胃生成CH4的途徑，可將產(chǎn)甲烷菌分為3類，包括氫營養(yǎng)菌(利用H還原CO2或甲酸鹽生成CH4)、甲基營養(yǎng)菌(利用甲基化合物)和乙酸發(fā)酵產(chǎn)甲烷菌(利用乙酸作為前體)。

2 類黃酮的分類與特性

類黃酮，又名黃酮類化合物，因?qū)θ撕蛣游锞哂薪】狄嫣幎鴱V受關(guān)注。大多數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明，類黃酮具有多種生物活性，包括清除自由基、抗炎、抗誘變、抗癌、抗過敏和抗氧化等[21]。類黃酮結(jié)構(gòu)特征是由2個芳環(huán)(A環(huán)和B環(huán))和1個含氧的3碳環(huán)(C環(huán))組成的15個碳(C6—C3—C6)骨架，通過重排、烷基化、氧化和糖基化進(jìn)行廣泛修飾。根據(jù)類黃酮的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)再劃分為亞類，其中最常見的是黃烷醇、黃酮、黃酮醇、異黃酮、黃烷酮和花青素等(表1)[22]。在大多數(shù)類黃酮(黃烷醇、花青素、黃烷酮和黃酮醇)中，B環(huán)都連接于C環(huán)的2號碳原子，而異黃酮例外，B環(huán)連接于C環(huán)的3號碳原子。由于A環(huán)和B環(huán)的羥基化、甲基化或糖基化不同，進(jìn)而每個亞類衍生出了數(shù)量龐大的類黃酮，且主要以糖苷形式存在各種植物中。

3 類黃酮在瘤胃內(nèi)的代謝

3.1 代謝特點(diǎn)

瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)具有巨大的代謝能力，可以推斷類黃酮在瘤胃內(nèi)發(fā)生的許多反應(yīng)與瘤胃微生物直接相關(guān)。但目前為止，類黃酮在反芻動物體內(nèi)的代謝動力學(xué)及與瘤胃微生物的交互作用相關(guān)研究還很少，對于哪些瘤胃微生物可降解哪些類黃酮仍缺乏系統(tǒng)認(rèn)知。圖2總結(jié)了槲皮素、芹菜素、兒茶素、大豆苷元和染料木素在瘤胃中可能存在的轉(zhuǎn)化過程。類黃酮在動物消化道內(nèi)代謝可能涉及O-和C-脫糖基化、脫甲基、脫羥基、酯裂解、碳碳雙鍵還原、異構(gòu)化、環(huán)裂變、脂肪碳鏈延伸和截斷和脫羧等[23-24]。這些反應(yīng)將類黃酮轉(zhuǎn)化為簡單的酚酸，從而增強(qiáng)類黃酮的功能特性，同時改善其在胃腸道內(nèi)的生物學(xué)利用率[25]。Berger等[26]發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物通過降解糖苷鍵提高了蘆丁(槲皮素-3-O-蘆丁苷)的生物學(xué)利用率。脫糖基化導(dǎo)致槲皮素的釋放，且在非泌乳奶牛的血漿中檢測到了槲皮素及其甲基化(異鼠李亭、怪柳素)和脫羥基化(山奈酚)衍生物。Berger等[27]在體外進(jìn)一步研究了槲皮素(100 μmol/L)在非泌乳奶牛瘤胃液中的降解特點(diǎn)，結(jié)果表明90%的槲皮素在5 h內(nèi)降解，產(chǎn)物主要為4-二羥基苯乙酸、甲基兒茶酚和間苯三酚。Cui等[28]則在泌乳奶牛飼糧中添加蘆丁(3 mg/kg DM)，發(fā)現(xiàn)瘤胃液中蘆丁和槲皮素濃度在飼喂8 h后降至對照組(不添加)水平，而2種化合物在十二指腸中濃度逐漸升高。

3.2 類黃酮與瘤胃微生物的互作

類黃酮在瘤胃內(nèi)可能產(chǎn)生與母體化合物生物活性不同的產(chǎn)物，進(jìn)而影響宿主健康[29]；瘤胃微生物組成的個體差異也可能產(chǎn)生不同的類黃酮代謝物[30]，這2種因素同時增加了研究的復(fù)雜性。研究表明，可轉(zhuǎn)化類黃酮的腸道優(yōu)勢菌群主要是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)等[30]，而這4個門也是瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌群[31-32]。特別是，厚壁菌門中的毛螺菌科(Lachnospiraceae)可對各種類黃酮進(jìn)行O-和(或)C-脫糖基化和裂解[29]。此外，類黃酮聚合物分解產(chǎn)生的單體可能會發(fā)揮抑菌作用，抑制產(chǎn)甲烷菌和(或)原蟲。因此，未來的研究目標(biāo)需要將特定瘤胃微生物與類黃酮作用相關(guān)的代謝表型聯(lián)系起來，進(jìn)而建立類黃酮代謝與微生物的具體聯(lián)系，同時還需要針對已經(jīng)報道的菌種或分離新的菌種以鑒定各種類黃酮轉(zhuǎn)化菌。

表1 類黃酮的分類及其代表性化合物參考

3.3 生物學(xué)利用率和瘤胃內(nèi)轉(zhuǎn)化

類黃酮在瘤胃內(nèi)的代謝可能直接影響到母體化合物在體內(nèi)的生物學(xué)利用率。單胃動物上明確了小腸是單體類黃酮吸收的主要部位，從聚合類黃酮中分離出來的單體類黃酮被腸道菌群脫糖基后在小腸遠(yuǎn)端和大腸中被吸收[33]。在反芻動物上，尚不清楚類黃酮是否能夠被瘤胃上皮吸收。但根據(jù)前人的研究，血漿類黃酮濃度的峰值出現(xiàn)在槲皮素瘤胃內(nèi)給藥30～35 min時或采食富含異黃酮的飼糧1 h時[26,34]?？紤]到飼糧在瘤胃內(nèi)的停留時間遠(yuǎn)超1 h，因此，可能有部分類黃酮在瘤胃中被吸收[28,35]。Gohlke等[36]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)十二指腸灌注槲皮素后，奶牛血漿總黃酮醇濃度增加。因此，從瘤胃流出的類黃酮還可能會進(jìn)一步被小腸吸收。類黃酮吸收后會被轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，形成葡糖苷酸、硫酸鹽或甲基結(jié)合化合物，最后隨糞便或尿液排泄出去[24]。

圖2 類黃酮在瘤胃內(nèi)可能的轉(zhuǎn)化過程

類黃酮的生物活性取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)、吸收率、分布和消除水平[37]。與其他亞類相比，異黃酮和黃酮醇在單胃動物中的生物學(xué)利用率更高，而花青素的生物學(xué)利用率較低[38]。反芻動物則不同，其對花青素生物學(xué)利用率則明顯高于其他亞類[39]。Berger等[26]使用非泌乳奶牛比較了槲皮素的2種形式即配糖體(槲皮苷)和葡萄糖鼠李糖苷蘆丁的體內(nèi)(口服或靜脈插管2種方式)代謝動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖鼠李糖苷蘆丁的生物學(xué)利用率顯著高于槲皮苷，這可能是由于槲皮苷可在瘤胃內(nèi)迅速降解，這一結(jié)果與單胃動物相反。有趣的是，Berger等[27]比較上述2種化合物在犢牛上的代謝(隨初乳和代乳粉飼喂)，結(jié)果顯示槲皮苷的生物學(xué)利用率高于葡萄糖鼠李糖苷蘆丁。這些矛盾的結(jié)果表明了動物胃腸道結(jié)構(gòu)及微生物區(qū)系差異可能會對黃酮物質(zhì)吸收代謝產(chǎn)生不同的結(jié)果，進(jìn)而會對瘤胃發(fā)酵、免疫調(diào)節(jié)和生產(chǎn)性能產(chǎn)生差異化現(xiàn)象，這也再次突顯了深入研究類黃酮在瘤胃內(nèi)代謝吸收的重要性。

4 類黃酮對瘤胃CH4排放及相關(guān)菌群的調(diào)控作用

類黃酮通過抑制細(xì)胞質(zhì)膜功能、抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、抑制核酸合成或抑制能量代謝來抑制微生物[40]，其抑菌潛力取決于羥基的數(shù)量、位置及脂肪族和糖基的存在。反芻動物攝入黃酮后，部分類黃酮可代謝為VFA[28,41]，進(jìn)而改變瘤胃菌群[42]。Balcells等[43]研究顯示，在飼喂高精料飼糧的肉牛瘤胃瘺管中添加柑橘黃酮(300 mg/kg DM)可提高瘤胃乳酸利用菌埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)的數(shù)量，降低乙酸/丙酸值，減少酸中毒的風(fēng)險。而Seradj等[44]使用柑橘黃酮或其主要單體類黃酮也觀察到了一致的結(jié)果。這表明類黃酮對瘤胃代謝具有一定的調(diào)控作用，而其是否能夠降低CH4排放是本部分重點(diǎn)討論的內(nèi)容。表2和表3分別從單體類黃酮和植物提取物2個層面總結(jié)了類黃酮調(diào)控瘤胃發(fā)酵和CH4排放的研究進(jìn)展。

4.1 單體類黃酮

前人針對不同單體類黃酮降低瘤胃CH4排放做了很多篩選工作。Oskoueian等[25]比較了黃酮、楊梅黃酮、柚皮苷、兒茶素、蘆丁和山奈酚等6種單體類黃酮(45 g/kg)對體外瘤胃發(fā)酵的影響，結(jié)果顯示柚皮苷和槲皮素在抑制原蟲和產(chǎn)甲烷菌、降低CH4產(chǎn)量上作用最為顯著，且不影響干物質(zhì)降解率和瘤胃發(fā)酵；而另一項(xiàng)評估8種單體類黃酮的體外試驗(yàn)中，僅發(fā)現(xiàn)木犀草苷對CH4有顯著抑制效果，且8種化合物對瘤胃微生物均沒有影響[45]。類似的，Leiber等[46]發(fā)現(xiàn)蘆丁可以減少體外CH4產(chǎn)量占總產(chǎn)氣量的比例，但對瘤胃細(xì)菌和原蟲數(shù)量均沒有影響。以上研究說明，不同的類黃酮單體對瘤胃微生物、發(fā)酵參數(shù)和CH4排放的效果存在差異，這可能與其結(jié)構(gòu)相關(guān)。與上述篩選結(jié)果不同的是，Berger等[27]和Andrés等[47]則報道體外添加槲皮素對瘤胃總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量均沒有顯著影響。體內(nèi)研究方面，López-Campos等[42]在羔羊飼糧中添加柚皮苷(1.5 g/kg)顯著影響了瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，但并未分析菌群組成及瘤胃發(fā)酵。最近一項(xiàng)研究中，Jiménez-Ocampo等[48]首次評估了柚皮苷瘤胃瘺管給藥(1.5和3.0 g/kg DM)對肉牛瘤胃發(fā)酵和CH4排放的影響，結(jié)果顯示均沒有顯著影響。Stoldt等[49]在奶牛上的研究也得到類似結(jié)果。這說明，即使是添加單體類黃酮也可能在體內(nèi)和體外、試驗(yàn)動物種類之間產(chǎn)生矛盾的試驗(yàn)結(jié)果。未來的研究應(yīng)注重比較不同類黃酮單體之間組合添加的效果。

4.2 富含類黃酮的植物提取物

植物提取物通常含有多種類黃酮化合物，在調(diào)控瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)中具備“組合效應(yīng)”。Broudiscou等[50]篩選了黃酮含量較高的13種植物提取物，評定了其在連續(xù)培養(yǎng)中對瘤胃發(fā)酵和產(chǎn)CH4的影響，發(fā)現(xiàn)真實(shí)薰衣草(Lavandulaofficinalis)和毛果一枝黃花(Solidagovirga-aurea)促進(jìn)了瘤胃發(fā)酵，而問荊(Equisetumarvense)和藥用鼠尾草(Salviaofficinalis)則降低了產(chǎn)CH4量。在另一項(xiàng)研究中，Broudiscou等[51]比較了真實(shí)薰衣草和問荊提取物及異槲皮甙(一種存在于問荊植物中的類黃酮)在連續(xù)的體外瘤胃培養(yǎng)中對發(fā)酵參數(shù)和CH4的影響，結(jié)果表明添加提取物提高了乙酸和丙酸產(chǎn)量，其中真實(shí)薰衣草的增幅效果分別為60%和37%，問荊的增幅效果分別為59%和40%，而異槲皮苷的增幅較低，分別為29%和15%，且問荊趨向于抑制CH4生成。因此，含有類黃酮的植物提取物減少CH4產(chǎn)生的同時，也可促進(jìn)微生物發(fā)酵。Tavendale等[52]使用反芻獸甲烷短桿菌(菌株號分別為DSM1093和YLM-1)進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加源自Lotuspedunculatus的黃酮醇(0.25 mg/L)使得28%的DSM1093菌株生長受到抑制，且降低了CH4產(chǎn)量；而菌株YLM-1并未受到顯著影響，這也表明類黃酮對產(chǎn)甲烷菌有直接影響。

表2 單體類黃酮對瘤胃CH4排放和瘤胃發(fā)酵的影響

此外，同樣采用類黃酮含量較高的植物提取物，如沙棘黃酮[53]、桉樹黃酮[54]、石榴黃酮[55]和桑葉黃酮[56]，也觀察到體外或體內(nèi)瘤胃CH4產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷菌豐度下降。而一些針對類黃酮提取物的研究中CH4產(chǎn)量和古菌等變化出現(xiàn)了不一致的響應(yīng)，如Szulc等[57]發(fā)現(xiàn)，體外添加高劑量的楊梅黃酮-3-O-半乳糖苷的混合提取物降低了瘤胃古菌豐度，但并沒有減少CH4排放；而Ramos-Morales等[58]則觀察到甘草黃酮降低了CH4排放，但對細(xì)菌和古菌組成沒有影響。這可能是由于瘤胃微生物對不同的類黃酮的適應(yīng)性差異導(dǎo)致的。蜂膠黃酮也是關(guān)注度較高的類黃酮來源。蜂膠是蜜蜂從植物芽、花和分泌物中采集的樹脂、膠和香脂物質(zhì)的復(fù)雜混合物，然后與唾液分泌物、蠟和花粉?；旌隙蒣59]。與其他種類蜂膠相比，紅蜂膠具有較高的異黃酮。體外試驗(yàn)表明，蜂膠黃酮具有抑制CH4排放的效果[59-60]。體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)，妊娠母羊飼糧中添加3 g/d的紅蜂膠提取物顯著降低了CH4排放量，且對瘤胃VFA具有促進(jìn)作用[61]。

5 開發(fā)類黃酮作為CH4抑制劑需要進(jìn)一步研究的問題

雖然一些研究表明，類黃酮表現(xiàn)出改善瘤胃發(fā)酵、降低CH4產(chǎn)量和提高飼料效率的潛力[62-63]，但現(xiàn)有研究仍不足以支撐這些化合物可以用于實(shí)際生產(chǎn)。黃酮對瘤胃微生物的作用方式、最佳添加劑量和使用條件仍有待闡明[64]。對于如何解釋不同研究之間的相互矛盾或無法重現(xiàn)的結(jié)果，則需要動物營養(yǎng)學(xué)家進(jìn)一步研究影響黃酮調(diào)控效果的因素。

5.1 類黃酮來源

黃酮的類型和含量在植物物種之間存在巨大差異，同一物種的不同品種、生態(tài)型、栽培品系或單株植物之間，甚至同植物的各個部位之間都有很大不同，進(jìn)而對瘤胃微生態(tài)產(chǎn)生不同差異[46]。這種變異性與植物(如遺傳、年齡、成熟度、氣候)、環(huán)境因素(如植物生長的條件)、農(nóng)藝(如栽培和收獲)或加工(如植物提取物的生產(chǎn)、儲存、穩(wěn)定性)等因素相關(guān)[65]。對于植物提取物而言，使用的提取溶劑及其稀釋濃度和提取條件(如時間和溫度)都可能會影響粗提物中類黃酮的濃度和活性。如Boussaada等[54]發(fā)現(xiàn)，不同溶劑提取的富含類黃酮的桉樹提取物對體外瘤胃CH4生成影響不同。因此，首先應(yīng)考慮的是對發(fā)揮作用的類黃酮進(jìn)行最終鑒定和表征，只有對類黃酮單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，才有可能確保抑制CH4效果是由某類黃酮物質(zhì)引起的，而使用植物材料或提取物時，往往其具體成分未經(jīng)分析確認(rèn)，并且其在瘤胃中效果被認(rèn)為是先前報道且通常存在的化合物引起的，這類研究往往價值較低。

5.2 最適劑量

類黃酮在減少或抑制CH4生成方面的作用是劑量依賴性的。在低劑量下，這些化合物對瘤胃發(fā)酵幾乎沒有影響，達(dá)到最佳劑量后，繼續(xù)添加可能不再發(fā)揮抑制作用。前文體內(nèi)體外研究及不同種試驗(yàn)動物之間抑制CH4效果產(chǎn)生的較大差異也提示，應(yīng)在同種試驗(yàn)條件下對提取物和單體類黃酮進(jìn)行比較驗(yàn)證。如Seradj等[44]在體外條件下，比較了柑橘黃酮及其6種單體(200 μg/g DM)，發(fā)現(xiàn)除了新北美圣草苷和柚皮苷外，均能降低瘤胃CH4產(chǎn)量，說明聚合物和單體在抑制CH4上可能具有不同的劑量閾值。而Stoldt等[49]發(fā)現(xiàn)蕎麥種子提取物及其主要類黃酮單體蘆丁(100 mg/kg BW)均不影響泌乳奶牛CH4排放，可能是蘆丁在瘤胃內(nèi)存留時間較短，不足以發(fā)揮抑CH4作用。因此，在商業(yè)化應(yīng)用之前，必須為每種類黃酮精確添加劑量，同時兼顧成本，以減少CH4產(chǎn)量而不會對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響。

5.3 瘤胃微生物適應(yīng)性

從前文和表2和表3可以看出，體外研究得到的效果比體內(nèi)研究更明顯，這很可能是因?yàn)轭慄S酮在分批或連續(xù)培養(yǎng)中分布更均勻，微生物能更快地接觸到化合物的活性。鑒于影響瘤胃稀釋率的因素較多，瘤胃內(nèi)食糜會快速流出，因此很難確定黃酮在瘤胃內(nèi)達(dá)到有效作用的所需劑量[66]。通常，植物活性物質(zhì)只有在連續(xù)添加后才能在瘤胃中達(dá)到穩(wěn)定濃度進(jìn)而發(fā)揮作用[67]。相比之下，一些體內(nèi)長期研究表明，添加類黃酮等活性物質(zhì)后，對瘤胃發(fā)酵的影響隨時間延長而減弱[48]，這可能是由于瘤胃微生物對黃酮的適應(yīng)性。適應(yīng)機(jī)理可能涉及瘤胃內(nèi)活性分子的降解或中和，或微生物對化合物的耐受或抗性機(jī)制的發(fā)展[68]。在這種情況下，CH4產(chǎn)量的減少可能是類黃酮最初表現(xiàn)出抗菌活性的短暫結(jié)果，這應(yīng)該是大多數(shù)體內(nèi)研究中降低CH4影響持續(xù)性有限的主要原因。而開發(fā)具有持久效果的類黃酮添加劑就有必要研究瘤胃微生物對黃酮的適應(yīng)過程和機(jī)理。

6 小 結(jié)

類黃酮在天然植物中分布廣泛，具有多種生物活性，是未來畜牧生產(chǎn)中極具潛力的飼料添加劑?，F(xiàn)有研究證明，類黃酮在反芻動物瘤胃微生物生態(tài)系統(tǒng)調(diào)控，特別是抑制CH4生成中發(fā)揮重要作用，未來的研究應(yīng)集中在類黃酮的精準(zhǔn)定性定量、瘤胃內(nèi)代謝和吸收規(guī)律、代謝產(chǎn)物與微生物之間的相互作用和瘤胃微生物的適應(yīng)性，以進(jìn)一步改進(jìn)類黃酮降低瘤胃CH4排放，改善瘤胃內(nèi)環(huán)境的效果。