倪堅軍 周中元 蔡鑫君

結(jié)核病由結(jié)核桿菌感染引起，主要侵襲患者肺部，故又稱為肺結(jié)核[1-2]。肺結(jié)核患者中，約45.5%～63.3%合并支氣管內(nèi)膜結(jié)核，由于臨床表現(xiàn)不明顯，誤診、漏診率高，易造成不可逆性支氣管狹窄，嚴重者將造成呼吸困難、肺不張及繼發(fā)性肺炎等惡性結(jié)局[3-5]。支氣管結(jié)核病灶伴有廣泛纖維增生，周圍血管分布稀少，血運不良，嚴重影響藥物的滲入，藥物治療效果不佳[6-8]。而原位凝膠不需要有機溶劑或共聚反應試劑，組織相容性良好，具有生物黏附性及溶液-半固態(tài)凝膠轉(zhuǎn)變性質(zhì)等特點，且制作工藝簡便、應用方便、在用藥部位滯留時間長及有良好緩釋作用，近年來已被選擇作為諸多藥物載體[9-10]。異煙肼是抗結(jié)核治療藥物的首選，為克服結(jié)核患部血供不足、藥物難以進入、難以達到抗結(jié)核治療有效藥物濃度的困難[11-12]，本研究以泊洛沙姆188（P188）和泊洛沙姆407（P407）為輔料，制備異煙肼溫敏型原位凝膠，用于經(jīng)纖維支氣管鏡介入治療給藥，以提高異煙肼在結(jié)核病灶中的停留時間和藥物濃度，為支氣管結(jié)核的臨床治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料BALB/c小鼠，雄性，4～6周齡，（20±2）g；SD大鼠，雄性，約250 g；兩者均購自上海斯萊克公司，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心統(tǒng)一飼養(yǎng)，（22±2）℃，濕度50%～60%，14 h光照/10 h黑暗，換風15～20次/h。異煙肼標準品購自中國食品藥品檢定研究院，批號：100578- 201502；異煙肼原料藥購自上海源葉生物科技有限公司，批號：R21A6T1；P188（批號：WPDI608B）、P407（批號：WPMI556B）、透析袋（截留相對分子質(zhì)量8 000～14 000，型號：MD34）購自上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司；熒光標志物Cy5.5 NHS ester購自杭州邦易化工有限公司，批號：H1824065。

1.2 方法

1.2.1 異煙肼溫敏型原位凝膠制備及膠凝溫度測定采用冷溶法[13]制備異煙肼溫敏型原位凝膠。稱取處方量的異煙肼、P407和P188，加入適量純化水使溶解，混合均勻；4℃放置24 h，充分溶脹后去除氣泡，得到澄清透明、分散均勻的異煙肼溫敏型原位凝膠。采用倒置法[14]測定膠凝溫度。制備好的異煙肼溫敏型原位凝膠溶液置于西林瓶中，在水浴中慢慢加熱，水浴溫度從35℃開始以1℃/min速度升溫，每升溫1℃即取出西林瓶，倒置觀察是否形成凝膠，直到西林瓶中的所有溶液全部變成凝膠，記錄此時溫度，每個樣品重復3次。

1.2.2 原位凝膠處方的優(yōu)化采用星點設計-響應面法對異煙肼溫敏型原位凝膠處方進行優(yōu)化。以P407、P188的質(zhì)量分數(shù)為自變量（A和B），取值范圍分別為20%～30%和0～6%；以膠凝溫度（T）為因變量。根據(jù)星點設計原理，兩因素一指標時，每個因素設5個水平，分別為±α、±1和0（α=1.414），見表1。采用Design-Expert 10.0.3軟件進行二元多項式回歸方程擬合，軟件擬合的回歸方程為T=132.823-6.464A+1.992B+0.066AB+0.088A2-0.364B2（R2=0.947 1），各項方差分析結(jié)果顯示模型P＜0.01時認為該模型可靠有效。

表1 星點設計及響應值

采用Design-Expert 10.0.3軟件生成二維等高線圖，得到備選處方；利用1.2.1方法制備異煙肼溫敏型原位凝膠并測定膠凝溫度，與預測值比較，計算偏差=（預測值-實測值）/預測值×100%。偏差最小的處方確定為最優(yōu)處方。

1.2.3 優(yōu)化處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠中異煙肼含量測定采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）法測定異煙肼溫敏型原位凝膠中異煙肼的含量。色譜條件：Agilent SB-C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/L磷酸氫二鈉（pH 6.0）-甲醇（體積比85∶15），流速1.0 ml/min，柱溫35℃，檢測波長262 nm，進樣量10 μl。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；以350℃氮氣作為干燥氣，控制流速及霧化器壓力分別為12 ml/min，241.3 kPa，毛細管及解離能量分別為4 000 V及100 eV，碰撞能量36 eV及28 eV。在多反應檢測模式下檢測離子濃度，停留時間設置為550 ms。利用異煙肼標準品制備1.015 g/L的標準貯備液，用流動相分別稀釋成1015.00、507.50、304.50、203.00、101.50、81.20、60.90、40.60、20.30、10.15 mg/L的異煙肼標準溶液，利用LC-MS/MS法分別檢測各標準溶液的峰面積，建立異煙肼質(zhì)量濃度的標準曲線。利用LC-MS/MS方法測定優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠的峰面積，根據(jù)標準曲線計算凝膠中異煙肼質(zhì)量濃度。

1.2.4 精密度、重復性和穩(wěn)定性試驗精密移取高（1 000 mg/L）、中（90 mg/L）、低（8 mg/L）3個不同濃度標準品溶液，采用LC-MS/MS測定各對照品溶液的峰面積，連續(xù)測定5 d，計算日內(nèi)和日間精密度。精密配制異煙肼原位凝膠溶液，濃度約為110 mg/L共5份，檢測每份樣品的峰面積，分析該測定方法的重復性。檢測同一份異煙肼原位凝膠溶液放置0、1、2、4、8、12、24 h后的峰面積，考察異煙肼原位凝膠溶液的穩(wěn)定性。重復性、精密度等試驗要求相對標準偏差（relative standard deviation,RSD）不超過2.0%。

1.2.5 異煙肼溫敏型原位凝膠體外釋放試驗精密吸取5 ml異煙肼溫敏型原位凝膠加入透析袋內(nèi)，扎緊袋口，放入裝有100 ml PBS[pH 7.4，（37±1）℃]溶液的廣口瓶中。采用LC-MS/MS法測定不同時間點（15、30、45、60、75、90、120、150、180、240、270、300 min）PBS溶液中異煙肼的濃度，計算相對累積釋放率。以異煙肼水溶液為對照。利用零級動力學方程、一級動力學方程、Weibull方程等對異煙肼溫敏型原位凝膠體外溶蝕曲線進行擬合。

1.2.6 異煙肼溫敏型原位凝膠藥效學研究采用小鼠活體成像實驗。取6只BALB/c小鼠，隨機分成A組和B組，每組3只。A組使用Cy5.5 NHS ester標記的異煙肼溫敏型原位凝膠，B組使用Cy5.5 NHS ester標記的異煙肼水溶液。利用氣管注射給藥，20 μl/只，具體操作如下：小鼠麻醉后，嘴巴張開固定，將Exel SafeletⅣ導管插入氣管，取出導管上的針頭，將小鼠移入生物安全柜，用吸管將異煙肼原位凝膠或異煙肼水溶液注入導管開口，小鼠吸入凝膠或水溶液后，取出導管，將小鼠置于加熱燈下恢復。給藥完成后觀察小鼠狀態(tài)，于0、0.5、1、2、4、7、72 h時拍攝，檢測Cy5.5 NHS ester熒光分布、強度及小鼠生理情況。

1.2.7 異煙肼溫敏型原位凝膠藥動學研究取10只SD大鼠隨機分為A組和B組，每組5只。A組使用異煙肼溫敏型原位凝膠，B組使用異煙肼水溶液，氣管注射給藥，注射劑量為16 mg/kg（按異煙肼劑量計算），200 μl/只。分別于給藥后15、30、60、120、180、240、360 min時眼眶取血，離心后取上層血漿，利用LC-MS/MS法檢測兩組大鼠血漿中異煙肼質(zhì)量濃度，繪制血漿異煙肼質(zhì)量濃度-時間曲線圖，利用WinNolin軟件計算異煙肼溫敏型原位凝膠的藥動學參數(shù)。

1.2.8 大鼠血樣中異煙肼含量的測定利用LC-MS/MS法，色譜條件與1.2.3一致。精密稱取異煙肼標準品10.05 mg，用純化水溶解，定容至10 ml，制成1.005 g/L的儲備液，將儲備液分別稀釋為10.05、20.10、40.20、100.50、201.00、502.50 mg/L的異煙肼標準液。精密量取空白血漿200 μl于離心管，再加l00 μl上述不同濃度的異煙肼標準液，加700 μl甲醇沉淀蛋白，配制成濃度為1.005、2.010、4.020、10.05、20.10、50.25 mg/L的溶液。將上述溶液旋渦混合1 min后，用高速離心機（5 000 r/min）離心8 min后，取上清液，過0.22 μm的濾膜后，進樣。利用測得峰面積與配制的異煙肼血漿標準溶液濃度計算線性回歸方程。精密量取樣品血漿100 μl于離心管，加400 μl甲醇沉淀蛋白，旋渦混合1 min后，用高速離心機（5 000 r/min）離心8 min后，取上清液，過0.22 μm的濾膜。利用LCMS/MS法測定大鼠血漿的峰面積，計算大鼠血漿中的異煙肼含量。精密度、重復性、回收率實驗參考1.2.4。精密度、重復性、回收率等試驗要求RSD不超過2.0%。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t或SNK-q分析。采用Design-Expert 10.0.3軟件繪制自變量與因變量三維曲面圖及等值線圖。采用WinNonlin 6.4軟件計算藥代動力學參數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 異煙肼原位凝膠最優(yōu)處方的選擇當P188質(zhì)量分數(shù)恒定時，隨著P407質(zhì)量分數(shù)增大，膠凝溫度逐漸下降；當P407質(zhì)量分數(shù)恒定時，隨著P188質(zhì)量分數(shù)增大，膠凝溫度逐漸升高，見圖1。以略低于人體體溫的35℃作為膠凝溫度，生成3個優(yōu)化處方：處方1中P407質(zhì)量分數(shù)為25.0%、P188為3.5%；處方2中P407為24.0%、P188為2.2%；處方3中P407為23.0%、P188為1.3%。利用篩選出的3個處方制備異煙肼溫敏型原位凝膠，測定膠凝溫度，并利用回歸方程擬合對應的膠凝溫度。結(jié)果顯示，處方1即P407為25.0%、P188為3.5%時，膠凝溫度偏差最小，即處方1為最優(yōu)處方，見表2。

表2 異煙肼溫敏型原位凝膠處方膠凝溫度驗證

圖1 P407、P188質(zhì)量分數(shù)對膠凝溫度的影響（a：等高線圖；b：維曲面圖）

2.2 優(yōu)化處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠中異煙肼質(zhì)量濃度測定LC-MS/MS法測定優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠的含量，以A為峰面積，C為藥物濃度，得到線性回歸方程為A=17.221C-1.949 1（R2=1.000 0）。精密度檢測發(fā)現(xiàn)高（1 000 mg/L）、中（90 mg/L）、低（8 mg/L）3個濃度的異煙肼溶液RSD分別為0.103%、0.272%、0.471%；重復性考察發(fā)現(xiàn)檢測5份相同濃度的異煙肼溶液的RSD為0.550%，說明建立的方法符合方法學要求。穩(wěn)定性檢查發(fā)現(xiàn)檢測同一份異煙肼原位凝膠溶液放置0、1、2、4、8、12、24 h后的峰面積RSD為0.210%，表明制備的異煙肼溫敏型原位凝膠的含量在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 優(yōu)化處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠體外釋藥比較異煙肼水溶液在60 min時藥物已基本釋放完全，累積釋放百分率為94.40%；優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠在30 min時，累積釋放百分率為55.18%，120 min后釋藥曲線漸趨平穩(wěn)，累積釋放百分率為81.90%，300 min時累積釋放百分率為84.35%，見圖2。

圖2 異煙肼水溶液和異煙肼溫敏型原位凝膠的體外釋放曲線

2.4 異煙肼溫敏型原位凝膠的藥效學氣管注射后，兩組小鼠狀態(tài)良好，均未出現(xiàn)因阻塞氣道致死的情況。小鼠給藥后0、0.5、1、2、4、7、72 h的活體成像實驗結(jié)果表明，A組小鼠體內(nèi)的Cy5.5 NHS ester熒光信號較B組小鼠強。隨著時間延長，兩組小鼠體內(nèi)的熒光信號均逐漸降低，但A組降低速度慢于B組。給藥后0.5～4 h兩組小鼠熒光信號強度差異最大。檢測熒光信號分布情況發(fā)現(xiàn)，兩組熒光信號定位都較為準確，表明注射的藥物未出現(xiàn)脫離給藥部位情況，見圖3。

2.5 異煙肼溫敏型原位凝膠的藥動學以A為峰面積，C為藥物濃度，使用LC-MS/MS法建立的線性回歸方程為A=28.476C-16.45（R2=0.999），線性范圍為1.005～50.250 mg/L。精密度檢測發(fā)現(xiàn)高（50.250 mg/L）、中（10.050 mg/L）、低（2.010 mg/L）3個濃度的異煙肼血漿標準溶液的RSD分別為0.70%、1.20%、0.83%，重復性考察發(fā)現(xiàn)檢測5份相同濃度的異煙肼血漿標準溶液的RSD為1.050%，說明建立的方法符合方法學要求?；厥章蕦嶒灠l(fā)現(xiàn)精密移取適量的高、中、低質(zhì)量濃度的異煙肼血漿標準溶液，回收率平均為98.26%，RSD為1.610%。說明該方法適用于血漿中異煙肼含量的測定。

LC-MS/MS檢測發(fā)現(xiàn)兩組大鼠體內(nèi)異煙肼的藥物濃度均在給藥后30 min達峰，峰濃度分別為（40.28±0.43）和（6.35±0.63）mg/L（P＜0.05）；隨著給藥時間延長，兩組大鼠體內(nèi)異煙肼濃度逐漸降低，見圖4。計算兩組大鼠體內(nèi)異煙肼的藥代動力學參數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組大鼠體內(nèi)異煙肼的AUC0-∞是B組的2.82倍，B組的異煙肼清除率（CL）是A組的1.41倍，見表3。

表3 藥代動力學參數(shù)

圖4 異煙肼濃度-時間曲線

3 討論

結(jié)核病中肺結(jié)核最為常見，而其中有近一半為支氣管結(jié)核[15-16]。支氣管結(jié)核由結(jié)核桿菌感染引起，感染途徑分為肺結(jié)核病灶中直接植入支氣管黏膜和通過支氣管周邊組織直接侵及[17-19]。支氣管結(jié)核病治療周期長，傳統(tǒng)給藥方式下患者治療依從性較差，使得病菌產(chǎn)生耐藥性，加大治療難度[20-22]。采用原位凝膠進行治療，可使藥物緩慢釋放，無需頻繁給藥，提高治療效果。本研究通過星點設計-響應面法，以P407和P188為影響因素，膠凝溫度為因變量，對異煙肼溫敏型原位凝膠處方進行了優(yōu)化，彌補了原有凝膠制備方法中膠凝溫度高、毒性大的缺點。相比異煙肼水溶液，優(yōu)化處方后制備的異煙肼原位凝膠在小鼠體內(nèi)具有更高的藥物濃度，且清除率低，具有緩釋的效果，為臨床異煙肼治療支氣管結(jié)核提供了新思路。

P407及P188被用來優(yōu)化原位凝膠處方，使達到最佳凝膠溫度[23]。研究表明，凝膠溫度與P407質(zhì)量分數(shù)負相關(guān)，與P188質(zhì)量分數(shù)正相關(guān)[24-25]，與本研究結(jié)果相似，因此調(diào)節(jié)P407和P188在凝膠處方中的質(zhì)量分數(shù)可調(diào)節(jié)凝膠溫度。當P407質(zhì)量分數(shù)≤20%時，P188用量即使極低，膠凝溫度也高于人體正常體溫（37℃），而當P407質(zhì)量分數(shù)≥30%，P407無法完全溶脹，且膠凝溫度低于室溫（25℃），需大量P188才能達到較為理想的膠凝溫度。故本研究中設定P407質(zhì)量分數(shù)為20%～30%，P188為0～6%，避免了溶脹及用量過大等問題。星點設計-響應面法優(yōu)化異煙肼溫敏型原位凝膠處方并確定最優(yōu)處方中P407質(zhì)量分數(shù)為25.0%、P188質(zhì)量分數(shù)為3.5%，發(fā)生相轉(zhuǎn)變溫度為34.2℃。該溫度高于環(huán)境溫度且低于人體溫度，為異煙肼溫敏型原位凝膠應用提供了前提。

注：A組使用異煙肝溫敏型原位凝膠；B組使用異煙肼水溶液

作為治療支氣管結(jié)核藥物，異煙肼需從溫敏型原位凝膠中釋放，且在病灶部位停留較長時間，即藥物需要具備一定緩釋能力。本研究考察了優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠體外釋放及滯留能力，結(jié)果顯示給藥后120 min，凝膠中異煙肼累積釋藥率達84.35%，釋放時間長于水溶液（60 min）。異煙肼原位凝膠釋藥曲線符合Weibull方程，與張利竣等[24]研究相似，表明本研究制備的凝膠釋藥緩慢、持久，且釋藥完全。在使用時可使藥效充分發(fā)揮，減少用藥次數(shù)。小鼠活體成像結(jié)果也顯示該處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠安全性好，在給藥部位滯留時間長。藥動學研究發(fā)現(xiàn)，采用氣管注射方式給藥，相比水溶液，溫敏型原位凝膠血藥峰濃度較大，消除較慢，藥物代謝時間長，對支氣管結(jié)核的治療效果也更好[25]。本研究中，凝膠組異煙肼質(zhì)量濃度是水溶液組的6.3倍，之后隨著給藥時間的延長，兩組小鼠體內(nèi)異煙肼濃度逐漸降低，但其具體原因尚未完全明確，還需后續(xù)深入研究，探討其具體機制。

綜上所述，本研究優(yōu)化處方制備的溫敏型原位凝膠可提高藥物治療濃度，延長藥物維持時間，減少用藥次數(shù)，臨床價值較好，且能避免臨床上用藥不足、不按時及不足療程等問題。