王蓓 朱智瑞 胡智勇

現代麻醉學的出現與發(fā)展，使得數以萬計的患者能夠安全地耐受一些診斷性治療，平穩(wěn)渡過手術過程。早期研究認為全麻藥物誘導出的大腦鎮(zhèn)靜狀態(tài)具有可逆性，但是部分患者麻醉蘇醒后表現出譫妄、記憶力減退及較長時間的認知功能下降等癥狀，推測全麻藥物可能存在神經毒性。對嚙齒類及靈長類動物的研究結果證實：大腦尤其是未發(fā)育成熟的大腦暴露于全麻藥物，可能觸發(fā)中樞神經系統(tǒng)（central nervous system,CNS）形態(tài)及功能的長遠改變，并引起隨后的認知障礙、行為異常及情緒改變[1-3]。最近的一項薈萃分析結果顯示，接受單次全麻手術的兒童出現內化行為（包括抑郁、焦慮、身體不適和青少年自殺等狀態(tài)）的風險增加了47%，執(zhí)行功能障礙的風險增加了68%[4]，提示人類幼年麻醉暴露與認知、行為發(fā)育密切相關。腦發(fā)育涉及諸多復雜的細胞進程，包括神經發(fā)生、分化成特定的類型、遷移到特定的位置、形成突觸之間的精細化連接從而構成神經環(huán)路以及形成軸索、髓鞘等，這些進程具有時間特異性和持續(xù)性。人類神經發(fā)育的關鍵時期為妊娠晚期至嬰幼兒期，嚙齒類動物則為出生前2天至出生后2周內，因此全麻藥物的藥理學干擾在這些階段尤為顯著和持續(xù)。本文整理了全麻藥物對未成熟大腦神經毒性作用的最新研究進展，闡述未成熟大腦麻醉暴露的神經毒性機制，并對潛在的保護性策略作一綜述。

1 全麻藥物與認知功能障礙

1.1 動物研究Ikonomidou等[5]首次發(fā)現N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA）受體拮抗劑氯胺酮可導致神經元非正常凋亡，提示全麻藥物可能存在神經毒性。Jevtovic-Todorovic等[1]復合使用臨床兒科麻醉常見的幾種全麻藥物（包括咪達唑侖、氧化亞氮、異氟醚）以足夠耐受手術刺激的劑量對出生后第7天（postnatal day 7,P7）的小鼠處理6 h，小鼠成年后的水迷宮實驗和八臂迷宮實驗結果顯示，麻醉暴露組小鼠的空間學習和記憶能力要顯著弱于對照組，且在發(fā)育過程中伴隨大量神經元退化性凋亡與海馬突觸功能障礙。Talpos等[2]將與人類基因同源性高達94%的P5/P6恒河猴暴露于異氟醚與氧化亞氮的混合物中，待其7月齡時進行學習、記憶、顏色辨別和動機測試等認知訓練與測試評估，結果顯示麻醉組恒河猴在測試中反應能力和學習能力均顯著下降。該結果支持了早期長期麻醉可能會增加日后發(fā)生認知障礙風險的假設。嚙齒類[1，3，6]、魚類[7]及靈長類[2]等多種動物模型實驗均表明幾乎所有的臨床全麻藥物都可引起未成熟大腦的神經發(fā)育受損。

1.2 臨床研究臨床研究中通常以幼年時接受過手術麻醉暴露的兒童為暴露組，以當地同齡的健康兒童為對照組，通過比較兩組兒童學習成績或智力、行為發(fā)育量表測評等來評估兩組兒童的認知、行為等發(fā)育水平。對3歲前接受手術麻醉兒童的神經認知功能（包括語言的學習和表達能力、認知、行為以及運動功能等）的檢測顯示，接受過單次麻醉暴露的兒童發(fā)生認知障礙的概率是對照組的2.4倍，多次麻醉暴露組的兒童發(fā)生認知障礙的概率是對照組的3.5倍[8]。Wilder等[9]對4歲以前接受全身麻醉的兒童進行了回顧性研究，結果發(fā)現與未接受過麻醉的兒童相比，接受過單次麻醉暴露的兒童并未表現出語言及數學的讀寫學習障礙，但接受過2次及以上麻醉暴露的兒童患學習障礙的風險明顯增加；與此同時，暴露時長＞120 min的兒童患學習障礙的風險更高。上述研究表明幼年麻醉暴露頻率及麻醉暴露時長與誘發(fā)學習障礙的風險存在正相關。Oba等[10]研究顯示經受反復麻醉的兒童視覺誘發(fā)電位（visual evoked potential,VEP）參數明顯改變，與Wilder等[9]的觀點相符。

2 全麻藥物與情緒、行為發(fā)育

2.2 臨床研究情緒與行為的發(fā)育異常是神經毒性較為嚴重的后果之一，目前這方面的臨床研究仍較缺乏。DiMaggio等[13]發(fā)現，3歲前接受腹股溝疝修補術的兒童，其行為發(fā)育異常的風險是對照組的2倍，發(fā)育和行為障礙的風險比對照組高60%[14]。對2歲前接受過重復麻醉的兒童行為發(fā)育量表的分析顯示，麻醉暴露2次以上的兒童被診斷為注意力缺陷/多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）的風險明顯高于對照組[15]。Kalkman等[16]對6歲以前經歷泌尿外科手術的兒童進行神經發(fā)育測評，結果發(fā)現2歲前接受手術麻醉的兒童神經發(fā)育異常的風險較高。兒科麻醉神經發(fā)育評估計劃（the pediatric anesthesia neurodevelopment assessment,PANDA）與梅奧兒童安全（Mayo safety in kids,MASK）研究證實，3歲前多次麻醉暴露的兒童，神經心理學評估結果表現出明顯的解決問題遲緩和精細運動協調能力下降，而這可能與行為發(fā)育間存在相關性[17]。全身麻醉與凋亡（general anesthesia and apoptosis,GAS）研究結果則表明，與清醒-區(qū)域神經阻滯麻醉相比，暴露時間短于1 h的全身麻醉并不會改變男性嬰兒神經發(fā)育的結果[18]。這些研究提示，不必過于擔心幼年時短期麻醉暴露對神經行為發(fā)育的影響，原因是測評量表的結果可能會受到當地的生活環(huán)境、經濟發(fā)展、父母對兒童術后護理以及智力開發(fā)教育等諸多因素的影響，但幼年時期反復、多次、長時間的麻醉暴露可能是誘發(fā)神經發(fā)育障礙的高危因素之一。

3 全麻藥物的神經毒性機制

利用動物模型可從神經元形態(tài)、神經遞質傳遞、神經信號傳導等多方面幫助探索全麻藥物對未成熟大腦神經元分化、增殖和形成神經環(huán)路的干擾機制，這可為全麻藥物對發(fā)育大腦的神經毒性反應的臨床研究提供參考。

3.1 形態(tài)學改變神經元凋亡是全麻藥物神經毒性的首要表現。大量研究表明，全麻藥物誘導未成熟大腦神經元凋亡與認知發(fā)育障礙有關。但就數量而言，全麻藥物誘導的神經元凋亡比例不到神經元總數的2%[19-20]，與細胞正常發(fā)育過程中50%的凋亡率相差甚遠，提示細胞凋亡可能不是全麻藥物神經毒性反應的唯一機制。一些治療劑量的全麻藥物如右旋美托咪啶等，可通過促進線粒體自噬抑制七氟烷誘導的海馬神經元凋亡[21]。全麻藥物長期暴露與短期暴露均可誘導細胞凋亡，但僅長期暴露下才會導致認知功能障[22]。幼年雄鼠和雌鼠暴露于異氟醚中，大腦各區(qū)域都出現了神經元凋亡，但僅雄性小鼠在物體識別實驗中表現出記憶障礙[23]。因此，細胞凋亡與神經毒性之間是否存在必然聯系仍有待商榷。超微結構下觀察胞內細胞器變化發(fā)現，麻醉暴露后的神經元胞質中存在大量腫脹和/或退化的線粒體，提示線粒體融合和分裂異常。線粒體依賴途徑由具有促凋亡（如Bax、Bid）和抗凋亡（如Bcl-2、Bcl-xL）作用的Bcl-2蛋白家族控制，兩者的動態(tài)平衡維持線粒體膜的完整性。全麻藥物引起促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的比例增加（如Bax/Bcl-2），導致線粒體膜不穩(wěn)定，出現滲漏、破裂，進而造成細胞色素c的滲出和細胞凋亡蛋白酶Caspase-3的激活。七氟醚可促進大鼠原代神經元內質網中鈣離子（Ca2+）釋放，使細胞內Ca2+濃度升高，線粒體攝取大量Ca2+后引起線粒體腫脹促使膜通道孔開放，并由此介導線粒體呼吸鏈功能障礙和ATP生成不足[24]。丙泊酚可劑量依賴性地抑制電子傳遞鏈復合物Ⅳ活動，降低線粒體膜電位和ATP含量，導致線粒體功能障礙和能量生產不足[25]。此外，全麻藥物還可激活線粒體復合體Ⅳ、下調超氧化物歧化酶的清除率，使得活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基積聚，誘導線粒體裂變蛋白寡聚化后從細胞質進入線粒體，下調線粒體融合蛋白的活性，從而破壞線粒體裂變-融合的動態(tài)平衡，引起線粒體損傷[26]。

3.2 干擾突觸功能研究證實，NMDA受體和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）受體信號通路可調節(jié)神經元增殖、分化和神經環(huán)路的形成。全麻藥物被認為主要是通過抑制NMDA受體或激活GABA受體發(fā)揮臨床作用[27]，且這一作用具有年齡依賴性[28]。因此推測全麻藥物可能通過干擾突觸發(fā)生、神經環(huán)路形成介導認知發(fā)育障礙。突觸的形成和穩(wěn)定是保證電化學神經遞質正常傳遞的關鍵因素。P7大鼠接受混合全麻藥物（異氟醚、氧化亞氮和咪達唑侖）暴露后，數小時內發(fā)生腦下腳區(qū)興奮性和抑制性突觸丟失[29-30]，與此同時突觸前膜內神經遞質囊泡入塢的比例顯著降低[31]。但也有研究表明，使用全麻藥物后海馬齒狀回神經元的樹突棘密度顯著增加[32]；在出生后2周內接受丙泊酚暴露內側前額葉皮質錐體神經元樹突棘密度降低，出生后2～4周內接受丙泊酚暴露則樹突棘密度顯著增加，且這些變化可持續(xù)到成年以后[33]。推測原因可能是全麻藥物對突觸發(fā)生的影響具有時間依賴性。突觸可塑性指突觸對活動模式的強化或弱化，涉及到不同信號蛋白的復雜調節(jié)，通常表現為突觸效率的長時程降低（long-term depression,LTD）和長時程增加（long-term potentiation,LTP）。這些表現一般與Ca2+進入胞內產生去極化相關。LTP和LTD參與調節(jié)記憶鞏固的過程，但在神經發(fā)育關鍵時期這一過程可被全麻藥物阻斷。研究人員連續(xù)3 d給P7大鼠腹腔注射20、40、60 mg/kg丙泊酚，24 h和72 h均觀察到海馬神經元的樹突分支數、樹突總長度和樹突棘密度明顯降低，60 d后大鼠海馬LTP顯著降低[3]。研究顯示，低劑量異丙酚通過NMDA受體依賴機制促進LTD形成并損害LTP的維持[34]，而高劑量異丙酚則是通過GABAA受體抑制LTP，提示同種全麻藥物不同劑量處理對海馬突觸可塑性的影響是不同的。依托咪酯也可通過調節(jié)海馬錐體神經元上β2-GABAA受體的反饋抑制來降低LTP[35]。這種全麻藥物誘導出的突觸可塑性功能缺陷通常與后續(xù)行為中表現出的認知功能障礙一致[3]。

3.3 調節(jié)胞內信號轉導通路信號轉導通路具有極其規(guī)律的特性，其進化相當保守，對神經元的早期發(fā)育和生存至關重要。全麻藥物參與調控多種神經元胞內相關分子的表達。研究發(fā)現，氯胺酮通過抑制成熟腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）的表達使得未成熟的BDNF前體與低親和力的神經營養(yǎng)因子受體p75NTR結合，誘導下游肌動蛋白解聚，導致突觸丟失和細胞死亡[30，36]。BDNF還可引起磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K）/絲氨酸蘇氨酸特異性蛋白激酶（protein kinase,PKB，又稱Akt）和蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）/細胞外信號調節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase,ERK）等主要激酶通路的磷酸化和激活。磷酸化的Akt誘導下游蛋白糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase,GSK）-3β磷酸化，導致GSK-3β失活，誘發(fā)下游未知機制引起細胞凋亡。磷酸化的ERK則遷移到細胞核，誘導與生存相關的基因轉錄（cyclin D1,c-Fos），并抑制細胞周期抑制劑的表達[37]。

Toll樣受體家族（Toll-like receptors,TLRs）存在于多種微生物表面或細胞內，通過刺激機體的固有免疫發(fā)展獲得性免疫。TLR4是哺乳動物中TLRs同源性最高的蛋白，通過髓系分化因子88（myeloid diferentiation factor 88,MyD88）/NF-κB通路調控神經干細胞的自體更新，具有抑制神經元細胞增殖和分化的作用。TLRs通過NF-κB信號通路在神經元干細胞中發(fā)揮特異性作用。七氟烷則是通過激活TLR4，促進TLR4/MyD88/NF-κB信號轉導通路，觸發(fā)下游信號轉導，從而導致一系列炎癥因子如IL、TNF等的表達，并因此干擾神經元分化與增殖[38]。

3.4 誘發(fā)炎癥反應全麻藥物作用下，促炎性細胞因子、IL、TNF等表達上調[39-40]。研究發(fā)現，幼年時遭受麻醉暴露的大鼠，成年后腦組織中IL-6、TNF-a、CC趨化因子配體（CC chemokine ligand,CCL）5和巨噬細胞炎癥蛋白（macrophage inflammatory protein,MIP/CCL3）表達增加，說明幼年麻醉暴露誘發(fā)的神經炎癥可長期存在[41]。促炎性細胞因子通過神經元凋亡、線粒體和氧化損傷以及神經元分支受損等多種機制影響神經元功能，炎癥與焦慮、抑郁等多種神經精神障礙密切相關[42]。幼鼠接受全麻藥物前預防應用抗炎性甾體類藥物可明顯改善全麻藥物誘導出的認知及行為改變[41]，進一步說明炎癥可能是全麻藥物對未成熟大腦神經毒性的作用靶點之一。

3.5 調控神經膠質細胞大腦中還存在著10倍數量于神經元的神經膠質細胞，主要包括星形膠質細胞、少突膠質細胞（兩者合稱為大膠質細胞）和小膠質細胞等。星形膠質細胞數量最多，通過調節(jié)神經元遷移、成熟和突觸塑造（如突觸數量、功能和穩(wěn)定性）等多方位調控大腦發(fā)育。缺乏星形膠質細胞共培養(yǎng)的神經元不僅突觸密度會降低，現有突觸的自發(fā)活動也明顯減少。離體實驗發(fā)現，異氟醚可延遲未成熟星形膠質細胞的形態(tài)分化并損害其生長[43]。在體實驗結果也表明，七氟醚可使新生大鼠的星形膠質細胞數量明顯下降[44]。少突膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中包繞軸突形成髓鞘的結構，促使軸突髓鞘化，使生物電信號跳躍式傳遞，從而協助神經信息高效傳導。丙泊酚可導致新生小鼠少突膠質細胞增殖受限，明顯增加凋亡細胞數量[45]。小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的常駐免疫細胞，是神經炎癥的驅動因子，是神經退行性疾病中認知障礙的基礎神經機制。它通過清除死亡神經元，修剪無功能的突觸，并產生支持神經元存活的配體來幫助調節(jié)大腦功能。研究表明，3%七氟醚連續(xù)3 d暴露2 h/d，可激活未發(fā)育成熟小鼠的小膠質細胞并通過NF-κB通路誘發(fā)下游神經炎癥反應。此外，七氟醚還參與調節(jié)發(fā)育小鼠海馬中的小膠質細胞表型，上調M1和M2b表型的表達，下調M2a表型的表達，其中前兩者分別與促炎性狀態(tài)、免疫調節(jié)相關，而后者與組織修復及吞噬作用相關[46]，進一步支持全麻藥物誘發(fā)了炎癥反應。膠質細胞發(fā)育異?；蚬δ苷系K會嚴重干擾神經元生長及神經環(huán)路的形成，目前關于全麻藥物對神經膠質細胞的毒性研究較少，且相關研究多局限于某一具體時間點的觀察。后續(xù)研究可圍繞全麻藥物對神經膠質細胞毒性的易感性、時間窗及持續(xù)時長等展開探討。

3.6 表觀遺傳學修飾表觀遺傳學認為，在細胞核DNA序列沒有改變的情況下，基因功能可發(fā)生可逆的、可遺傳的改變，如DNA甲基化修飾、組蛋白修飾和非編碼RNA等，這些改變是機體對環(huán)境刺激因素變化的反映，這些改變相互作用可調節(jié)基因表達、控制細胞表型、維持機體內環(huán)境穩(wěn)定，有助于正常生理功能的發(fā)揮。已有研究表明，氧化亞氮、咪達唑侖和異氟醚混合物可造成環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein,CBP）斷裂[47]。CBP含有組蛋白乙酰轉移酶活性，在遭受麻醉暴露后可間接導致組蛋白3乙?；档?，引起B(yǎng)DNF和c-Fos轉錄下調，干擾記憶的形成與鞏固。胞嘧啶C5的甲基化會使得基因難以被轉錄因子接近，因此甲基化狀態(tài)具有穩(wěn)定性和可遺傳性。大腦中DNA甲基化的降低與隨著年齡增長而出現的學習和記憶功能下降一致。P7大鼠暴露于七氟醚中6 h可引起腦下腳區(qū)神經元胞嘧啶C5甲基降低，表明全麻藥物降低DNA甲基化，并且這種低甲基化模式會遺傳給從未被麻醉的后代[48]，初步解釋了母體接受麻醉后其后代表現出形態(tài)和認知缺陷的現象。表觀遺傳學修飾涉及的蛋白家族成員較多，因此各類修飾的具體信號通路仍需要細化研究。

4 潛在的保護性機制

麻醉暴露時采取相應的保護性措施可減輕全麻藥物引起的認知障礙。例如，線粒體損傷及其介導的神經元凋亡可被L型Ca2+通道拮抗劑尼莫地平緩解[24]。鋰可通過減弱全麻藥物誘發(fā)的ERK磷酸化來發(fā)揮抗神經細胞凋亡作用[49]。作為具有抗氧化功能的內源性激素，褪黑素可通過激活蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）α/轉錄因子NF-E2相關因子2（nuclear erythroid 2-related factor 2,Nrf2）信號通路拮抗全麻藥物引起的氧化應激，發(fā)揮神經保護作用[50]。溶質載體家族蛋白中鈉鉀氯共轉運蛋白1（Na+-K+-2Cl-cotransporter,NKCC1）和鉀氯共轉運蛋白2（K+-2Cl-cotransporter,KCC2）的相對表達水平與氯離子流入或流出細胞有關，前者使細胞膜超極化，后者使細胞膜去極化。雄激素受體拮抗劑可通過阻斷NKCC1的功能促使細胞由抑制性向興奮性轉變，進而降低未成熟大腦對全麻藥物神經毒性的易感性[51]。RhoA是一種小的鳥苷三磷酸酶，能夠解聚肌動蛋白。異氟醚可引起RhoA活化、細胞骨架解聚和誘發(fā)細胞凋亡。p75神經營養(yǎng)因子抑制劑能夠通過抑制RhoA活化阻止下游肌動蛋白解聚，從而顯著減輕未成熟大腦中全麻藥物介導的神經毒性[52]。白藜蘆醇是一種天然的多酚類物質，具有抗炎活性。白藜蘆醇預處理可逆轉七氟醚誘導的M1/M2小膠質細胞比例失衡，改善七氟醚誘導的發(fā)育中小鼠認知功能障礙[46]。麻醉前預防性應用甾體物質黃體酮能夠明顯改善炎癥反應和全麻藥物誘導出的認知及行為改變[41,53]。組蛋白去乙?；敢种苿┤缍魈嬷Z他則可有效逆轉全麻藥物誘導出的H3組蛋白低乙酰化[54]。除了藥物干預，鍛煉也被證明能夠增加H3和H4的乙酰化、提高海馬體中的c-Fos和CBP的表達，改善全麻后大鼠的記憶[55]。亞低溫（35.0～36.5℃）可顯著減少七氟醚在未成熟大腦灰質和白質中誘發(fā)的神經元和少突膠質細胞的凋亡，對凋亡性腦損傷具有顯著的保護作用[56]。后續(xù)研究可就類似的非藥物方法展開深入討論。

5 小結

動物研究和臨床研究都警示早期、反復、多次、長時間全麻藥物暴露，對未成熟大腦可能有一定的神經毒性反應，全麻藥物造成的神經形態(tài)改變對神經發(fā)育的影響深遠。目前還很難將實驗室的研究與臨床實際操作相結合，當實驗室研究向臨床轉化時，還存在很多本質問題及不確定性，如無法確定人類精確的易受損時間窗、引起神經受損的藥物劑量的上限、臨床上無法排除的如手術疾病等混雜因素。使用動物模型從神經環(huán)路、分子機制等多種角度闡明全麻藥物神經毒性的作用靶點并找出干預措施為探索轉化臨床應用提供了可能。

相比動物，人類發(fā)育時期更長、得到的麻醉護理更好，恢復能力也更優(yōu)。全麻藥物在減輕疼痛等刺激對神經發(fā)育的影響中起到一定的神經保護作用。因此麻醉醫(yī)生應合理正視、權衡全麻藥物對未成熟大腦的保護作用與毒性反應，選擇更為合理的臨床用藥及麻醉方案，如盡量延遲對生長發(fā)育無影響的擇期手術的時期、復合選用合適的區(qū)域阻滯技術減少全身麻醉用藥的劑量、精準麻醉減少血流動力學波動、合理鎮(zhèn)痛發(fā)揮麻醉藥的保護性作用等。