黃 升，陳 利，蘇國旗，黃金秀,2*

（1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 402460）

低劑量抗生素曾廣泛添加到飼料中用于促進動物生長并增強抗病能力，但抗生素的濫用導致細菌耐藥性加劇。我國于2020 年12 月31 日全面禁止在動物飼料中添加促生長類抗生素。因此，尋找新型抗生素替代品成為當前研究的熱點。類芽孢桿菌（）為革蘭氏陽性菌，在自然界分布廣泛，可以分泌多種環(huán)脂肽，如表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和豐源素（Fengycin）等。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)脂肽具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能，且不易產(chǎn)生耐藥性，在養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥、食品等領域的應用潛力巨大。都海明等研究發(fā)現(xiàn)，添加4 000 U/kg 環(huán)脂肽（含表面活性素和豐源素）能抑制斷奶仔豬腸道有害微生物生長，降低腹瀉，改善生長性能。飼糧中添加50 mg/kg 表面活性素可提高吉富羅非魚腸道脂肪酶活性，調(diào)節(jié)脂肪代謝酶水平或活性，進而促進生長。因此，環(huán)脂肽對養(yǎng)殖動物生長與代謝具有正面影響，作為飼用抗生素替代品具有廣闊的應用前景。

野生型菌株合成的環(huán)脂肽產(chǎn)量非常低，通常需要優(yōu)化發(fā)酵條件來改變菌株代謝方式，提高產(chǎn)量。陳杰等對海洋芽胞桿菌（）B-9987 產(chǎn)新型環(huán)脂肽Marinhysin A 的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加42 g/L 蔗糖和42.3 g/L 酵母粉，Marinhysin A 濃度最大可達182 mg/L，較之前提高了28.5%。Abdel-Mawgoud 等試驗發(fā)現(xiàn)，NaNO是枯草芽孢桿菌（）BS5 產(chǎn)表面活性素的最佳氮源，且適宜添加量為5 g/L。然而，目前關(guān)于環(huán)脂肽發(fā)酵條件的研究集中在實驗室搖瓶階段，鮮有中試發(fā)酵階段的報道。本實驗室篩選到1 株產(chǎn)脂環(huán)七肽的類芽孢桿菌，脂環(huán)七肽為表面活性素類似物，具有較高的開發(fā)價值。為此，本試驗在前期實驗室發(fā)酵條件篩選的基礎上，探究中試發(fā)酵件下發(fā)酵時間及豆粕、葡萄糖、無機鹽的添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響，為脂環(huán)七肽產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基 類芽孢桿菌由重慶市畜牧科學院篩選得到并保存。LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）組成為10 g/L 蛋白胨、5 g/L酵母浸粉、10 g/L 氯化鈉，pH 調(diào)至7.0；在LB 液體培養(yǎng)基中加2.0 %瓊脂配制成LB 固體培養(yǎng)基；種子罐培養(yǎng)基為2.5 kg 蛋白胨、1.25 kg 酵母粉、1.25 kg 氯化鈉、0.75 kg 消泡劑，裝罐量230 L。

1.2 主要試劑 豆粕購自榮昌縣糧油工業(yè)公司；葡萄糖為化學純，購自榮昌縣糧油工業(yè)公司；碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸錳均為化學純，購自重慶渝西商貿(mào)有限公司；AT-320F 型消泡劑為南海大田化學有限公司產(chǎn)品。脂環(huán)七肽標準品由實驗室從類芽孢桿菌發(fā)酵液中分離純化獲得，經(jīng)高效液相色譜檢測，純度為99.5%。

1.3 主要儀器 Ulti-Mate 3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）、安捷倫C18（4.6×250 mm）反相色譜柱（安捷倫科技中國有限公司）、LDZH-200KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、Milli-Q 型超純水儀（默克有限公司）、10 t發(fā)酵罐（上海保興生物設備工程有限公司）等。

1.4 種子液制備

1.4.1 菌株活化 將保藏在甘油管內(nèi)的原代菌種接種于LB 斜面活化培養(yǎng)基上，在37℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h。

1.4.2 種子菌搖瓶培養(yǎng) 將斜面培養(yǎng)的單菌落接入滅菌的、裝有50 mL LB 培養(yǎng)基的三角瓶中，在37 ℃、200 r/min 的搖床上培養(yǎng)16 h，得到一級種子液。

1.4.3 種子罐培養(yǎng) 種子罐內(nèi)的培養(yǎng)基滅菌后，按照1%接種量將一級種子液接種到500 L 種子罐中，在罐溫36.0～37.5 ℃、罐壓0.05 Mpa、pH 6.65～8.55、轉(zhuǎn)速100～160 r/min、溶氧30 % 左右、通風量13～20 m/h的發(fā)酵條件下培養(yǎng)22 h，得到二級種子液。

1.5 中試發(fā)酵與樣品制備 按5 m裝容量將發(fā)酵物料投放入10 t 罐體內(nèi)，加水后用攪拌槳低速混合，再用121℃蒸汽中滅菌30 min。滅菌后，將二級發(fā)酵種子按1.5%接種量進行接種。其他發(fā)酵條件為罐壓0.05 MPa、溶氧30 %左右、pH 6.65～7.55、通風量260～380 m/h、罐溫36.8～37.5℃、轉(zhuǎn)速100～180 r/min。終止發(fā)酵后，將菌液以3 500 r/min 離心30 min 后取上清液，經(jīng)噴霧干燥獲得含脂環(huán)七肽的中試樣品。

1.6 脂環(huán)七肽產(chǎn)量檢測 稱量1 g 左右的中試樣品，置于25 mL 容量瓶中，加適量的超純水，用超聲處理10～15 min 后定容至25 mL；再在8 000 r/min、4℃條件下離心10 min，得到的上清液用0.22 μm 水相濾膜過濾后，用高效液相色譜儀檢測。記錄樣品液相色譜圖中相應峰的保留時間和峰面積，并計算脂環(huán)七肽產(chǎn)量。計算公式：

脂環(huán)七肽產(chǎn)量（%）=[（樣品峰面積-標準曲線線性方截距）/（線性方程斜率× 進樣體積）]×（樣品定容體積/樣品重量）

1.7 中試發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化 中試樣品制備同試驗方法1.5，脂環(huán)七肽產(chǎn)量檢測同試驗方法1.6。

1.7.1 發(fā)酵時間的優(yōu)化 試驗設置22、24、26、30 h 4 個發(fā)酵時間，除發(fā)酵時間外的其他中試發(fā)酵參數(shù)均保持一致。

1.7.2 葡萄糖添加量的優(yōu)化 試驗設置的2 種葡萄糖添加量分別3.70、4.44 kg/m，除葡萄糖外的其他中試發(fā)酵參數(shù)均保持一致。

1.7.3 豆粕添加量的優(yōu)化 在實驗室前期培養(yǎng)基篩選的基礎上，以豆粕為氮源，考察不同添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響。試驗設置了46.3、55.6、64.8 kg/m3 種豆粕添加量，除豆粕外的其他中試發(fā)酵參數(shù)均保持一致。

1.7.4 無機鹽添加量的優(yōu)化 試驗比較了2 種無機鹽配方（表1）對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響，除無機鹽外的其他中試發(fā)酵參數(shù)均保持一致。

表1 無機鹽配方

1.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS 22.0 軟件進行分析，采用One-Way ANOVA 方法對豆粕添加量和發(fā)酵時間的試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，對葡萄糖和無機鹽添加量的試驗數(shù)據(jù)進行檢驗，同時采用LSD 法進行多重比較。＜0.05表示差異顯著，＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵時間對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 由圖1 可知，隨著發(fā)酵時間的延長，中試樣品的脂環(huán)七肽產(chǎn)量呈先上升后下降的變化趨勢。當發(fā)酵時間為26 h 時，脂環(huán)七肽產(chǎn)量最高，為1.41%，高于發(fā)酵22 h 時的產(chǎn)量（＜0.05）；而當發(fā)酵時間延長至30 h 時，脂環(huán)七肽產(chǎn)量降低至1.26%。因此，中試發(fā)酵時間選擇26 h 為宜，后續(xù)試驗均采用26 h 發(fā)酵。

圖1 發(fā)酵時間對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響

2.2 葡萄糖添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 由圖2 可見，中試發(fā)酵基質(zhì)中分別添加3.70、4.44 kg/m葡萄糖，脂環(huán)七肽產(chǎn)量分別為1.28%和1.33%（＞0.05）。從成本角度考慮，建議葡萄糖選擇添加3.70 kg/m。

圖2 葡萄糖添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響

2.3 豆粕添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 由圖3 可知，隨著豆粕添加量的增加，中試樣品的脂環(huán)七肽產(chǎn)量先升高后降低。當豆粕添加量為55.6 kg/m時，脂環(huán)七肽產(chǎn)量高達1.35%，高于其他兩組（＜0.05），提示豆粕在中試發(fā)酵基質(zhì)中的適宜添加量為55.6 kg/m。

圖3 豆粕添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響

2.4 無機鹽添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 由圖4 可見，無機鹽按配方1 添加時中試樣品的脂環(huán)七肽產(chǎn)量（1.42 %）較按配方2 添加時脂環(huán)七肽產(chǎn)量（1.64 %）提高了15.49%（＜0.05），表明適當增加中試發(fā)酵基質(zhì)中的無機鹽添加量能提高脂環(huán)七肽產(chǎn)量。

圖4 無機鹽添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響

3 討 論

3.1 發(fā)酵時間對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 發(fā)酵時間是影響芽孢桿菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的重要因素。研究表明，芽孢桿菌在不同發(fā)酵時間所產(chǎn)生的環(huán)脂肽種類存在差異，在對數(shù)生長期向?qū)?shù)期的過渡階段會產(chǎn)生大量的表面活性素，而在穩(wěn)定期的初始階段產(chǎn)生豐源素，在穩(wěn)定期的后期則產(chǎn)生伊枯草菌素。因此，不同活性物質(zhì)所需要的菌株發(fā)酵時間會不同。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間的延長，中試樣品的脂環(huán)七肽產(chǎn)量呈先上升后下降的變化趨勢，發(fā)酵26 h 時脂環(huán)七肽產(chǎn)量達到最高值。秦楠等也發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌HRH317 菌株的抑菌活性隨發(fā)酵時間的延長出現(xiàn)先增強后減弱的變化趨勢，當發(fā)酵時間為18 h 時，抑菌活性達到最大，推斷該菌株在對數(shù)生長末期開始合成活性物質(zhì)，而從穩(wěn)定期至降速期，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)逐漸耗盡，菌體數(shù)減少，合成活性物質(zhì)的能力降低。

3.2 葡萄糖添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 葡萄糖作為速效的碳源，能快速啟動菌體生長，縮短菌株發(fā)酵周期，促進次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。張志焱等對1 株產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌進行培養(yǎng)基篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化，得出適宜碳源為葡萄糖，且當葡萄糖在50 g/L 時產(chǎn)生的抗菌肽效價達到最高，為3.64×10U/mL。但本試驗發(fā)現(xiàn)，葡萄糖添加量對類芽孢桿菌產(chǎn)脂環(huán)七肽的能力沒有顯著影響，可能是因為在中試生產(chǎn)中菌株對葡萄糖的利用效率發(fā)生改變，或是本試驗中葡萄糖添加量變化較小導致。

3.3 豆粕添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 氮源是影響發(fā)酵菌株生物合成環(huán)脂肽的關(guān)鍵因素。喬俊卿等采用單因素試驗設計優(yōu)化工程菌株B9BD 發(fā)酵合成表面活性素的條件，最終確定以黃豆粉為主要氮源、輔助添加牛肉浸膏和硝酸銨為氮源。豆粕的粗蛋白質(zhì)含量較高，通常為43%～46%，且氨基酸組成比例好，可以作為芽孢桿菌培養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)氮源。在發(fā)酵過程中，豆粕可被菌株利用供能，并產(chǎn)生1,6-二磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖等多種代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會激活菌株ATP-依賴的蛋白激酶系統(tǒng)，進而直接或間接調(diào)控抗菌脂肽的合成路徑。本試驗也發(fā)現(xiàn)，豆粕添加量會顯著影響中試發(fā)酵樣品中的脂環(huán)七肽產(chǎn)量，當豆粕添加量由46.3 kg/m增加到55.6 kg/m時，脂環(huán)七肽產(chǎn)量提高了28.57%；而當豆粕添加量增至64.8 kg/m時，脂環(huán)七肽產(chǎn)量又出現(xiàn)明顯下降，故中試發(fā)酵基質(zhì)中的豆粕適宜添加量為55.6 kg/m。

3.4 無機鹽添加量對脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 無機鹽是發(fā)酵培養(yǎng)基的重要組成成分。菌體內(nèi)的各種酶促反應均需要鎂、鈣、鉀等多種離子參與，并影響抗菌肽的合成。本試驗結(jié)果表明，適當增加中試發(fā)酵基質(zhì)中碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸錳的添加量，可以顯著提高脂環(huán)七肽產(chǎn)量。Abdel-Mawgoud 等試驗結(jié)果也表明，培養(yǎng)基中添加0.16 g/L 硫酸鋅、0.27 g/L氯化鐵和0.017 g/L 硫酸錳，提高了枯草芽孢桿菌表達表面活性素的能力。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，以脂環(huán)七肽產(chǎn)量為衡量指標，優(yōu)化后的類芽孢桿菌中試發(fā)酵基質(zhì)為55.6 kg/m豆粕、3.70 kg/m葡萄糖、3.33 kg/m碳酸鈣、1.11 kg/m硫酸鎂、1.11 kg/m磷酸氫二鉀、1.11 kg/m磷酸二氫鉀、0.22 kg/m硫酸錳，適宜發(fā)酵時間為26 h，脂環(huán)七肽產(chǎn)量從1.04 %提高到1.64 %，可為利用該菌株實現(xiàn)脂環(huán)七肽產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。