魏紅芳，劉 昆，姬向波，唐桂芬，李衛(wèi)兵，唐杏雨，劉穎慧，郭建來*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450045；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450045；3.鄭州普恩科技有限公司，河南鄭州 450001）

以往，養(yǎng)殖生產(chǎn)中常在飼料中添加抗生素以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和減少疾病的發(fā)生。但使用抗生素會(huì)導(dǎo)致畜產(chǎn)品抗生素的殘留，帶來食品安全隱患和環(huán)境污染。我國已于2020 年7 月1 日全面禁止飼料端添加促生長(zhǎng)類抗生素。因此，研究開發(fā)具有促生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力和改善腸道健康等功效的功能性產(chǎn)品已成為當(dāng)前動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

黑水虻是一種營腐食性昆蟲，也是一種極具應(yīng)用前景可資源化利用的昆蟲。黑水虻幼蟲不僅富含蛋白質(zhì)和脂肪，還含有月桂酸和抗菌肽等成分，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值以及調(diào)控動(dòng)物機(jī)體抗氧化和免疫狀態(tài)的功能。但因其含水量高達(dá)65.0%～75.0%（本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)），不便于運(yùn)輸和儲(chǔ)存，因此對(duì)黑水虻幼蟲通常采用微波烘干的加工方式。研究表明，在日糧中適量添加黑水虻蟲粉替代豆粕或者魚粉可改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能，并對(duì)肉品質(zhì)、腸道微生物、腸道代謝和黏膜免疫具有有益的調(diào)控作用。但這種加工方式成本較高，從飼料成本角度考慮并不劃算。因此，進(jìn)一步對(duì)黑水虻幼蟲的加工工藝進(jìn)行探索，提高其應(yīng)用效果，是黑水虻幼蟲飼料化的研究方向之一。本試驗(yàn)旨在通過微生物發(fā)酵技術(shù)來處理黑水虻幼蟲，為黑水虻幼蟲加工工藝的探索和功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 黑水虻幼蟲和麩皮由鄭州普恩科技有限公司提供，乳酸對(duì)照品為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，氨基酸對(duì)照品為北京鐳歐森科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品，MRS 培養(yǎng)基為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；除乙腈和甲酸為色譜純外，其他試劑均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)菌種 益生菌發(fā)酵劑A 內(nèi)含枯草芽孢桿菌和釀酒酵母，其中枯草芽孢桿菌菌落數(shù)≥5×10CFU/g，釀酒酵母活細(xì)胞數(shù)≥2×10個(gè)/g；益生菌發(fā)酵劑B 內(nèi)含植物乳桿菌，菌落數(shù)≥2×10CFU/g，發(fā)酵劑為廣州博善生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 發(fā)酵飼料制備 將黑水虻幼蟲（含水量65.0%～75.0%）與麩皮（含水量13.0% 左右）1:1 混合，益生菌發(fā)酵劑A 和發(fā)酵劑B 各取0.2% 溶解于溫水中，在35℃溫水中活化2 h，然后加入飼料中攪拌均勻（物料含水量最終控制在38.0%～40.0%），制成固體發(fā)酵飼料。發(fā)酵飼料用帶有單向排氣呼吸閥的PE 膜密封包裝，每袋1.0 kg，共做54 袋，在35℃人工氣候箱中發(fā)酵。試驗(yàn)于2021 年7—8 月在河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 樣品處理及指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 樣品處理 在前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵1 d 后pH 從8.7左右下降5.8 左右，下降幅度較大。因此，發(fā)酵0～24 h每隔4 h 取樣1 次，每次隨機(jī)抽取3 袋，隨后第2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 天各取樣1 次，每次隨機(jī)抽取3 袋，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 乳酸菌活菌數(shù)及pH 乳酸菌采用MRS 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)并計(jì)活菌數(shù)；pH 采用上海儀電PHS-3C 雷磁精密pH 計(jì)測(cè)定；乳酸采用山東悟空K2025 高效液相色譜儀測(cè)定，依據(jù)《發(fā)酵飼料中乳酸含量的測(cè)定》（T/NAIA002-2020）。

1.3.3 主要營養(yǎng)成分 樣品采用105℃烘箱干燥，參照《飼料中水分的測(cè)定》（GB/T 6435-2014）測(cè)定水分；灰分采用上海燈晟DTM-4A-12 陶瓷纖維馬弗爐測(cè)定，參照《飼料中粗灰分的測(cè)定》（GB/T 6438-2007）；總能采用TYHW-2000 型微機(jī)全自動(dòng)量熱儀測(cè)定，參照《動(dòng)物飼料、動(dòng)物產(chǎn)品和糞便或尿液 總熱值的測(cè)定 彈式量熱計(jì)法》（ISO 9831，1988）；粗纖維采用ANKOM200 纖維分析儀測(cè)定，參照《飼料中粗纖維測(cè)定方法》（GB/T 6434-2006）；粗蛋白質(zhì)采用山東海能K9840 自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定，參照《飼料中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB/T 6432-2018）；粗脂肪采用山東海能全自動(dòng)粗脂肪測(cè)定儀SOX606 測(cè)定，參照《飼料中粗脂肪的測(cè)定》（GB/T 6433-2006）；鈣采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法測(cè)定，參照《飼料中鈣的測(cè)定》（G B/T 6436-2018）；總磷采用北京萊伯泰科UV Power 紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定，參照《飼料中總磷的測(cè)定 分光光度法》（GBT6437-2002）；氨基酸采用德國曼默博爾A300 氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，參照《飼料中氨基酸的測(cè)定》（GB/T 18246-2000），計(jì)算17 種氨基酸總量。

1.3.4 多肽含量 準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料濕樣2.00 g，加入15% 三氯乙酸（TCA）溶液 50 mL，混合均勻，靜置5 min，以中速定性濾紙過濾，將濾液轉(zhuǎn)移置離心管，4 000 r/min 離心10 min，準(zhǔn)確移取上清液10 mL 于消化管中，按粗蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定其多肽含量，具體操作和計(jì)算參照《飼料中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB/T 6432-2018）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016 軟件進(jìn)行處理并繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料pH 的影響 由圖1 可見，發(fā)酵0～8 h，發(fā)酵飼料的pH 變化較小；8～16 h，pH 隨時(shí)間延長(zhǎng)而迅速下降；16 h 以后，pH 趨于穩(wěn)定。由圖2 可知，發(fā)酵初始pH 在8.70 左右，24 h 后pH 下降到5.85 左右，發(fā)酵1 d 以后至試驗(yàn)結(jié)束pH 波動(dòng)較?。粡谋驹囼?yàn)來看，在35℃發(fā)酵條件下，發(fā)酵的前24 h 乳酸菌產(chǎn)生乳酸的速度最快，隨后產(chǎn)酸能力降低。

圖1 0～24 h 發(fā)酵飼料pH 變化情況

圖2 發(fā)酵過程中pH 的變化

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料乳酸菌活菌數(shù)和乳酸含量的影響 由圖3 可見，發(fā)酵第2 天總?cè)樗峋鷶?shù)達(dá)到頂峰，為8.8×10個(gè)/g。隨后乳酸菌數(shù)開始下降，發(fā)酵第9 天到本試驗(yàn)結(jié)束，黑水虻發(fā)酵飼料中的乳酸菌數(shù)趨于穩(wěn)定，維持在6.8×10個(gè)/g 左右。乳酸菌在繁殖過程中會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，發(fā)酵第2 天乳酸含量由開始時(shí)的0.42%迅速增加到5.15%，隨后乳酸含量緩慢增加，至試驗(yàn)結(jié)束，發(fā)酵料中乳酸含量達(dá)到了5.98%。

圖3 發(fā)酵過程中乳酸和乳酸菌活菌數(shù)的變化

2.3 發(fā)酵過程中成分變化分析 如圖4～7 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵飼料的水分含量略有增加；干物質(zhì)中粗蛋白質(zhì)、粗灰分、粗脂肪和粗纖維與發(fā)酵前相比略有增加；發(fā)酵0 d 時(shí)多肽含量為3.04%，發(fā)酵4 d 時(shí)達(dá)到了7.79%，隨后緩慢增加，但增幅較小。

圖4 發(fā)酵過程中水分、粗蛋白質(zhì)和氨基酸總量的變化

圖5 發(fā)酵過程中多肽和總能的變化

圖6 發(fā)酵過程中粗脂肪和粗纖維的變化

圖7 發(fā)酵過程中粗灰分、鈣和總磷的變化

3 討 論

3.1 黑水虻幼蟲發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)和乳酸含量的變化 林標(biāo)聲等用復(fù)合益生菌發(fā)酵常規(guī)飼料，發(fā)酵144 h時(shí)活菌總數(shù)達(dá)到峰值，隨后總菌數(shù)開始下降；孫合美等用植物乳桿菌和戊糖片球菌的混合菌種發(fā)酵飼料，48 h 時(shí)乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到最高值，為6.8×10CFU/g。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在固體發(fā)酵黑水虻幼蟲第2 天時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)量達(dá)到頂峰，為8.8×10個(gè)/g，乳酸含量達(dá)到5.15%；此后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌活菌數(shù)開始減少，到發(fā)酵第9 天，黑水虻發(fā)酵飼料中的乳酸菌活菌數(shù)趨于穩(wěn)定。本研究中復(fù)合益生菌由乳酸菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母組成，枯草芽孢桿菌屬于好氧菌，釀酒酵母屬于兼性厭氧菌，各菌株生長(zhǎng)時(shí)所需的條件不同。在制作發(fā)酵飼料過程中，發(fā)酵袋中會(huì)殘存一部分氧氣，可供芽孢桿菌和酵母菌生長(zhǎng)和快速繁殖，此時(shí)乳酸菌基本不生長(zhǎng)。當(dāng)發(fā)酵袋內(nèi)氧氣耗盡時(shí)，乳酸菌開始快速繁殖，并產(chǎn)生大量乳酸。隨著乳酸的大量產(chǎn)生，發(fā)酵飼料的pH 下降，酸性環(huán)境不再適合菌株的生長(zhǎng)，部分菌種開始裂解，乳酸菌數(shù)開始下降。

3.2 復(fù)合益生菌發(fā)酵黑水虻幼蟲對(duì)主要營養(yǎng)成分的影響本試驗(yàn)結(jié)果表明，與發(fā)酵前相比，黑水虻幼蟲經(jīng)復(fù)合益生菌固體發(fā)酵后的粗蛋白質(zhì)、粗灰分、鈣、總磷及氨基酸總量略有增加，可能與發(fā)酵飼料干物質(zhì)減少有一定關(guān)系。酵母菌屬兼性厭氧菌，在有氧條件下，把糖分解成二氧化碳和水，在缺氧條件下，酵母菌把糖分解成乙醇和二氧化碳，產(chǎn)生的二氧化碳和乙醇從呼吸閥溢出，發(fā)酵物料的總重量降低，烘干后干物質(zhì)減少。王赫等和劉曉明等也報(bào)道，發(fā)酵后飼料中粗蛋白質(zhì)、鈣、磷、氨基酸總量高于未發(fā)酵飼料。

本試驗(yàn)中發(fā)酵飼料的總能較發(fā)酵前略有增加，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總能開始下降。而林標(biāo)聲等試驗(yàn)中發(fā)酵飼料經(jīng)70～75℃烘干，王赫等試驗(yàn)中發(fā)酵飼料未經(jīng)烘干直接檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。研究結(jié)果差異可能與發(fā)酵后樣品的處理方法有關(guān)。本次試驗(yàn)發(fā)酵飼料樣品經(jīng)105℃烘干后測(cè)定總能，干物質(zhì)中的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量與發(fā)酵前相比有所提高，測(cè)得的總能也略有提高。

3.3 復(fù)合益生菌發(fā)酵黑水虻幼蟲對(duì)多肽含量的影響 肽在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)具有促進(jìn)養(yǎng)分吸收、參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)腸道發(fā)育、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等作用。飼料原料中多肽含量的增加，對(duì)于改善畜禽的健康狀況、充分發(fā)揮動(dòng)物生產(chǎn)潛力具有重要意義。方樂等利用芽孢桿菌、酵母菌和中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵、酶解處理豆粕，多肽含量從11.40 mg/g 提高到199.65 mg/g。林俊宏等利用混合菌固態(tài)發(fā)酵制備發(fā)酵魚粉，魚粉發(fā)酵后小肽含量達(dá)到24.77%。本研究中利用復(fù)合益生菌發(fā)酵黑水虻幼蟲，發(fā)酵第2 天多肽含量達(dá)到6.55%，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，多肽含量仍呈增加趨勢(shì)?？赡苁俏⑸锇l(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生蛋白酶，使黑水虻幼蟲中更多的大分子蛋白轉(zhuǎn)化為小分子的肽，增加了多肽含量。從試驗(yàn)結(jié)果來看，通過發(fā)酵的方式提高黑水虻幼蟲中的多肽含量是可行的。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在35℃發(fā)酵條件下，發(fā)酵24 h后黑水虻幼蟲發(fā)酵飼料的pH 趨于穩(wěn)定；發(fā)酵第2 天乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到峰值（8.8×10個(gè)/g），乳酸含量為5.15%，多肽含量為6.55%，隨后乳酸菌數(shù)開始下降，乳酸和多肽含量緩慢增加。綜合分析，利用復(fù)合益生菌發(fā)酵黑水虻幼蟲可提高發(fā)酵飼料中乳酸和多肽的含量，但在動(dòng)物飼料中的添加劑量、作用效果和作用機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。