李春海，陳曉英，王紅梅，楊劉玥玲，趙旺生*

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009）

從1961 年Clausen 等在腦脊液中發(fā)現(xiàn)胱蛋白開始，人們就對（Cystatin）基因家族開始了深入研究。CST3 是一種相對低分子質(zhì)量的非糖基化堿性蛋白質(zhì)，是廣泛存在于動植物中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在有核細(xì)胞中均有所表達，其參與細(xì)胞內(nèi)外蛋白水解的調(diào)控，保護細(xì)胞免受不適當(dāng)?shù)膬?nèi)源性或外源性蛋白酶水解。Frygelius 等發(fā)現(xiàn)編碼一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，基因的整體結(jié)構(gòu)與人類和其他II 型的編碼基因非常相似，有2 個內(nèi)含子位于與人類相同的位置，在啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個六核苷酸TGTTCT，它是雄激素應(yīng)答元件（ARE）的核心序列，該區(qū)域還包含一個21 核苷酸序列。CST3 蛋白在功能上與免疫應(yīng)答和精子成熟有關(guān)。在免疫方面，CST3 蛋白的缺少可以導(dǎo)致乳膠脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥和NLRP3 炎性小體的激活。在精子發(fā)生和成熟方面，基因主要從精原干細(xì)胞向早期精母細(xì)胞表達，并通過調(diào)節(jié)自噬在小鼠精原干細(xì)胞體外維持和移植后減數(shù)分裂進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。精原干細(xì)胞中的抑制會損害精子細(xì)胞或精子的產(chǎn)生，CST3 也是晚期生殖細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子?；蜃饔脵C理是通過修飾精子表面蛋白和周圍液體中的可溶性蛋白來促進精子成熟。研究表明，顯著表達于男性生殖道，精漿中CST3 蛋白水平較高，約為血清的37 倍。本研究通過對基因的克隆和對其序列進行生物信息學(xué)分析，并利用qPCR 技術(shù)對基因在牦牛附睪各區(qū)段的表達情況進行研究，以期為牦牛提高繁殖力提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取3 頭24 月齡、體格相似、身體健康的公牦牛睪丸組織，牦牛來自于四川省阿壩州紅原縣屠宰場。使用Hanks 溶液將睪丸組織清洗3 次，并將附睪從睪丸中分離出來，去除結(jié)締和脂肪組織，將附睪分為附睪頭、附睪體和附睪尾3 個部分。

1.2 主要試劑 Hanks 溶液，購自福州飛凈生物科技有限公司；Trizol 試劑，購自廣州濟恒醫(yī)藥科技有限公司；Taq DNA 聚合酶，購自大連寶生物工程有限公司；2X SG Fast qPCR Master Mix 試劑，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR-grade water 試劑，購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；雙蒸水、0.8%的瓊脂糖凝膠，購自香港Gene Company Ltd。

1.3 主要儀器 電泳儀，購自南京普陽科學(xué)儀器研究所；SpectraMax Quick Drop 超微量分光光度計，購自濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；高速離心機，購自阿法拉伐（上海）技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱，購自寧波江南儀器廠；超凈工作臺，購自濟南童鑫生物科技有限公司；微量移液器，購自濟南歐萊博生物科技有限公司。

1.4 牦牛附睪組織總RNA 的提取 根據(jù)Trizol 試劑說明書，提取牦牛附睪頭、體、尾部的總RNA，利用0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳儀檢測RNA 的完整性，利用SpectraMax Quick Drop 超微量分光光度計檢測RNA 的質(zhì)量，并保存在超低溫冰箱（-80℃）里。

1.5 克隆及設(shè)計引物 利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0 設(shè)計牦牛基因的PCR 克隆引物，引物序列（5'→3'）為：CF1：GACCATGGTGGGCTCCCC；CR1：TGGC CTGCCTGTTAATCC。以牦牛附睪組織逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板進行PCR 擴增，采用20.0 μL 擴增體系：DNA 聚合酶10.0 μL，雙蒸水7.0 μL，混勻的上下游特異性引物2.0 μL（10 μmol/L），附睪組織的cDNA 加1.0 μL（10 μmol/L）。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃4 min；94 ℃30 s；60 ℃30 s，72 ℃2 min，循 環(huán)32 次，72 ℃延伸2 min。將產(chǎn)物電泳檢測后進行DNA 的純化并在超凈工作臺上與目的片段和載體連接、轉(zhuǎn)化及鑒定后，送成都擎科梓熙生物公司進行測序。

1.6 CST3 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 利用在線軟件EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）分析CST3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用線上軟件SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）對CST3 蛋白的信號肽進行預(yù)測；利用線上軟件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html#opennewwindow）對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行分析；利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件分析、檢測CST3 蛋白的跨膜區(qū)數(shù)量；利用Softberry（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）在線軟件分析CST3 蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.7 熒光定量PCR 利用Primer Premier 5.0 軟件對已克隆得到的基因序列及內(nèi)參基因UXT（NM_174 029.1）序列進行特異性引物設(shè)計，引物序列（5'→3'）分別為：基因 CF2：CGCAAGCAGGTCGTGTCA；CR2：GGCTGGTTATGGAAGGGA；UXT 基 因UF：TGTGGCCCTTGGATATGGTT；UR：GGTTGTCGCTG AGCTCTGTG。熒光定量操作方法按照2X SG Fast qPCR Master Mix 試劑盒說明操作。反應(yīng)體系共10.0 μL：2X SG Fast qPCR Master Mix 5.0 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），PCR-grade water 3.2 μL，模板DNA為1 μL（10 μmol/L），以每個樣品3 個重復(fù)作為對照。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3 min；95℃2 s；60℃25 s；40 個循環(huán)。利用qPCR 技術(shù)，以內(nèi)參基因作為對照基因，以附睪頭作為對照組（CY1、CY2、CY3），附睪體（CY4、CY5、CY6）和附睪尾部（CY7、CY8、CY9）作為處理組，運用2方法可計算出基因在附睪組織頭、體、尾的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 牦?；虻臏y序及分析 通過EXPASY 的分析能夠得出，牦?；虻拈_放讀碼框長度為447 bp，含起始密碼子ATG 和終止密碼子TAA（圖1）。NCBI 網(wǎng)站BLAST 同源性比對發(fā)現(xiàn)，牦牛核苷酸序列與印度水牛（登錄號：KU936088.1）、山羊（登錄號：XP_013824066.2）和駱駝（登錄號XP_032317598.1）、犀 牛（XP_017703337.1）相 應(yīng)序列的同源性分別為97.97%、87.16%、68.03%、67.20%。

圖1 牦牛CST3 基因的堿基和氨基酸序列

2.2 牦牛CST3 翻譯蛋白的理化分析 通過EXPASY在線分析CST3 蛋白的氨基酸理化性質(zhì)，其中含量最高的為異亮氨酸Leu（12.2%），其次為纈氨酸Val（11.5%）、丙氨酸Ala（10.1%），含量最少的為色氨酸Trp（0.7%）。CST3 蛋白的分子量為16.26 ku，其等電點為9.23，為弱堿性蛋白。采用線上軟件對CST3 蛋白的信號肽作預(yù)測，結(jié)果顯示牦牛CST3 蛋白存在信號肽序列，信號肽剪切位點位于第19 號和第20 號氨基酸之間。利用protscale 對CST3 蛋白質(zhì)進行親疏水性分析，結(jié)果顯示最大值3.256，在第19 個位點上；最小值-2.644，在第120 個位點上，整體為親水性蛋白（圖2）。

圖2 牦牛CST3 基因翻譯蛋白親疏水性預(yù)測

2.3 牦牛CST3 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析與測定 對CST3蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)CST3 蛋白的長度為148 個氨基酸，CST3 蛋白在螺旋區(qū)有57 個氨基酸，占比為38.51%；在延伸鏈結(jié)構(gòu)處有21 個氨基酸，占比為14.19%；在轉(zhuǎn)角區(qū)有2 個氨基酸，占比為1.35%；在不規(guī)則卷曲狀態(tài)下有68 個氨基酸，占比為45.95%。

2.4 牦牛基因的跨膜結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測 對基因的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)（圖3）分析，結(jié)果顯示CST3 蛋白在7～29 位氨基酸處存在跨膜結(jié)構(gòu)。牦牛CST3 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示CST3 蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞外（圖4）。

圖3 牦牛CST3 蛋白的跨膜分析

圖4 牦牛CST3 蛋白的亞細(xì)胞定位

2.5 牦?；蛟诟讲G不同區(qū)域的表達 通過實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測基因在牦牛附睪不同區(qū)段的表達情況，發(fā)現(xiàn)基因在附睪組織的頭部、體部、尾部3 個區(qū)段中均有表達，存在顯著差異，其中在附睪頭部表達量最高，附睪體部和尾部表達量相對較低（圖5）。

圖5 牦牛CST3 基因在附睪不同區(qū)域的表達

3 討 論

基因是編碼胱抑制素相關(guān)的附睪生精蛋白基因，它的缺乏會導(dǎo)致雄性小鼠在體外顯示出生育缺陷。本研究分析結(jié)果顯示，CST3 蛋白序列長度為148，CST3 蛋白在螺旋區(qū)有57 個氨基酸，占比為38.51%；在延伸鏈結(jié)構(gòu)處也有21 個氨基酸，占比為14.19%；在轉(zhuǎn)角區(qū)有2 個氨基酸，占比為1.35%。CST3 蛋白的氨基末端是對含半胱氨酸的蛋白質(zhì)起抑制作用的位點之一，CST3 蛋白氨基末端通過結(jié)合-淀粉樣前體蛋白，競爭性抑制-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生。此外，CST3 的氨基端殘基以及Q88 和C97 可以通過與硫酸乙酰肝素結(jié)合來抑制木瓜蛋白酶的活性，在酸性pH條件硫酸乙酰肝素能夠降低CST3 蛋白的抑制能力。基因在附睪中主要控制功能性淀粉樣結(jié)構(gòu)的形成，且在附睪頭部中的表達量高于附睪尾部，這與本研究結(jié)果相一致。在人和小鼠上的研究表明，CST3 蛋白68 號氨基酸突變，會產(chǎn)生L68Q 突變體，使得CST3 蛋白在睪丸中異常積累，對生育產(chǎn)生不良影響，含有L68Q 型雜合體的小鼠不育。通過對L68Q 雜合體小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，L68Q 雜合體小鼠的精子沒有明顯的結(jié)構(gòu)缺陷，但這種小鼠的精子周圍附睪腔液中的成分可能會與精子表面結(jié)合，導(dǎo)致精子凝集和細(xì)胞膜破壞，最終影響精子的活力和生育能力。在人體中L68Q 胱抑制素C 淀粉樣蛋白的存在會改變附睪腔內(nèi)環(huán)境，從而導(dǎo)致精子不能具有受精功能。

在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠精原干細(xì)胞中CST3 蛋白的抑制會損害精子細(xì)胞或精子的物質(zhì)產(chǎn)生，基因在精原干細(xì)胞到早期精母細(xì)胞的分化整個時期均有表達，并通過調(diào)節(jié)自噬在小鼠精原干細(xì)胞體外維持和小鼠精原干細(xì)胞移植后減數(shù)分裂過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。核心多能性因子（Oct4、Id1）和關(guān)鍵RNA 結(jié)合蛋白（Nanos3）可以傳遞來自CST3 蛋白介導(dǎo)的自噬的信號。在基因表達敲低的小鼠精原干細(xì)胞中觀察到細(xì)胞增殖抑制和G1 期細(xì)胞周期停滯現(xiàn)象，因此，CST3蛋白也是晚期生殖細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。在正常男性體內(nèi)，CST3 蛋白在睪丸、附睪、輸精管、精囊和前列腺等組織中廣泛分布，基因在精囊和前列腺中高度表達，說明男性生殖器官和精漿中CST3 蛋白的主要含量是由這2 種組織的細(xì)胞產(chǎn)生的，CST3 蛋白也是男性生殖系統(tǒng)正常和病理性蛋白水解的重要調(diào)節(jié)因子。在糖尿病患者精液中，CST3 蛋白的豐富度降低，導(dǎo)致精子的活力降低。CST3 蛋白作為一種孕酮依賴蛋白可以與精子結(jié)合，增強精子活性，但也抑制膽固醇的流出和精子酪氨酸磷酸化，降低精子獲能。在人上的研究發(fā)現(xiàn)，男性生殖器官和精漿中存在的CST3 蛋白主要是由精囊和前列腺小體細(xì)胞產(chǎn)生的。

基因除了在精子的發(fā)生和成熟過程中起重要作用外，還與一些癌癥發(fā)生、血管和腦部疾病有重要關(guān)系。在癌癥中的研究發(fā)現(xiàn)，CST3 蛋白作為組織蛋白酶B 的抑制劑，被證明是一種促進凋亡和生長抑制因子，并已應(yīng)用于某些癌癥的診斷和預(yù)后。此外，CST3 蛋白可以拮抗多種參與促進細(xì)胞侵襲/遷移的關(guān)鍵因素，如轉(zhuǎn)化生長因子-（TGF-）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）。因此，CST3 蛋白在一些癌癥侵襲和遷移中起負(fù)面作用。研究發(fā)現(xiàn)，CST3 蛋白促進食管癌細(xì)胞的生長并抑制了細(xì)胞凋亡。在腦動脈和外周動脈中，CST3 蛋白缺乏可誘發(fā)動脈瘤變化。這種變化主要是由于蛋白酶（如組織蛋白酶）的活性不受控制。因此，可以看到結(jié)締組織和血管細(xì)胞的廣泛變化。此外，CST3 蛋白和組織蛋白酶B 的平衡對于血管重塑至關(guān)重要，并且發(fā)現(xiàn)改變CST3 水平的基因多態(tài)性與腦小血管病等病理學(xué)相關(guān)。在動脈粥樣硬化中，巨噬細(xì)胞中CST3 蛋白的缺失會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞出現(xiàn)自噬功能障礙，并隨后導(dǎo)致它們的凋亡，CST3 蛋白在抗原呈遞細(xì)胞的功能上具有性別依賴性，這種性別依賴性調(diào)節(jié)在CD11b+細(xì)胞中比在CD11c+細(xì)胞中更為突出。CST3蛋白在C57BL/6J 小鼠的實驗性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)育中也具有性別依賴性作用。相關(guān)研究表明，在女性中，CST3 驅(qū)動抗原呈遞細(xì)胞的激活和抗原呈遞能力，從而促進CD4+IFN-的產(chǎn)生和中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫。

綜上所述，基因的表達情況與精子的獲能和成熟有關(guān)，附睪頭部主要通過分泌各種物質(zhì)對精子成熟起重要作用，而基因在附睪頭部的高表達證實了本研究結(jié)果，但其對精子成熟和獲能的作用機制還需要繼續(xù)深入研究。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆得到了牦?；虻腃DS 區(qū)序列，并對基因序列進行生物信息學(xué)分析。通過對CST3 蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)CST3 蛋白為親水性蛋白，存在跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽。經(jīng)過qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)基因在牦牛附睪組織不同區(qū)段中分布不均，在附睪頭部的表達量最高。本研究通過對基因在牦牛附睪組織不同區(qū)域的表達情況進行分析，為牦牛附睪精子成熟的機制提供基礎(chǔ)材料，同時為牦牛的育種和繁殖提供研究方向。