王逸群，高登科,2，趙泓淙,2，李 丹，馬白榮，劉盼盼，孫樂桐，靳亞平,2，陳華濤,2*

（1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.西北農林科技大學農業(yè)農村部動物生物技術重點實驗室，陜西楊凌 712100）

為適應因地球自轉而形成的光暗循環(huán)，生物體從分子、細胞到組織、器官水平的生命活動均存在一定的周期性變化，稱為生物節(jié)律。生物鐘是生物體產生和調節(jié)生物節(jié)律的內源性振蕩器，以24 h 為周期節(jié)律性調控機體大量生理功能。生物鐘廣泛存在于從原核生物到哺乳動物的生物體內。生物鐘與新陳代謝、細胞生長增殖等眾多生理功能的調控密切相關。當生物鐘受到環(huán)境、基因突變等因素干擾時，機體的生理過程會發(fā)生紊亂，從而導致多種疾病發(fā)生。哺乳動物生物鐘系統(tǒng)具有復雜的結構，由存在于下丘腦視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）的中樞生物鐘和遍布于機體各個器官與組織的外周生物鐘構成。中樞生物鐘SCN 整合光線明暗變化的周期性信號，并通過神經和體液途徑調節(jié)外周生物鐘的節(jié)律性振蕩，從而維持機體的生理穩(wěn)態(tài)。哺乳動物主要的生物鐘基因包括：晝夜運動輸出周期蛋白基因（Circadian Locomotor Output Cycles Kaput，）、腦肌類芳香烴受體核轉位蛋白1 基因（Brain and Muscle ARNT-like Protein 1，）、周期生物鐘蛋白基因（Periods，）、隱花色素生物鐘蛋白基因（Cryptochromes，）、D 位白蛋白啟動子結合蛋白基因（D Site Albumin Promoter Binding Protein，）、核受體亞家族1 D 組成員1 基因（Nuclear Receptor Subfamily 1 Group D Member 1，）、維甲酸相關孤兒受體A 基因（RAR Related Orphan Receptor A，）等，這些生物鐘基因在機體各個組織中通過轉錄翻譯構成了多個相互關聯的正負反饋環(huán)路，并以此為基礎調控眾多鐘控基因的節(jié)律性表達，在機體晝夜節(jié)律性振蕩維持過程中發(fā)揮重要作用。

核受體NR1D1 又被稱為REV-ERB，是哺乳動物生物鐘系統(tǒng)的重要組分，其作為一種轉錄抑制因子，參與調控機體多項生理功能。NR1D1 可與基因啟動子區(qū)的ROR 反應元件（ROR Response Elements，RORE）結合，通過招募輔阻遏子核受體協(xié)同抑制因子1（Nuclear Receptor Corepressor 1，NCoR1）和組蛋白去乙?；?（Histone Deacetylase 3，HDAC3）來抑制核心生物鐘基因的轉錄，NR1D1 還可與等多個生物鐘基因相互作用，維持生物鐘系統(tǒng)的晝夜節(jié)律性振蕩。除了作為生物鐘系統(tǒng)的核心組分外，NR1D1 還參與機體多個生理過程的調控。例如，參與線粒體呼吸和細胞氧化還原平衡的代謝物血紅素被證明是NR1D1 的內源性配體。因此，NR1D1 可作為一種細胞代謝的傳感器，將生物鐘與代謝聯系起來。同時，NR1D1 還可通過抑制炎性因子產生、調節(jié)生理周期等方式，參與調控機體免疫、生殖等多個生理過程。

山羊是一種具有重要經濟價值的反芻動物，如何調控山羊的生長繁殖進程來提高該物種的生產性能一直是畜牧獸醫(yī)領域的研究重點。近年來，小鼠的研究證據表明基因參與調控哺乳動物的生長繁殖，但目前仍未見關于山羊基因克隆及其生物學功能預測的報道?；蛟谏窖蛉聿煌M織中的作用以及對山羊生理功能的調控機制目前尚不清楚。因此，本研究旨在克隆山羊核受體基因的編碼序列（Coding Sequence，CDS）并構建其真核表達載體，以期為后續(xù)研究山羊NR1D1 的生物學功能提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 關中奶山羊卵巢組織購自楊凌楊沛屠宰場。TRIzol、PrimerSTARGXL DNA Polymerase、Quick CutH I 均購自日本TaKaRa 公司，反轉錄試劑盒購自AG 生物工程有限公司，SYBRPremix Ex Taq II 購自日本ToYoBo 公司，大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞、無內毒素質粒中量小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，ClonExpressII One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，HEK293T 細胞購自中國科學院細胞庫，胎牛血清、Opti-MEM 培養(yǎng)基均購自美國Gibco 公司，DMEM 高糖培養(yǎng)基購自Hyclone 公司，TurboFect Transfection Reagent 購自美國ThermoFisher 公司，HRP 標記的鼠抗-actin 抗體購自中國三箭公司，HRP 共軛羊抗兔抗體購自中國中杉金橋公司，ECL HRP 底物試劑盒購自北京迪寧生物科技有限公司。

1.2 引物的設計與合成 根據NCBI 數據庫中山羊基因（登錄號：XM_018065020.1）的CDS 區(qū)，使用Primer Premier 5.0 軟件設計PCR 擴增引物。引物上、下游的5' 端分別添加了與pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體H I 酶切位點互補配對的同源序列，引物序列為：F：5'-AGAGAATTCGATATCGGATCCATGACGAC CCTGGACTCTAACA-3'；R：5'-GGTCTCGAGGGTAC CGGATCCTCACTGGGCGTCCACCCGGAAG-3'（下劃線部分為H I 酶切位點）。引物由西安擎科生物科技有限責任公司合成。

1.3 山羊卵巢組織總RNA 的提取及cDNA 的合成 采用Trizol 法提取山羊卵巢組織總RNA，反轉錄合成cDNA，反應體系10 μL：5×Prime Script RT Master Mix 2.0 μL、Total RNA 2.5 μL（500 ng）、ddHO 5.5 μL。反應程序：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃ 5 min，4℃保存。

1.4 山羊基因CDS 區(qū)PCR 擴增 以cDNA 為模板，擴增山羊基因帶有同源臂的CDS 區(qū)片段。PCR 反應體系50 μL：cDNA 4 μL（50 ng/μL）、10 μmol/L 上下游引物各1 μL、2×Quick Taq HS Dye 25 μL，加ddHO 至50 μL。PCR 反應程序：98 ℃預變性5 min，98℃變性10 s、55℃退火15 s、72℃延伸115 s，循環(huán)35 次，72℃總延伸5 min。對PCR 陽性產物進行瓊脂糖凝膠電泳和膠回收。

1.5 山羊基因真核表達載體的構建及鑒定 使用限制性內切酶H I 對空載體pcDNA3.1-Puro-N-3HA進行單酶切。將目的片段與線性化的真核表達載體進行重組連接，反應體系20 μL：線性化載體0.03 pmol、插入片段0.06 pmol、Exnase II 2 μL、5×CE II Buffer 4 μL、ddHO 加至20 μL，37℃條件下反應15 min。將重組產物轉化大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞，涂板培養(yǎng)后挑取單克隆菌落搖床培養(yǎng)12 h，提取質粒。對重組質粒進行單酶切和PCR 鑒定，結果符合預期后，將重組質粒送至西安擎科生物有限公司測序，將測序正確的重組載體命名為pcDNA3.1-3HA-g。

1.6 細胞培養(yǎng)與轉染 復蘇HEK293T 細胞，培養(yǎng)24 h 后，將狀態(tài)良好的細胞分別傳至1 個6 孔板和6 個60 mm細胞培養(yǎng)皿中，將6 孔板和60 mm 細胞培養(yǎng)皿中的細胞同時各分為2 組：轉染pcDNA3.1-3HA-g組（實驗組）和轉染空質粒pcDNA3.1-Puro-N-3HA 組（對照組）。待細胞密度達60% 左右時，轉染空載體質粒和重組質粒至HEK293T 細胞。6 孔板中，實驗組和對照組各轉染3 孔，轉染24 h 后收樣，用于檢測山羊基因在mRNA 水平的表達；6 個60 mm 細胞培養(yǎng)皿中，實驗組和對照組各轉染3 皿，轉染48 h 后收樣，用于檢測山羊基因在蛋白水平的表達。

1.7 實時熒光定量PCR 檢測基因在mRNA 水平的表達 根據NCBI 數據庫中山羊和人基因的CDS 區(qū)，使用Primer Premier 5.0 設計能同時擴增山羊和人基因CDS 區(qū)的實時熒光定量PCR（qPCR）引物，同時將人基因作為內參基因，qPCR 引物信息見表1。提取實驗組及對照組細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA 進行qPCR，檢測基因在mRNA 水平的表達。qPCR 反應體系20 μL：cDNA 5 μL（5 ng/μL），Premix Ex Taq II 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，ddHO 補足體系。qPCR 反應程序：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40 個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 15 s，95.5℃ 5 s。使用CFX96 熒光定量PCR 儀進行檢測，采用2相對定量法將Ct 值轉化為基因相對表達量。

表1 qPCR 引物序列

1.8 Western Blotting 檢測NR1D1 在蛋白水平的表達利用RIPA 裂解液提取實驗組和對照組細胞的蛋白，使用BCA 法測定蛋白濃度后加入適量上樣緩沖液，100℃沸水煮10 min。進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結束后將蛋白轉印至PVDF 膜上，利用10% 脫脂奶粉，室溫封閉2 h。加入兔抗HA 一抗工作液（1:5 000 稀釋），搖床上緩慢搖動室溫孵育2 h。使用預先配置好的TBST 洗滌液洗膜4 次，每次5 min。將PVDF 膜置于HRP 標記的羊抗兔二抗工作液（1:10 000 稀釋）中，搖床上室溫孵育2 h，洗膜4 次。將膜置于ECL 發(fā)光液中，作用2 min，于暗室中進行曝光顯影。將曝光后的膜取出，洗膜4 次。加入適量的抗體洗脫液，室溫孵育15 min 左右后棄去洗脫液，洗膜3 次。之后移至含有10%脫脂奶粉的平皿中，室溫封閉2 h，洗膜4 次。將PVDF 膜置于HRP 標記的-actin 抗體工作液（1:5 000稀釋）中，于搖床上室溫孵育2 h，之后洗膜4 次。最后將膜置于ECL 發(fā)光液中，作用2 min 后，于暗室中進行曝光顯影。

1.9 生物信息學分析 利用MegAlign、MEGA6、PyMOL與SingalP5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalp）、TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、ProtParam（https：//web.expay.org/protp aram/）、ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）、SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）等生物信息學軟件，結合NCBI數據庫中山羊及其他多個物種的基因序列信息，進行同源性分析，構建系統(tǒng)進化樹；同時對山羊NR1D1 蛋白的理化性質、信號肽、跨膜結構、二級和三級結構等生物學信息進行預測分析。

1.10 數據統(tǒng)計分析 通過GraphPad Prism 6.0 軟件使用檢驗對實驗組及對照組基因的mRNA 相對表達量進行統(tǒng)計學分析，＜0.05 表示具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 山羊基因CDS 區(qū)的成功克隆 對PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，經PCR擴增后獲得與預期大?。? 893 bp，基因CDS區(qū)長度1 851 bp，同源臂42 bp）一致的特異性條帶（圖1），擴增片段單一、明亮，且無非特異性擴增，表明成功獲得山羊基因的CDS 區(qū)片段。

圖1 山羊NR1D1 基因PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.2 重組載體pcDNA3.1-3HA-gNR1D1 的成功構建 對重組載體和空載體進行單酶切，凝膠電泳結果如圖2 所示，重組載體pcDNA3.1-3HA-gNR1D1 單酶切后獲得大小約為5 211 bp 和1 851 bp 的2 個條帶，與空載體單酶切產物條帶和NR1D1 基因PCR 擴增產物條帶大小一致。對重組載體pcDNA3.1-3HA-gNR1D1 進行測序分析，其中基因CDS 區(qū)的測序結果與NCBI 庫中預測序列（XM_018065020.1）完全一致。上述結果表明，pcDNA3.1-3HA-gNR1D1 真核表達載體構建成功。

圖2 pcDNA3.1-3HA-gNR1D1 真核表達載體酶切鑒定

2.3 qPCR 檢測基因在mRNA 水平的表達 提取實驗組和對照組HEK293T 細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA，進行qPCR 反應。qPCR 結果如圖3A 顯示，與對照組相比，pcDNA3.1-3HA-g轉染組的mRNA 表達量升高約680 倍（＜0.001）。上述結果表明，pcDNA3.1-3HA-g轉染組在mRNA 水平成功實現山羊基因的過表達。

2.4 Western Blotting 檢測基因在蛋白水平的表達 提取實驗組和對照組HEK293T 細胞的總蛋白，經Western Blotting 檢測，結果如圖3B 所示，用HA 抗體孵育后，pcDNA3.1-3HA-g轉染組在72 kDa 處出現1 條明顯的條帶，與預期大小相符，而對照組在目的蛋白位置無條帶。上述結果表明，pcDNA3.1-3HAg轉染組NR1D1 蛋白在HEK293T 細胞中成功過表達。

圖3 山羊NR1D1 基因在pcDNA3.1-3HA-gNR1D1轉染組的表達效率

2.5 生物信息學分析

2.5.1 基因序列分析及系統(tǒng)進化樹構建 利用MegAlign及MEGA6 將山羊基因CDS 區(qū)與其他物種的基因CDS 區(qū)進行同源性比對，并構建系統(tǒng)進化樹。同源性比對結果如圖4 所示，山羊基因CDS 區(qū)與綿羊相似性最高（99.6%），其次為牛（98.2%）和豬（95.1%），與斑馬魚相似性最低（65.1%）。系統(tǒng)進化樹結果顯示，山羊基因與綿羊處于同一小分支，親緣關系最近，而與斑馬魚親緣關系最遠（圖5）。

圖4 NR1D1 基因CDS 區(qū)同源性比對

圖5 NR1D1 基因CDS 區(qū)遺傳進化樹分析

2.5.2 蛋白理化性質預測 應用ProtParam 在線軟件對山羊NR1D1 蛋白理化性質進行分析，NR1D1 蛋白的氨基酸組成如表2 所示，山羊NR1D1 蛋白分子式為CHNOS，共包含氨基酸616 個，原子總數為9 268，分子量約為67.012 ku，理論等電點為8.75，總平均親水性（GRAVY）為-0.496。不穩(wěn)定系數64.82，為不穩(wěn)定蛋白。應用ProtScale 在線軟件對山羊NR1D1 蛋白氨基酸序列的親水性進行預測，結果顯示，最低分值（-2.822）位于第214 位氨基酸，表明親水性最強；最高分值（2.633）位于第544 位氨基酸，表明疏水性最強；且該蛋白大部分位于親水區(qū)域，故山羊NR1D1 蛋白為親水性蛋白（圖6）。

表2 山羊NR1D1 蛋白氨基酸組成

圖6 山羊NR1D1 蛋白親水性預測

2.5.3 蛋白跨膜結構及信號肽預測 應用TMHMM Server v.2.0 對山羊NR1D1 蛋白跨膜結構進行預測，結果顯示，山羊NR1D1 蛋白不含跨膜區(qū)。應用SingalP 5.0對山羊NR1D1 蛋白進行信號肽預測，結果顯示，山羊NR1D1 蛋白不含信號肽。

2.5.4 蛋白二級結構預測 應用SOPMA 在線軟件對山羊NR1D1 蛋白的二級結構進行預測，結果顯示，山羊NR1D1 蛋白中-螺旋、延伸鏈、-轉角和無規(guī)則卷曲所占比例分別為26.62%、12.50%、6.17% 和54.71%，說明山羊NR1D1蛋白二級結構以無規(guī)則卷曲為主（圖7）。

圖7 山羊NR1D1 蛋白二級結構預測

2.5.5 蛋白三級結構預測及比對 應用在線軟件SWISSMODEL 預測山羊、小鼠和人NR1D1 蛋白的三級結構，結果如圖8 所示。使用PyMOL 對預測模型進行比較，結果顯示，山羊與小鼠NR1D1 蛋白模型間原子位置均方根偏差（Root-Mean-Square Deviation，RMSD）為0.538，與人NR1D1 蛋白模型的RMSD 為0.727，說明山羊NR1D1 蛋白與小鼠和人之間的差異較小。

圖8 山羊、小鼠、人NR1D1 蛋白三級結構預測及比較

3 討 論

生物鐘存在于哺乳動物幾乎所有的細胞、組織和器官中，協(xié)同調控哺乳動物的大量行為、生理過程與晝夜明暗循環(huán)相適應。隨著人們對生物鐘系統(tǒng)研究和理解的不斷深入，生物鐘在哺乳動物各項生理過程中發(fā)揮的作用及其調控機制受到越來越多的關注。生物鐘紊亂可能引發(fā)嚴重的睡眠障礙、肥胖、心血管疾病、代謝疾病、免疫功能障礙及癌癥等多種疾病，且有證據表明，、等生物鐘基因的缺失會嚴重影響小鼠的生殖能力。

核受體基因于1989 年被發(fā)現定位于編碼甲狀腺激素受體基因的反向鏈。的轉錄受CLOCK/BMAL1 所形成異源二聚體的驅動而激活，隨后NR1D1 蛋白又反過來與啟動子中順式作用元件RORE 結合來抑制基因轉錄，進而實現對下游生物鐘基因（）、（）和大量鐘控基因轉錄的調控。作為一種轉錄抑制因子，在機體的生物鐘系統(tǒng)以及內分泌、生殖、免疫等多個系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。近年來，人們更多地關注到基因與包括心血管疾病、炎癥、代謝紊亂和癌癥在內的多種疾病存在密切的聯系。許多研究證據表明，在多種疾病的發(fā)展過程中，的節(jié)律性表達發(fā)生紊亂?；蛉笔∈髸円构?jié)律紊亂，代謝平衡破壞，且表現出行為異常，包括多動癥及學習記憶能力受損等。還有研究發(fā)現，NR1D1 激動劑SR9009 和SR9011 給藥會改變小鼠黑暗條件下的晝夜節(jié)律行為和核心生物鐘基因（等）的節(jié)律性表達，且能夠增加能量消耗并降低脂肪含量、血漿甘油三酯和膽固醇水平，提示通過激動劑調控NR1D1 的活性可能有助于治療睡眠障礙和代謝疾病。同時，SR9009 和SR9011 對自噬和脂肪從頭合成的調控在引發(fā)惡性細胞凋亡的反應中具有關鍵作用，說明對生物鐘系統(tǒng)的藥理學調節(jié)可能是對抗癌癥的有效治療策略。上述證據表明，NR1D1 作為一種重要的生物鐘系統(tǒng)組分，在機體的生理穩(wěn)態(tài)調控中起著重要作用，探究它的生理功能和作用機制，或可為多種疾病的治療提供新思路和靶點。

作為一種具有重要經濟價值的反芻動物，山羊在我國養(yǎng)殖歷史久、分布范圍廣。已有模式動物的研究證據表明，哺乳動物生物鐘系統(tǒng)在調控生殖與代謝等生理過程中發(fā)揮重要作用。然而，目前關于生物鐘的研究大多集中于大鼠、小鼠等嚙齒類動物，關于山羊生物鐘的研究則相對較少。如能進一步深入探究生物鐘系統(tǒng)在山羊繁殖與代謝過程中所發(fā)揮的具體作用及其調控機制，可以更好地服務于生產實踐。Xiao 等研究發(fā)現生物鐘基因通過調節(jié)類固醇激素合成關鍵酶基因的轉錄，參與調控山羊睪丸間質細胞睪酮的合成，提供了生物鐘影響山羊生殖過程的證據。Zhang 等證實了山羊皮膚中存在生物鐘，且生物鐘系統(tǒng)可調節(jié)內蒙古白絨山羊毛囊的生長周期。Gao等研究發(fā)現，山羊生物鐘基因可能在調控山羊瘤胃上皮細胞增殖、短鏈脂肪酸轉運及脂質代謝方面發(fā)揮作用。上述證據表明，生物鐘基因在山羊生長繁殖的調控過程中發(fā)揮重要作用，但目前仍未見有關生物鐘基因調控山羊各項生理過程的研究報道。山羊基因位于19 號染色體，包含8 個外顯子，CDS區(qū)全長1 851 bp，共編碼616 個氨基酸?；谇捌谘芯炕A，本研究成功克隆了山羊基因的CDS 區(qū)并構建了真核表達載體，將重組質粒轉染至HEK293T 細胞后，驗證了在mRNA 和蛋白水平的過表達。上述研究證據提示，山羊NR1D1 可能在反芻動物細胞晝夜節(jié)律性振蕩的維持和各項生理過程中發(fā)揮重要作用，但具體的作用機制尚需進一步的試驗研究。

4 結 論

本研究成功構建了pcDNA3.1-3HA-g真核表達載體，并在mRNA 和蛋白水平驗證了山羊基因在HEK293T 細胞的表達效率。同時，本研究對山羊基因及其蛋白進行了深入的生物信息學分析，結果表明，山羊基因CDS 區(qū)與綿羊、牛等反芻動物有較高的相似性，山羊NR1D1 蛋白為不穩(wěn)定蛋白，不含跨膜區(qū)和信號肽，三級結構與人和小鼠NR1D1 蛋白較為相似。本研究為后續(xù)進一步探究山羊基因的生物學功能提供了前期基礎。