晏子越，彭 弟，吳占運(yùn)，高 惠，胡良臣，馬澤芳*，崔 凱*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.鄄城縣畜牧服務(wù)中心，山東菏澤 274600；3.膠州市九龍街道辦事處農(nóng)業(yè)辦，山東青島 266300）

水貂（）屬哺乳綱（Mammalia）、食肉目（Carnivoraes）、鼬科（Mustelidae）、鼬屬（），生殖特性明顯受季節(jié)性變化影響，主要與光周期調(diào)節(jié)松果體合成和分泌褪黑激素（Melatonin，MLT）的節(jié)律有關(guān)。有研究表明，對(duì)長(zhǎng)日照動(dòng)物家貓、馬、狐等外源注入MLT，其生殖活動(dòng)受到抑制，對(duì)短日照動(dòng)物綿羊、山羊、鹿等外源注入MLT 后生殖活動(dòng)顯著增強(qiáng)，表明外源MLT 可抑制長(zhǎng)日照動(dòng)物、促進(jìn)短日照動(dòng)物的生殖活動(dòng)。然而外源MLT 對(duì)短日照動(dòng)物—水貂生殖活動(dòng)影響的報(bào)道較少，僅見(jiàn)宋興超等對(duì)公貂埋植120 d MLT 后發(fā)現(xiàn)，公貂睪丸重量顯著增加；邵麗曉等對(duì)間情期母貂埋植MLT 發(fā)現(xiàn)，處于第IV 階段的卵泡比I、II、III 階段出現(xiàn)較多的閉鎖卵泡。綜上研究表明，外源MLT 可提高公貂睪丸重量，影響間情期母貂閉鎖卵泡數(shù)量，但有關(guān)MLT 對(duì)配種準(zhǔn)備期母貂生殖活動(dòng)影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比埋植MLT 172 d 和未埋植MLT 配種準(zhǔn)備期水貂的卵巢，探討MLT 對(duì)水貂卵巢形態(tài)學(xué)和卵泡發(fā)育的影響，為MLT 埋植劑應(yīng)用于水貂生產(chǎn)實(shí)踐和指導(dǎo)埋植MLT 埋植劑的水貂應(yīng)用于繁殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 于山東省諸城市（119°E，35°N）某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)選取3 月齡健康、體重均勻（870±5）g 的白色水貂母貂200 只，隨機(jī)平均分為埋植組和對(duì)照組，每組100 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 只。試驗(yàn)于2020 年7 月7 日—2020 年12 月26 日進(jìn)行，共172 d。于試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天對(duì)埋植組水貂頸部皮下埋植1 粒MLT埋植劑（含MLT 18 mg/粒），對(duì)照組不作任何處理；于試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天隨機(jī)選取埋植組和對(duì)照組水貂各3 只，采集卵巢樣本，進(jìn)行形態(tài)學(xué)和卵泡發(fā)育的觀察與測(cè)定。

水貂飼養(yǎng)于南北走向、東西通風(fēng)的棚舍內(nèi)，采用單籠飼養(yǎng)，棚舍與籠箱均保持清潔干凈，專人管理，定時(shí)飼喂，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（按干物質(zhì)計(jì)算）

1.2 卵巢的采集及處理 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，選取2 組水貂各3 只，CO窒息法處死后立即剖腹取卵巢，置于含有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，共計(jì)12 枚，于10 min 內(nèi)完成培養(yǎng)皿內(nèi)卵巢形態(tài)學(xué)觀察和記錄可視卵泡數(shù)量。用游標(biāo)卡尺（200 nm）測(cè)量卵巢長(zhǎng)、寬、厚，并計(jì)算體積；用電子天平（1/10 000）稱量卵巢重量；將每只水貂右側(cè)卵巢置于含有10%甲醛溶液的15 mL 離心管內(nèi)，做好標(biāo)記，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，室溫條件保存48 h 以上，待組織切片備用。

1.3 卵巢組織切片的制作及觀察 將固定48 h 后的卵巢用水稍加清洗后進(jìn)行修塊，然后依次按酒精梯度（50%、70%、80%、95%、100%）進(jìn)行脫水，利用二甲苯溶液進(jìn)行透明，并放入已溶的石蠟內(nèi)于恒溫箱（DH-250 型）浸蠟，做成保有卵巢組織的蠟塊，將其切成四周留約2 mm 的方形或長(zhǎng)方形蠟塊，然后使用手搖式組織切片機(jī)（RM2235，Leica）將石蠟塊切為厚約5 μm 的蠟片，每連續(xù)7 張取1 張蠟片，每個(gè)卵巢組織取6 張，共計(jì)36 張，做好標(biāo)記，蘇木素-伊紅染色后，用BK5000 光學(xué)顯微鏡分別在4×學(xué)顯倍、10 顯微鏡倍、20 顯微0 倍和40×10 倍下觀察成熟卵泡、三級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和初級(jí)卵泡及原始卵泡的形態(tài)，用目鏡測(cè)微尺測(cè)量各級(jí)卵泡的直徑、卵母細(xì)胞直徑和透明帶厚度，用計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)單位面積（1 000 μm）內(nèi)各級(jí)卵泡數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用Excel 處理數(shù)據(jù)，利用SPSS 20.0軟件中的獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，＞0.05 代表差異不顯著，＜0.05 代表差異顯著，＜0.01 代表差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 卵巢形態(tài)學(xué)和可視卵泡數(shù)量測(cè)定結(jié)果 由表2 可知，埋植組卵巢僅寬度與對(duì)照組沒(méi)有差異，長(zhǎng)、厚、體積、重量均大于對(duì)照組（＜0.01），可視卵泡數(shù)量多于對(duì)照組（＜0.05）。說(shuō)明MLT 埋植劑埋植172 d 可促進(jìn)卵巢長(zhǎng)、厚、體積和重量的增加及可視卵泡數(shù)量的增多，對(duì)寬度沒(méi)有影響。

表2 卵巢形態(tài)學(xué)和可視卵泡數(shù)量測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.2 各級(jí)卵泡和卵母細(xì)胞數(shù)量、直徑及透明帶厚度測(cè)定結(jié)果 本試驗(yàn)共計(jì)比較了30 個(gè)原始卵泡，30 個(gè)初級(jí)卵泡，15 個(gè)次級(jí)卵泡，3 個(gè)三級(jí)卵泡和3 個(gè)成熟卵泡，2組各級(jí)卵泡形態(tài)見(jiàn)圖1、圖2，對(duì)兩組各級(jí)卵泡相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量分析得表3。由表3 可知，與對(duì)照組相比，埋植組原始卵泡和初級(jí)卵泡數(shù)量均增多（＜0.01），次級(jí)卵泡數(shù)量差異不顯著，埋植組有發(fā)育完好的三級(jí)卵泡和成熟卵泡，對(duì)照組無(wú)三級(jí)卵泡和成熟卵泡；從原始卵泡到初級(jí)卵泡，初級(jí)卵泡到次級(jí)卵泡的生長(zhǎng)速度2 組分別為1.7～2.0、3.3～3.5 倍，埋植組從次級(jí)卵泡到三級(jí)卵泡，三級(jí)卵泡到成熟卵泡的生長(zhǎng)速度分別為1.7、2.7倍；從原始卵母細(xì)胞到初級(jí)卵母細(xì)胞，初級(jí)卵母細(xì)胞到次級(jí)卵母細(xì)胞2 組生長(zhǎng)速度分別為1.0～1.2、1.7～1.8 倍，埋植組從次級(jí)卵母細(xì)胞到三級(jí)卵母細(xì)胞，三級(jí)卵母細(xì)胞到成熟卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)速度分別為1.4、1.1 倍；2 組均在次級(jí)卵泡階段開(kāi)始出現(xiàn)透明帶，埋植組透明帶厚度從次級(jí)卵泡到三級(jí)卵泡，三級(jí)卵泡到成熟卵泡的生長(zhǎng)速度分別為1.6、1.3 倍。說(shuō)明MLT 埋植劑埋植172 d 可促進(jìn)原始卵泡和初級(jí)卵泡數(shù)量的增多及有腔卵泡的提前發(fā)育，而對(duì)次級(jí)卵泡數(shù)量及腔前卵泡的直徑、卵母細(xì)胞直徑和透明帶厚度沒(méi)有影響。

表3 各級(jí)卵泡和卵母細(xì)胞數(shù)量、直徑及透明帶厚度測(cè)定結(jié)果

圖1 對(duì)照組各級(jí)卵泡形態(tài)

圖2 埋植組各級(jí)卵泡形態(tài)

3 討 論

3.1 MLT 埋植劑對(duì)卵巢形態(tài)和可視卵泡數(shù)量的影響 水貂繁殖規(guī)律明顯受季節(jié)性變化影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)埋植MLT 埋植劑結(jié)果顯示，埋植組卵巢長(zhǎng)、厚、體積和重量較對(duì)照組顯著增加，可視卵泡數(shù)量顯著增多，而卵巢寬度無(wú)顯著變化，與MLT 能促進(jìn)短日照動(dòng)物綿羊、鹿等動(dòng)物生殖活動(dòng)的結(jié)果一致，表明MLT 埋植劑亦可促進(jìn)水貂卵巢發(fā)育。這與水貂的繁殖規(guī)律和外界光照長(zhǎng)度變化調(diào)控自身MLT 分泌模式有關(guān)，外界光照信號(hào)作用于視網(wǎng)膜產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的神經(jīng)傳導(dǎo)到達(dá)頸上神經(jīng)節(jié)（SCG），由SCG 將交感信息傳給松果體，松果體作為神經(jīng)-內(nèi)分泌轉(zhuǎn)換器將神經(jīng)輸入信號(hào)轉(zhuǎn)化為內(nèi)分泌信息輸出，根據(jù)外界光照信息的變化調(diào)節(jié)去甲腎上腺素（ME）的分泌量，進(jìn)一步調(diào)節(jié)MLT 的合成與分泌，從而晝夜長(zhǎng)短的變化引起MLT 分泌節(jié)律的變化。

本實(shí)驗(yàn)埋植MLT 埋植劑相當(dāng)于代替光周期變化直接改變動(dòng)物機(jī)體MLT 的分泌量，其可穿過(guò)所有細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)入所有組織，通過(guò)直接和間接兩種作用方式影響生殖系統(tǒng)的變化，一方面直接作用于卵巢上MLT 的結(jié)合位點(diǎn)，另一方面間接作用于下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸，從而促進(jìn)卵巢發(fā)育。而本實(shí)驗(yàn)中埋植組與對(duì)照組的卵巢寬度差異不顯著，可能與卵巢自身結(jié)構(gòu)發(fā)育規(guī)律有關(guān)，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 MLT 埋植劑對(duì)各級(jí)卵泡數(shù)量、直徑、卵母細(xì)胞直徑和透明帶厚度的影響 本實(shí)驗(yàn)中2 組原始卵泡到初級(jí)卵泡再到次級(jí)卵泡，原始卵母細(xì)胞到初級(jí)卵母細(xì)胞再到次級(jí)卵母細(xì)胞的的生長(zhǎng)速度均一致，說(shuō)明MLT 埋植劑對(duì)卵泡和卵母細(xì)胞的發(fā)育速度沒(méi)有影響。卵泡發(fā)育速度在初級(jí)卵泡到次級(jí)卵泡階段發(fā)育較快，這是由于顆粒細(xì)胞的快速增殖引起的，卵母細(xì)胞從初級(jí)階段到次級(jí)階段發(fā)育較快，到三級(jí)和成熟階段逐漸緩慢，其中卵母細(xì)胞的發(fā)育速度慢于卵泡的發(fā)育速度，這是由于卵泡腔的快速增大引起卵泡發(fā)育較快，而卵母細(xì)胞到后期基本不再變化，這與李克美闡述的卵泡發(fā)育規(guī)律相一致。透明帶厚度在次級(jí)卵泡到三級(jí)卵泡的階段快于三級(jí)卵泡到成熟卵泡階段。

本試驗(yàn)埋植組腔前卵泡中原始卵泡和初級(jí)卵泡數(shù)量顯著增多，腔前卵泡的直徑、卵母細(xì)胞直徑和透明帶厚度變化不顯著。與毛夢(mèng)菌等對(duì)豬腔前卵泡培養(yǎng)基中添加不同濃度的MLT 引起各組間卵泡生長(zhǎng)但直徑差異不顯著的結(jié)果相一致。又據(jù)Adriaens 等報(bào)道添加MLT 的鼠腔前卵泡培養(yǎng)基中雄激素和孕激素的生成量增多。同時(shí)Shanghnessy 等研究發(fā)現(xiàn)切除垂體的兔和羊卵泡數(shù)量顯著少于正常組。說(shuō)明MLT 對(duì)卵泡發(fā)育的作用與卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖分化無(wú)關(guān)，可能與MLT 調(diào)節(jié)性激素分泌間接作用于卵泡數(shù)量有關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)次級(jí)卵泡數(shù)量差異不顯著的機(jī)理尚不明確，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究，同時(shí)為探究MLT 對(duì)水貂體外培養(yǎng)條件下卵母細(xì)胞的發(fā)育奠定基礎(chǔ)。

本研究中，埋植MLT 組有腔卵泡提前發(fā)育，這與趙英等對(duì)休情期銀黑狐埋植7 個(gè)月MLT 可促進(jìn)有腔卵泡發(fā)育的研究結(jié)果相一致。一方面可能與MLT 作用于HPG 軸間接調(diào)節(jié)性激素的分泌作用有關(guān)，卵泡的發(fā)育與促卵泡生成素（FSH）和促黃體生成素（LH）密切相關(guān)，MLT 進(jìn)入到卵泡后會(huì)誘導(dǎo)一系列mRNA 的表達(dá)，在人的顆粒細(xì)胞中，MLT 可增加促黃體生成素受體（LH-R）mRNA、促性腺激素釋放激素（GnRH）mRNA、促性腺激素釋放激素受體（GnRH-R）mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育；另一方面可能與MLT的抗凋亡作用有關(guān)，過(guò)多的活性氧（ROS）可導(dǎo)致卵泡閉鎖，而MLT 及其代謝產(chǎn)物是強(qiáng)大的自由基清除劑，能夠降低氧化酶基因的表達(dá)，清除ROS，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，從而保護(hù)卵泡的繼續(xù)成長(zhǎng)，成為優(yōu)勢(shì)卵泡。因此，細(xì)胞外信號(hào)和卵泡內(nèi)因子的共同協(xié)同調(diào)節(jié)促進(jìn)有腔卵泡的提前發(fā)育，同時(shí)證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)中卵巢形態(tài)學(xué)的發(fā)育與內(nèi)部卵泡發(fā)育有關(guān)。為跟蹤水貂繁殖性能的狀況，探究MLT 埋植劑是否可提高水貂繁殖性能提供前期基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MLT 埋植劑（18 mg/ 只）埋植172 d 對(duì)配種準(zhǔn)備期水貂卵巢發(fā)育、可視卵泡、原始卵泡和初級(jí)卵泡數(shù)量增多及有腔卵泡的提前發(fā)育均有促進(jìn)作用，但對(duì)卵巢寬度、次級(jí)卵泡數(shù)量及腔前卵泡的直徑、卵母細(xì)胞直徑和透明帶厚度沒(méi)有影響。