陳治徽，陳 林，張力莉，刁其玉，李勝利，畢研亮*，徐曉鋒*

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室反芻動(dòng)物及其幼畜營(yíng)養(yǎng)代謝中美聯(lián)合研究中心，北京 100081；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

隨著畜牧業(yè)規(guī)模化、集約化的發(fā)展，早期斷奶技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。早期斷奶可減少代乳粉和牛奶的使用，降低犢牛飼養(yǎng)成本，并且可以有效刺激犢牛提前適應(yīng)固體飼料，加快犢牛瘤胃的發(fā)育，從而為后期取得良好的生產(chǎn)性能奠定基礎(chǔ)。但早期斷奶產(chǎn)生的應(yīng)激不僅會(huì)對(duì)犢牛健康、生長(zhǎng)發(fā)育和免疫機(jī)能產(chǎn)生影響，也會(huì)對(duì)犢牛后期的生產(chǎn)性能產(chǎn)生較大影響。犢牛斷奶應(yīng)激往往伴隨著生理指標(biāo)和組織器官結(jié)構(gòu)改變，而血液成分的相對(duì)穩(wěn)定和腸道黏膜屏障的完整與健康是保證其犢牛生長(zhǎng)和后期高生產(chǎn)的基礎(chǔ)。目前大多數(shù)研究主要集中于犢牛斷奶應(yīng)激發(fā)生原因和如何緩解犢牛斷奶應(yīng)急，但關(guān)于由斷奶應(yīng)激引起的犢牛斷奶前后血液生化及腸道通透性變化規(guī)律的研究甚少。本試驗(yàn)旨在研究犢牛斷奶前后其血液生化和腸道通透性的變化規(guī)律，進(jìn)一步解釋斷奶應(yīng)激的形成，為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2019 年5—10 月在寧夏某牧場(chǎng)開展。選擇健康、體重相近的50 日齡荷斯坦母犢牛12 頭，采用大圈飼養(yǎng)。試驗(yàn)期31 d，（斷奶前7 d，斷奶后21 d）。試驗(yàn)開始后每日早晚各飼喂代乳粉1 次，采用自由飲水和自由采食開食料，犢牛60 日齡斷奶。開食料組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 開食料組成及營(yíng)養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 樣品采集 分別在斷奶前2 d 及斷奶后1、2、3 周通過頸靜脈采血10 mL 采集12 頭斷奶犢牛血液，置于肝素鈉采血管中，3 000 r/min 離心15 min，吸取上清液，-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.3 血液中應(yīng)激和免疫及生化指標(biāo)測(cè)定 血清葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、堿性磷酸酶（ALP）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）均采用邁瑞B(yǎng)S-180 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，試劑盒均為深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品。血液白細(xì)胞介素-1（IL-1）、Toll 樣受體4（TLR4）、結(jié)合珠蛋白（HP）采用江蘇晶美生物科技有限公司的ELISA試劑盒，利用酶標(biāo)儀（TECAN INFINITE F50）測(cè)定。

1.4 腸道通透性指標(biāo)測(cè)定 閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）、乳酸（D-LA）、二胺氧化酶（DAO），采用江蘇晶美生物科技有限公司的ELISA 試劑盒，利用酶標(biāo)儀（TECAN INFINITE F50）測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用 Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SAS 8.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，若差異顯著則利用Duncan's 法進(jìn)行多重分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，＜0.05 表示差異顯著，＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 犢牛斷奶后血液生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的變化規(guī)律 由表2 可知，斷奶后3 周GLU 高于斷奶后1、2 周（＜0.01），但低于斷奶前2 d（＜0.01）；斷奶前2 d 犢牛BUN、TC、TG 含量高于斷奶后1、2、3 周（＜0.01），ALP 含量高于斷奶后1 周（＜0.01），而斷奶前2 d 犢牛血液TP、GLB、AST 含量低于斷奶后1、2、3 周（＜0.01），斷奶后3 周ALP 含量高于斷奶前2 天（＜0.01）。斷奶前2 d 犢牛血液IL-1含量低于斷奶后1、2、3 周（＜0.01），HP 含量低于斷奶后1、2、3 周（＜0.05），而TLR4含量則低于斷奶后3 周（＜0.05）。

表2 犢牛斷奶后血液生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的變化規(guī)律

2.2 犢牛斷奶后腸道通透性指標(biāo)變化規(guī)律 由表3 可知，犢牛斷奶后1 周血液ZO-1 略有升高（＞0.05），斷奶后1、2 周D-LA 相較于斷奶前2 d 有上升趨勢(shì)（＞0.05），而斷奶后3 周犢牛血液DAO 含量高于斷奶前2 d（＜0.01）

表3 犢牛斷奶后腸道通透性指標(biāo)變化規(guī)律

3 討 論

3.1 犢牛斷奶后血液生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的變化規(guī)律GLU 是動(dòng)物體內(nèi)各組織細(xì)胞活動(dòng)的能量來(lái)源，GLU 濃度主要受胰島素及胰高血糖素調(diào)節(jié)，當(dāng)GLU 濃度過低時(shí)刺激胰高血糖素等激素分泌并會(huì)啟動(dòng)糖異生途徑來(lái)維持GLU 恒定。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，60 日齡斷奶會(huì)降低犢牛GLU 濃度，且斷奶后1、2、3 周GLU 濃度極顯著低于斷奶前2 d。周玉香、趙會(huì)利研究結(jié)果也顯示，早期斷奶應(yīng)激會(huì)引起GLU 含量和胰島素水平降低，BUN 含量和胰高血糖素水平顯著升高，犢牛斷奶之前其營(yíng)養(yǎng)來(lái)源主要是通過攝入牛奶中易于消化吸收的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、脂肪和乳糖等，而斷奶后犢牛攝入的開食料、全價(jià)料和飼草等只能提供碳源和氮源的化合物，需要經(jīng)過瘤胃的發(fā)酵、降解等來(lái)合成犢牛自身所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這也使得犢牛在斷奶后腸道結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力下降。斷奶后從小腸中吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量迅速減少，蛋白攝入量不能滿足糖異生，從而降低了葡萄糖含量，使GLU 無(wú)法保持相對(duì)穩(wěn)定。有研究表明，GLU 濃度隨著犢牛年齡增長(zhǎng)和瘤胃功能的發(fā)展而降低。GLU 濃度過低還會(huì)導(dǎo)致大腦中葡萄糖供應(yīng)不足而出現(xiàn)功能失調(diào)，影響犢牛健康和日增重等。

BUN 是評(píng)價(jià)動(dòng)物機(jī)體氨基酸和蛋白質(zhì)代謝平衡狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。正常情況下BUN 濃度較低，表明動(dòng)物機(jī)體氨基酸代謝正常，機(jī)體蛋白質(zhì)合成率較高。本試驗(yàn)中，60 日齡斷奶增加了BUN 濃度，斷奶后1、2、3 周BUN 濃度均極顯著高于斷奶前2 d，表明斷奶應(yīng)激導(dǎo)致犢牛體蛋白大量分解，犢牛肝臟還未完全適應(yīng)能量供應(yīng)由乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)榱鑫笓]發(fā)性脂肪酸的方式。血液TP 濃度可體現(xiàn)機(jī)體免疫力以及代謝水平，提高其濃度有利于提高機(jī)體免疫力和代謝水平。本試驗(yàn)中，犢牛斷奶后血液TP、GLB 濃度極顯著高于斷奶前2 d，并隨日齡的增加逐漸增加，表明斷奶后犢牛隨著日齡的增加代謝水平和免疫力逐漸提高。

斷奶應(yīng)激會(huì)通過內(nèi)部和外部感受器同時(shí)刺激動(dòng)物下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）引起交感神經(jīng)興奮，引發(fā)下丘腦釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）與血管增壓素（VP）協(xié)同調(diào)控腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素。本試驗(yàn)中血液TC 極顯著降低表明犢牛應(yīng)激時(shí)TC利用提高，機(jī)體對(duì)斷奶應(yīng)激的反應(yīng)強(qiáng)烈。全炳昭等在研究早期斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，TC 與早期斷奶應(yīng)激呈負(fù)相關(guān)。TG 水平可直接反映脂肪消化吸收的狀態(tài)。本試驗(yàn)中，犢牛斷奶后血液TG 濃度極顯著低于斷奶前2 d，其原因可能是斷奶應(yīng)激引起機(jī)體能量需求增加，而應(yīng)激影響了脂類物質(zhì)在胃腸組織中的消化吸收，因此機(jī)體通過增加脂肪動(dòng)員來(lái)增加能量來(lái)源，此外肝外組織對(duì)類脂的需要量增加，導(dǎo)致斷奶后血液TG 濃度極顯著低于斷奶前2 d。隨著斷奶后犢牛日齡增加，TG 的濃度也隨之增加，但斷奶后3 周TG 濃度仍低于斷奶前2 d，表明本試驗(yàn)中犢牛的斷奶應(yīng)激還在持續(xù)，研究時(shí)間應(yīng)該延長(zhǎng)。

ALP 主要在動(dòng)物肝臟、腎臟、骨骼和腸道等組織分布，是通過肝臟向膽外排出，因此ALP 的活性也能反映動(dòng)物的生長(zhǎng)狀況，可作為骨骼生長(zhǎng)的標(biāo)記物。有研究顯示，ALP 有降低腸道炎癥反應(yīng)和病原菌易感性等作用，腸道中ALP 的活性與腸道內(nèi)養(yǎng)分有效性和供應(yīng)量有關(guān)聯(lián)。本試驗(yàn)中，犢牛斷奶后1 周血液ALP含量極顯著低于斷奶前2 d，但斷奶后2 周恢復(fù)到正常水平，表明斷奶后1 周犢牛生長(zhǎng)健康受到的影響較大。

TLR4 是一類天然免疫受體，也是參與適應(yīng)性免疫的重要蛋白，可以在T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞表達(dá)，也是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁。長(zhǎng)期慢性應(yīng)激可激活TLR4 基因表達(dá)量顯著升高，進(jìn)而可能導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和慢性疾病。本試驗(yàn)中，斷奶后3 周犢牛血液TLR4 受體顯著高于斷奶前2 d，而斷奶后1、2 周比斷奶前2 d 也有升高趨勢(shì)，表明TLR4 引發(fā)的炎癥反應(yīng)可能長(zhǎng)期存在于動(dòng)物體內(nèi)并損傷動(dòng)物機(jī)體的健康。張千等研究斷奶應(yīng)激對(duì)幼齡反芻動(dòng)物免疫系統(tǒng)的影響及機(jī)理時(shí)指出，斷奶后炎癥可能會(huì)長(zhǎng)期存在于動(dòng)物體內(nèi)并對(duì)動(dòng)物的健康造成損害。

IL-1是激活TLR4 的主要促炎因子，IL-1與機(jī)體免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，且具有改變神經(jīng)內(nèi)分泌等多方面的功能。也有研究表明，IL-1是一個(gè)潛在的應(yīng)激誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，可以刺激肝臟急性蛋白合成，增強(qiáng)機(jī)體炎癥反應(yīng)，造成組織損傷。本試驗(yàn)中，斷奶后1、2、3 周犢牛血液IL-1基因表達(dá)量均極顯著高于斷奶前2 d，表明斷奶犢牛機(jī)體可能產(chǎn)生了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間存在炎癥因子或炎癥反應(yīng)時(shí)，機(jī)體會(huì)消耗大量能量物質(zhì)以促進(jìn)免疫系統(tǒng)消除炎癥（因子）反應(yīng)，這也使得動(dòng)物的生產(chǎn)性能受到影響。

HP 是與游離血紅蛋白（Hb）結(jié)合形成Hp-Hb 復(fù)合物的載體蛋白，其作用是將Hb 轉(zhuǎn)用至肝臟中進(jìn)行代謝。本試驗(yàn)中，斷奶后1、2、3 周犢牛血液基因表達(dá)量顯著高于斷奶前2 d，可能是因?yàn)閿嗄虘?yīng)激使得犢牛血液蛋白發(fā)生改變，激活了單核巨噬細(xì)胞中的核因子B（NF-B），使其進(jìn)入核內(nèi)與許多細(xì)胞因子以及炎癥介質(zhì)基因5'端調(diào)控區(qū)的B 序列發(fā)生結(jié)合并啟動(dòng)該基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致血液HP 含量升高。

3.2 犢牛斷奶后腸道通透性指標(biāo)的變化規(guī)律 ZO-1 主要存在于腸道、血管內(nèi)皮等組織器官中，是上皮細(xì)胞緊密連接重要結(jié)構(gòu)蛋白的組成成分，ZO-1 與眾多組織上皮細(xì)胞的緊密連接相關(guān)蛋白相互作用。本試驗(yàn)中，犢牛在斷奶后1 周血液中ZO-1 略有升高，這表明斷奶應(yīng)激會(huì)對(duì)犢牛腸道、血管內(nèi)皮等組織產(chǎn)生影響，但不明顯。D-LA 是腸道內(nèi)眾多固有細(xì)菌可以產(chǎn)生的代謝物，但D-LA 在其他組織中均不產(chǎn)生和代謝，然而當(dāng)腸道屏障受損時(shí)，腸道細(xì)菌產(chǎn)生大量的D-LA 就會(huì)透過受損腸道屏障進(jìn)入血循環(huán)，增加血液中D-LA 含量，因此D-LA 含量的高低可作為腸道健康狀況和腸道屏障功能是否受損的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，犢牛在斷奶前2 d 和斷奶1、2、3 周血液中D-LA 含量存在上升趨勢(shì)，但未發(fā)生顯著性變化，這表明由牛奶轉(zhuǎn)變?yōu)殚_食料這一過程中犢牛腸道屏障會(huì)受到損傷。DAO 是一種含有脫胺的腐胺和組胺的細(xì)胞內(nèi)酶，腸道黏膜是其存在的主要部位，正常機(jī)體血液中的含量極少。DAO 活性也是反映小腸功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，正常情況下血液中DAO趨于穩(wěn)定，但當(dāng)小腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞損傷時(shí)，血清中DAO 水平會(huì)急劇增高，因此測(cè)定血中DAO 活性可反映腸屏障黏膜損傷和修復(fù)的情況。本試驗(yàn)結(jié)果表明，犢牛斷奶前2 d 及斷奶后1、2 周血清中DAO 含量有增加趨勢(shì)，并在斷奶3 周后顯著增加，這也印證了斷奶應(yīng)激會(huì)引發(fā)腸道黏膜受損，改變腸道通透性。斷奶應(yīng)激引起的犢牛腸道黏膜損傷可能會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)存在，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，犢牛斷奶后1、2、3 周血液中GLU、TC、TC 的濃度低于斷奶前2 d，BUN 含量升高，這表明斷奶應(yīng)激使得犢牛營(yíng)養(yǎng)和能量攝入不足，增加自身脂肪動(dòng)員和體蛋白分解，從而影響其自身對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝；斷奶后1 周血液中ALP 濃度顯著低于斷奶前2 d，斷奶后TRL、IL-1B 和HP 濃度均顯著高于斷奶前2 d，表明犢牛會(huì)因斷奶應(yīng)激而引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，影響犢牛內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)；斷奶應(yīng)激也會(huì)造成D-LA、DAO 水平上升，表明犢牛斷奶應(yīng)激會(huì)造成腸道屏障受損，進(jìn)而對(duì)其腸道通透性產(chǎn)生影響。