王紅梅，楊劉玥玲，吳逸韜，楊獻康，鄭旭昕，趙旺生（西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010）

二肽基肽酶-4（Dipeptidyl Peptidase-4，DPP4）又稱腺苷脫氨酶復合蛋白26，是一種細胞表面蛋白酶，屬于脯氨酰寡肽酶家族，DPP4 蛋白可選擇性切割脯氨酸位于倒數(shù)第二位的肽中的氮末端二肽從而降解信號肽，發(fā)揮自身生物活性。同時，DPP4 與腺苷脫氨酶ADA 相互作用作為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控因子從而控制細胞遷移和增殖。在體內(nèi)主要在組織內(nèi)皮細胞和上皮細胞中表達。隨著年齡的增長，男性生殖功能出現(xiàn)總體下降，主要表現(xiàn)為精子數(shù)量的減少和體內(nèi)雄激素的降低,作為精子的轉(zhuǎn)運載體，睪丸管周細胞（HTPCS）在雄性生殖過程中發(fā)揮突出作用，在探究睪丸功能衰退的過程中發(fā)現(xiàn)睪丸管周細胞發(fā)生特異性改變，在出現(xiàn)線粒體網(wǎng)絡減少、溶酶體數(shù)量增加等蛋白質(zhì)紊亂現(xiàn)象的同時出現(xiàn)巨噬細胞遷移抑制因子（）和水平升高。因此推測可能在雄性生殖過程中發(fā)揮作用。

三維結(jié)構(gòu)顯示，DPP4 是二聚體蛋白，每個單體的亞基由一個/水解酶結(jié)構(gòu)域和八葉螺旋槳結(jié)構(gòu)域組成，在自然條件下，-螺旋槳結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域共同參與DPP4 單體締合過程形成同型二聚體，絲氨酸、天冬氨酸、組氨酸形成催化三聯(lián)體的殘基，而水解酶結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸對催化活性至關(guān)重要。DPP4 獨特的螺旋結(jié)構(gòu)可作為蛋白質(zhì)互相作用的支架，-螺旋槳有4～8 個葉片，每個葉片由包含30～50 個氨基酸的重復亞基組成，相鄰的螺旋槳葉片環(huán)可形成配體與抗體的接觸位點。DPP4 作為廣泛表達的酶，通過錨定的跨膜分子和可溶性循環(huán)蛋白轉(zhuǎn)導作用，膜相關(guān)和可溶性DPP4（sDPP4）都具有催化活性，精液和腎臟是可溶性DPP4（sDPP4）的天然來源。目前，有關(guān)基因在牦牛附睪組織中的表達未見詳細研究，本實驗通過克隆獲得牦?；虻腃DS 區(qū)，利用熒光定量檢測其在牦牛附睪組織不同部位的表達并對其蛋白進行生物信息學分析，旨在為研究DPP4 在牦牛附睪上皮細胞中的功能提供基本數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 睪丸分離 實驗所用睪丸來源于四川阿壩紅原，所用睪丸經(jīng)過Hanks 溶液漂洗3 次后分離附睪和睪丸，附睪組織分為附睪頭、附睪體、附睪尾3 部分，分離后立即放置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及器材 TRIzolplus總RNA 提取試劑由Gen enode 提供；Moloney Murine Leukemia Virus 逆轉(zhuǎn)錄酶及2X SG Fast qPCR Master Mix 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。QUAWELL 超微量紫外分光光度計（UV-5500PC）購自艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司，熒光定量PCR 儀（T100 Thermal Cycler）購自美國伯樂公司。

1.3 牦牛附睪總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 Trizol 試劑提取附睪頭、附睪體、附睪尾總RNA，QUAWELL 超微量紫外分光光度計檢測其濃度。RNA 反轉(zhuǎn)錄，步驟一：基因組DNA 去除，反應體系（10 μL）：5×gDNA Buffer 2.0 μL，總RNA 2.0 μL，RNase-Free ddHO 6.0 μL。反應過程42℃，3 min。步驟二：反轉(zhuǎn)錄反應，反應體系（10 μL）：10 × King RT Buffer 2.0 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1.0 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2.0 μL，RNase-Free ddHO 5.0 μL。將混合液加入到步驟一的反應液中，混勻后，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，產(chǎn)物于-20℃冰箱保存。

1.4 目的基因克隆 以牦牛附睪組織反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板進行PCR 擴增，擴增體系（20.0 μL）：DNA 聚合酶10.0 μL，雙蒸水7.0 μL，上下游特異性引物各1.0 μL（10 μmol/L）混勻，附睪頭、體、尾的cDNA 各添加1.0 μL。反應過程：預變性94℃4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s；以上過程循環(huán)40 次，后經(jīng)72℃2 min 的延伸。將產(chǎn)物電泳檢測后進行DNA純化并將目的片段和載體連接、進行轉(zhuǎn)化及鑒定后，經(jīng)成都擎科梓熙生物公司測序。

1.5 熒光定量PCR 反應體系（10.0 μL）：2x SG Fast qPCR Master Mix 5.0 μL，取上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL 混勻，PCR-grade water 3.7 μL，模板DNA 0.5 μL，以每樣3 個重復為對照，反應條件：預變性95℃3 min，95℃2 s，60℃25 s；以上過程循環(huán)40 次。定量結(jié)果利用SPSS19.0 軟件分析。

1.6 DPP4 蛋白質(zhì)生物信息學分析 BioXM 2.6 軟件分析牦牛的核苷酸和氨基酸序列；在線軟件EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）對DPP4進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，NCBI 的BLAST 比對其氨基酸同源性，并使用MEGA6.0 軟件對其系統(tǒng)進化樹進行構(gòu)建，NeTPhos3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/ser vices/NetPhos/）預測牦牛DPP4 蛋白磷酸化位點，TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測DPP4 蛋白跨膜區(qū)，其他相關(guān)生物學預測方法同之前的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因和內(nèi)參基因的引物 參考NCBI 中公布的牦?；騧RNA 序列（登錄號：XM_005897282.2）以及內(nèi)參基因（登錄號：NM_001037471.2），利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，具體信息見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因的引物

2.2 牦牛基因克隆產(chǎn)物 克隆結(jié)果顯示，獲得牦牛附睪序列2 519 bp。CDS 區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，基因CDS 長度為2 298 bp，共編碼765 個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG（圖1）。

圖1 牦牛DPP4 基因的堿基和氨基酸序列

2.3 牦牛DPP4 蛋白質(zhì)的理化信息 DPP4 氨基酸分子式為CHNOS，分子量為88.37 ku，包含765 個氨基酸，其中含量最高是絲氨酸，占總氨基酸數(shù)的8.8%；其次是亮氨酸，占總氨基酸數(shù)的7.7%；酪氨酸，占氨基酸總數(shù)的7.1%；半胱氨酸含量最低，占氨基酸總數(shù)的1.4%。負電荷殘基（Asp+glu）和正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)分別為84 和71；等電點5.92，總親水系數(shù)-0.39，脂肪系數(shù)為78.99，不穩(wěn)定系數(shù)為45.38，由此可將DPP4 蛋白歸為帶負電的不穩(wěn)定蛋白。

2.4 牦?；虻奈锓N同源性分析 通過BLAST對基因同其他物種進行對比，發(fā)現(xiàn)牦牛基因核苷酸序列與綿羊（登錄號：XM_004004660.5）、山羊（登錄號：XM_005676046.3）、野豬（登錄號：NM_214257.1）、獼猴（登錄號：XM_011744180.2）、黑猩猩（登錄號：XM_009443585.3）的同源性分別是98.78%、98.61%、92.12%、90.17%、90.13%。MEGA 11.0 構(gòu)建以上物種的核苷酸序列系統(tǒng)進化樹，可看出牦牛與綿羊、山羊親緣關(guān)系較近（圖2），符合物種進化規(guī)律。

圖2 DPP4 的進化樹

2.5 牦牛DPP4 蛋白結(jié)構(gòu) 牦牛DPP4 蛋白存在102 個磷酸化位點，其中包括50 個絲氨酸位點，27 個蘇氨酸位點，25 個酪氨酸位點。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測顯示，共765 個氨基酸組成DPP4 蛋白，其中18.17%（139 個）處于-螺旋區(qū)；6.14%（47 個）處于-轉(zhuǎn)角；30.46%（233個）位于延伸鏈；45.23%（346 個）氨基酸處于無規(guī)則狀態(tài)。親疏水性分析顯示（圖3），DPP4 蛋白在第24個氨基酸位點存在最大值2.956，此位點疏水性最強；第179 個氨基酸位點上存在最小值-2.589，此位點氨基酸親水性最強。從蛋白整體結(jié)構(gòu)看，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中未見明顯疏水區(qū)，可將DPP4 整體視為親水性蛋白，這與其理化性質(zhì)預測相符。在線網(wǎng)站TMHMM 2.0 分析DPP4 蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果顯示牦牛DPP4 蛋白的1～6 位氨基酸位于細胞膜內(nèi)，在7～29 位氨基酸之間形成跨膜螺旋區(qū)（圖4）；信號肽預測結(jié)果顯示DPP4 蛋白不存在信號肽（圖5），SoftBerry 預測牦牛DPP4 蛋白亞細胞定位于細胞膜上。

圖3 牦牛DPP4 蛋白親疏水性預測圖

圖4 牦牛DPP4 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預測圖

圖5 牦牛DPP4 蛋白的信號肽預測圖

2.6 牦牛基因在附睪不同區(qū)域的表達 對牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾的cDNA 進行qPCR 擴增并進行實時熒光定量檢測，基因在附睪頭部表達量低于其在附睪體部和附睪尾部的表達（＜0.01）（圖6）。

圖6 DPP4 基因在牦牛附睪不同部位的相對表達情況

3 討 論

DPP4 蛋白是一種多功能II 型細胞表面糖蛋白，其功能可以根據(jù)它們的細胞內(nèi)或細胞外定位、細胞類型、寡聚或聚合狀態(tài)以及配體、輔因子或產(chǎn)物的濃度發(fā)生變化。抑制劑通過降低內(nèi)源性腸促胰島素失活，進而刺激胰島素的釋放，調(diào)節(jié)空腹血糖、餐后血糖和糖化血紅蛋白HbA1c 水平，被廣泛用于治療糖尿病。然而，在糖尿病男性病例研究中發(fā)現(xiàn)西格列汀對精子參數(shù)和睪酮水平存在不良影響?；颊呤褂梦鞲窳型『螅谟行Э刂蒲堑耐瑫r出現(xiàn)精子質(zhì)量和精子數(shù)量明顯下降，甚至出現(xiàn)無精子狀況，而停用西格列汀三個月后后精子質(zhì)量恢復至可受孕狀態(tài)。此外，二甲雙胍聯(lián)合抑制劑治療二型糖尿病時發(fā)現(xiàn)，與單一二甲雙胍治療相比，抑制劑協(xié)同治療時，患者MDA、LHP水平顯著降低，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平顯著升高，證實抑制劑可以明顯改善患者氧化應激情況。GSH-Px 作為機體抗氧化應激的重要指標，可保護精子在附睪運輸和尾腔儲存過程中免受過氧化物的不利影響，研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過氧化物酶家族成員在牦牛附睪不同部位表達以附睪頭表達量顯著高于附睪體和附睪尾，與本實驗結(jié)果相反，推測可能與一同參與精子氧化應激過程。本實驗通過克隆獲得牦牛系列長2 519 bp，其中CDS區(qū)長2 298 bp，編碼765 個氨基酸。DPP4 蛋白是不穩(wěn)定帶負電的親水蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，其蛋白磷酸化位點有102 個，蛋白結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和-螺旋為主，在此基礎上延伸。熒光定量結(jié)果顯示，在附睪頭中低表達，在附睪體和附睪尾高表達，與雄牛生殖組織的研究相符。目前有關(guān)對精子發(fā)生過程中發(fā)揮何種作用仍待深入研究，根據(jù)現(xiàn)有研究，使用抑制劑后對雄性精子帶來的不利影響得到驗證，可推測在精子發(fā)生過程中發(fā)揮一定作用，可為后續(xù)研究提供一定思路。

4 結(jié) 論

本實驗成功克隆牦牛基因，基因在附睪頭部的表達顯著高于其在附睪體和附睪尾的表達。對牦牛DPP4 蛋白進行了生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，DPP4 蛋白為不穩(wěn)定的帶負電的親水蛋白，在牦牛生殖過程中具體發(fā)揮何種作用有待進一步研究，本研究可為進一步研究基因在牦牛附睪上皮細胞中的功能提供一定基礎資料。