馬彥茹 ,于永生，肖 成，曹 陽，秦立紅，趙玉民,3,4,5，吳 健,3,4*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林公主嶺 136100；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉牛遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林公主嶺 136100；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北種牛性能測(cè)定中心，吉林公主嶺 136100；5.吉林省肉牛繁育及養(yǎng)殖技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林公主嶺 136100）

中國草原紅牛是采用英國短角牛（Shorthorn）與蒙古牛雜交培育出的具有耐粗飼、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特性的肉乳兼用型品種。丙酮酸脫氫酶激酶4（Pyruvate Dehydrogenase Kinase 4，）是丙酮酸脫氫酶激酶的重要亞型之一，位于4 號(hào)染色體上，全長13 474 nt，具有11 個(gè)外顯子，是一種線粒體酶。通過抑制丙酮酸脫氫酶活性來抑制丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic Acid Cycle，TCA cycle），研究表明其在葡萄糖的消耗和脂肪酸的代謝轉(zhuǎn)換中起重要作用。目前，基因在牛的脂肪代謝方面研究較少。趙偉明等研究發(fā)現(xiàn)基因在2 種牛背膘脂肪中的表達(dá)量不同，表明基因可能與脂肪沉積相關(guān)。潘鵬丞等發(fā)現(xiàn)基因在陸川豬各組織中均有表達(dá)，其中皮下脂肪中的表達(dá)量最高。張亞楠研究發(fā)現(xiàn)山羊基因在肺臟與臂三頭肌2 種組織中表達(dá)最高，并且極顯著高于其他組織。近年，雖然有一些對(duì)?；虻难芯?，但未見在中國草原紅牛方面的報(bào)道。因此，本研究通過克隆草原紅?；蛲暾腃DS 序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，明確該基因在草原紅牛不同組織間及成脂分化過程中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步開展基因功能及其在草原紅牛上的作用機(jī)制研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原紅牛育種實(shí)驗(yàn)場(chǎng)選取6 頭健康的24 月齡中國草原紅牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，屠宰后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、十二指腸、背最長肌和脂肪等組織樣品，樣品采集后迅速放入液氮灌中保存。

1.1.2 主要試劑、儀器 膠回收純化試劑盒（Omega）、pMD18-T 載體和5×PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa）、LB 液體及固體培養(yǎng)基（北京金橋科技有限公司）、Trizol試劑（Invitrogen）、質(zhì)粒小量提取試劑盒（Axygeno）、2×ES Taq Master Mix（CWBIO）、LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaste（Roche 中 國）；uawell-Q5000超微量分光光度計(jì)（北京鼎盛生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中公布的牛mRNA（登錄號(hào)：NM_001101883.1）序列利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，再進(jìn)行RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物擴(kuò)增，其中-基因作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的內(nèi)參基因使用。引物詳情見表1。所有引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 提取RNA 及制備cDNA 將采集到的草原紅牛心、脾、胃、背最長肌等9 種組織利用Trizol 法提取總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系為500 ng的RNA，1 μL 的5×PrimeScript RT Master Mix，然后將RNase-Free HO 補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)程序：37℃15 min；85℃5 s。cDNA 于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 以1.2.2 提取的cDNA 為模板，通過特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL，其中2×Taq MasterMix 10 μL，上下游引物（1 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddHO 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃30 s、60℃30 s、72℃49 s，34 個(gè)循環(huán)；最后72℃8 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后利用膠回收試劑盒回收目的條帶。

1.2.4 載體的構(gòu)建與克隆測(cè)序 利用pMD18-T 載體與膠回收產(chǎn)物連接，連接體系10 μL：膠回收產(chǎn)物4 μL、pMD18-T 載體1 μL、solution I 5 μL，混勻4℃過夜。次日在大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化體系共55 μL，其中連接產(chǎn)物5 μL、DH5感受態(tài)細(xì)胞50 μL。輕彈混勻后冰浴30 min，42℃水浴90 s，再冰浴2～3 min；在800 μL 的無抗生素LB 培養(yǎng)液中加入連接產(chǎn)物，置于搖床室溫活化45 min，將活化好的菌液取200 μL 涂布于含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基中，倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中12～16 h。在含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中加入從菌板上挑取的單菌落，37℃搖床過夜。利用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒后進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，將陽性菌液送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.5基因序列分析 利用DNAMAN 軟件將測(cè)序拼接出的草原紅牛基因的CDS 區(qū)與NCBI 中?；蛐蛄羞M(jìn)行比對(duì)，并利用EditSeq 將測(cè)序序列翻譯為氨基酸序列。利用NCBI-BLAST 分析序列同源性，將獲得的不同物種序列利用Mega 6.0 構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用ProtParam 軟件分析基因蛋白的理化性質(zhì)，Protean 和SWISS-MODEL 軟件預(yù)測(cè)PDK4 蛋白的二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用TargetP 與PSORT II、ProtScale、NetPhos3.1、NetNGlyc、TMPred、Signal IP 軟件分別預(yù)測(cè)PDK4 蛋白的亞細(xì)胞定位、親疏水性、潛在磷酸化位點(diǎn)、蛋白糖基化位點(diǎn)、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽。通過String 軟件分析PDK4 蛋白分子與其他分子的互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以1.2.2 中的方法制備的各組織cDNA 為模板，-actin（上下游均1 μmol/L）為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，其 中LightCycler 480 SYBR Green I Maste 10 μL，上、下游引物（1 μmol/L）各0.5 μL，模板1 μL，ddHO 8 μL。反應(yīng)程序：95℃5 min，95℃10 s，58℃15 s，72℃20 s，共43 個(gè)循環(huán)。

1.2.7基因在成脂分化過程中的mRNA 表達(dá) 復(fù)蘇第三代的草原紅牛前體脂肪細(xì)胞，待匯合度達(dá)70%～80% 進(jìn)行誘導(dǎo)分化；再利用Trizol 法提取分化過程中的0、2、4、6 d 的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)基因在成脂分化過程中的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果采用2方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性分析利用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，＜0.05 判定為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 草原紅?；騊CR 擴(kuò)增及克隆 如圖1 所示，草原紅?；虻腜CR 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶明亮清晰，條帶大小約為1 605 bp，與預(yù)期目的條帶大小一致。然后利用TA 克隆的方法，成功獲得基因的陽性重組菌落，測(cè)序檢驗(yàn)后，證明成功克隆出草原紅?；虻腃DS 區(qū)。

圖1 中國草原紅牛PDK4 基因編碼區(qū)PCR 擴(kuò)增電泳圖

2.2基因同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，草原紅牛與其他11 種動(dòng)物同源性關(guān)系如圖2、3 所示。由圖2 可知，野牦牛的同源性與草原紅牛的同源性最高，達(dá)99.8%，而與埃及果蝠的同源性最低（89.7%），與水牛（XM_006065918.2）、山羊（XM_005678949.3）、羚羊（XM_040260478.1）、綿羊（XM_004007738.4）、瘤牛（XM_019959714.1）、虎鯨（XM_004265573.2）、寬吻海豚（XM_00432293 2.3）、野豬（NM_001159306.1）和狐蝠（XM_03987804 7.1）的同源性分別為98.6%、97.6%、97.5%、97.5%、96.7%、94.6%、94.3%、93.5%、90.4%。由圖3 可知，草原紅牛和野牦牛進(jìn)化關(guān)系密切，屬于一個(gè)分支，與埃及果蝠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 不同物種間PDK4 基因核苷酸序列同源性對(duì)比

圖3 不同物種間PDK4 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 PDK4 蛋白理化性質(zhì)分析 利用ExPASy 在線軟件分析PDK4 蛋白理化特性，如表2 所示，草原紅?；蚓幋a407 個(gè)氨基酸，其中帶負(fù)電荷和正電荷的氨基酸殘基總數(shù)分別為42 和41。PDK4 蛋白分子式為CHNOS，分子質(zhì)量為46.158 ku，理論等電點(diǎn)為6.83，屬于酸性氨基酸。脂肪系數(shù)為91.25，總平均親水性為-0.169，屬于可溶性蛋白。消光系數(shù)為43 695，不穩(wěn)定指數(shù)為45.91，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

表2 草原紅牛PDK4 蛋白的氨基酸組成

2.4 PDK4 蛋白亞細(xì)胞定位及蛋白的二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 通過TargetP 在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果如表3 所示，PDK4 蛋白屬于線粒體靶向肽；同時(shí)，PSORT II 在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示PDK4 蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)（30.4%）、細(xì)胞核（21.7%）、線粒體（39.1%）、質(zhì)膜（4.3%）、液泡（4.3%）中，證明PDK4 蛋白主要在線粒體中存在；PDK4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4 所示，可見-折疊占比最大（32.9%），其次是-轉(zhuǎn)角（26%）、無規(guī)則卷曲（23.2%），-螺旋占比最少（17.8%）。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5 所示，可見蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要通過-折疊和-轉(zhuǎn)角構(gòu)成，再經(jīng)由無規(guī)則卷曲連接。

圖4 中國草原紅牛PDK4 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 中國草原紅牛PDK4 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表3 TargetP 分析結(jié)果

2.5 PDK4 蛋白親水性、疏水性和潛在的磷酸化位點(diǎn)分析 ProtScale 在線分析結(jié)果如圖6 所示，PDK4 蛋白氨基酸殘基大多集中于親水性區(qū)，且親水性最大值為-3.044，疏水性最大值為2.211，屬于親水性蛋白。在線NetPhos3.1 分析結(jié)果如圖7 所示，可見PDK4 氨基酸序列存在33 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸21處、蘇氨酸9 處、酪氨酸3 處。

圖6 中國草原紅牛PDK4 蛋白親疏水性分析

圖7 中國草原紅牛PDK4 蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.6跨膜區(qū)、蛋白糖基化位點(diǎn)及信號(hào)肽預(yù)測(cè) 利用TMPred 在線分析發(fā)現(xiàn)PDK4 氨基酸序列在（168,187）位氨基酸處有跨膜區(qū)。NetNGlyc1.0 分析表明，PDK4蛋白在76、182、221 位氨基酸處存在3 個(gè)N-糖基化潛在位點(diǎn)（圖8）。在線NetNGlyc4.0 分析表明，位于第10、23、303、305、307、308、317、376、383、384、385、394 位氨基酸處存在12 個(gè)O-糖基化潛在位點(diǎn)。Signal IP 在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PDK4 蛋白不存在信號(hào)肽。

圖8 中國草原紅牛PDK4 蛋白的N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.7 PDK4 蛋白分子互作網(wǎng)絡(luò)分析 利用String 在線軟件分析PDK4 蛋白分子與其他分子的互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，PDK4 蛋白可以與肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I（CPT1）的亞型（CPT1A）、核糖體蛋白S6 激酶beta-1（RPS6KB1）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARA）、丙酮酸脫氫酶（PDH）復(fù)合物的亞基（PDHA1）、CPT1 的亞型CPT1B、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶密切相關(guān)激酶1（AKT1）、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（UCP3）、過氧化物酶體增殖物激活受體共激活物1-（PPARGC1A）、血管生成素相關(guān)蛋白4（ANGPTL4）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（PCK1）等分子形成互作網(wǎng)絡(luò)，在體內(nèi)發(fā)揮作用（圖9）。如在MDA-MB-231 細(xì)胞中，脂肪酸氧化在PPARA 過表達(dá)時(shí)增加了近3 倍，在TTA 處理時(shí)增加了4 倍，在這些條件下，表達(dá)高度增加；在各種營養(yǎng)條件下，通過PDHA1 的磷酸化來調(diào)節(jié)多種組織和細(xì)胞類型的能量穩(wěn)態(tài)；UCP3 和共同參與胰島素抵抗的葡萄糖和脂質(zhì)代謝過程。

圖9 中國草原紅牛PDK4 蛋白分子互作網(wǎng)絡(luò)

2.8基因在不同組織中的表達(dá)差異分析 如圖10所示，在中國草原紅牛的心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、背最長肌和脂肪組織中，基因在各組織中均顯著表達(dá)，表達(dá)量最高為背最長?。ǎ?.05），在肺、腎、腸、脂肪中表達(dá)量較低。

圖10 PDK4 在中國草原紅牛各組織間的表達(dá)差異

2.9基因在成脂分化過程中的表達(dá)分析 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)基因在草原紅牛前體脂肪細(xì)胞分化的第0、2、4、6 天的mRNA 表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，如圖11 所示，前體脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中，在第0 天表達(dá)量最低，與第0 天相比第2 天表達(dá)量顯著增高，且第4 天表達(dá)量顯著高于第2 天，第4 天與第6 天之間無顯著差異。

圖11 PDK4 在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)

3 討 論

目前，對(duì)基因的研究主要集中在癌癥、糖尿病及代謝綜合征等疾病上，Guda 等研究表明基因在乳腺癌中相對(duì)高表達(dá)，其表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)。Pin 等研究發(fā)現(xiàn)癌癥惡病質(zhì)患者PDK4 蛋白表達(dá)升高與代謝異常和肌肉萎縮之間存在關(guān)聯(lián)。Park 等研究發(fā)現(xiàn)肝的上調(diào)促進(jìn)了胰高血糖素介導(dǎo)的糖異生基因的表達(dá)，而肝的敲除或抑制對(duì)糖異生基因的表達(dá)產(chǎn)生相反的影響并降低肝葡萄糖的產(chǎn)生。Pettersen 等通過TTA 治療的大鼠與經(jīng)PPARA 過表達(dá)MDA-MB-231 細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)表達(dá)高度增加，表明mRNA 表達(dá)上調(diào)與代謝適應(yīng)細(xì)胞和大鼠組織中線粒體脂肪酸氧化活性的增加密切相關(guān)。

基因目前在畜禽動(dòng)物中研究相對(duì)較多。通常在具有高能量需求的組織中高度表達(dá)，包括心臟、骨骼肌、肝臟、腎臟、胰島和哺乳期乳腺。Cadoudal 等研究表明的抑制或敲低減弱了噻唑烷二酮（TZDs）對(duì)甘油生成的影響，從而證明了這種酶在脂肪酸循環(huán)中的重要作用。楊洋等發(fā)現(xiàn)，基因在從江香豬和大白豬不同組織中表達(dá)量不同，從江香豬在腎臟中表達(dá)量最高，大白豬中脂肪表達(dá)量最高，表明基因在不同物種間存在差異性。奚子英等研究發(fā)現(xiàn)，基因在生長速度差異大的杏花雞與隱性白洛克雞的組織表達(dá)顯著不同，表明基因?qū)仪萆L有一定的調(diào)控作用。張榕婧等研究發(fā)現(xiàn)基因在肌肉組織（包括腿肌、胸肌、心臟）表達(dá)最高，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，基因在草原紅牛背最長肌中表達(dá)量最高。

本研究成功獲得草原紅牛基因編碼區(qū)，全長1 223 bp，預(yù)測(cè)其編碼407 個(gè)氨基酸，蛋白分子式為CHNOS，分子質(zhì)量為46.158 ku，總平均親水性為-0.169，蛋白為親水性蛋白，草原紅牛基因測(cè)序結(jié)果與Zimin 等對(duì)家牛的基因組使用分層和全基因組鳥槍法混合測(cè)序法的結(jié)果一致。草原紅?？寺⌒蛄信c野牦牛和水牛的同源性較高（99.8%和98.6%），說明該基因保守性較強(qiáng)；PDK4 作為一種重要的線粒體蛋白，其亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示其主要存在于線粒體中；預(yù)測(cè)基因存在3 個(gè)N-糖基化潛在位點(diǎn)和12 個(gè)O-糖基化潛在位點(diǎn)，33 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，蛋白糖基化與磷酸化對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞功能具有重要作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果表明，基因在草原紅牛不同組織間均顯著表達(dá)，在背最長肌中表達(dá)最高，其次是肝臟，在脾、心臟、胃中中度表達(dá)；此外基因在草原紅牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)差異顯著。本研究進(jìn)一步介紹了基因的功能，為今后研究基因?qū)Σ菰t牛脂代謝的影響提供資料。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆出中國草原紅?；蚓幋a區(qū)，全長1 223 bp，共編碼407 個(gè)氨基酸，PDK4 蛋白為親水性蛋白，其與多種蛋白形成互作網(wǎng)絡(luò)，共同進(jìn)行調(diào)控作用；基因在中國草原紅牛各組織間表達(dá)差異顯著，其中背最長肌表達(dá)最高，十二指腸和脂肪表達(dá)最低。草原紅牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中，基因mRNA 表達(dá)量在0～4 d 呈上升趨勢(shì)，4～6 d 之間無顯著差異。