常振華，王世康，亐開興，夏小婷，黃永震，雷初朝*

（1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西渭南 714026；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.楚雄師范學(xué)院，云南楚雄 675000）

郟縣紅牛是我國(guó)優(yōu)良地方黃牛品種，主要分布于河南省平頂山市郟縣、寶豐縣和魯山縣，分布區(qū)域位于東經(jīng)112°14'～113°45'、北緯33°08'～34°20'，屬于暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候。郟縣紅牛具有體格大、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)紅潤(rùn)細(xì)嫩等特點(diǎn)。但目前郟縣紅牛育種工作中仍存在諸多問(wèn)題，如良種的保護(hù)與開發(fā)不足所導(dǎo)致種群數(shù)量逐年減少、品種生產(chǎn)水平較低等，需要通過(guò)現(xiàn)代育種原理與方法進(jìn)一步選育提高與開發(fā)利用。

動(dòng)物Y 染色體常被作為研究動(dòng)物父系遺傳進(jìn)化和親緣關(guān)系的重要工具。種公牛對(duì)牛品種選育具有重要作用，因此需要分析其Y 染色體基因組遺傳變異（主要是Y 染色體單拷貝區(qū)SNP）來(lái)研究家牛的起源。家牛Y染色體包括擬常染色體區(qū)（Pseudoautosomal Region，PAR）和雄性特異區(qū)（Male-Specific Region，MSY）。家牛MSY 區(qū)在減數(shù)分裂期間不與X 染色體重組。家牛MSY 區(qū)包含X-退化區(qū)、X-轉(zhuǎn)移區(qū)和擴(kuò)增區(qū)。其中X-退化區(qū)位于MSY 區(qū)的兩端，包含2 段單拷貝區(qū)域。經(jīng)過(guò)注釋，共有12 個(gè)單拷貝基因位于X-退化區(qū)，分別為。Chen 等對(duì)世界家牛的Y 染色體雄性特異區(qū)SNP 進(jìn)行掃描，將家牛父系起源更細(xì)致地劃分為：Y1、Y2a、Y2b、Y3a 和Y3b。然而，關(guān)于郟縣紅牛品種父系起源的研究，目前只采用Y 染色體雄性特異基因SNP 與微衛(wèi)星標(biāo)記方法進(jìn)行過(guò)研究，尚未對(duì)郟縣紅牛進(jìn)行Y 染色體基因組水平的系統(tǒng)研究。因此，本研究使用郟縣紅牛MSY 區(qū)中X-退化區(qū)單拷貝基因進(jìn)行全基因組掃描，以分析郟縣紅牛的父系遺傳多樣性與起源。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 本研究使用的16 頭郟縣紅牛Y 染色體基因組數(shù)據(jù)來(lái)源于本團(tuán)隊(duì)發(fā)表的黃牛全基因組文獻(xiàn)，但Xia 等發(fā)表的論文并未分析郟縣紅牛Y 染色體基因組的多樣性。本研究選取Chen 等研究中使用的5 個(gè)Y 染色體基因組單倍型：Y1（SRR1365144，安格斯牛）、Y2a（SRR5507257，哈薩克牛）、Y2b（SRR934415，韓牛）、Y3a（SRR5507285，廣豐牛）和Y3b（SRR2016752，吉爾牛）作為對(duì)照，對(duì)照個(gè)體數(shù)據(jù)從NCBI 下載。

1.2 Y 染色體基因組遺傳多樣性與父系起源分析 使用GATK3.8 軟件的GenotypeGVCFs 模塊對(duì)16 頭郟縣紅牛和5 頭對(duì)照組牛Y 染色體基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因分型。使用VCFtools-0.1.16 軟件提取集合中牛Y 染色體X-退化區(qū)單拷貝基因SNP 做后續(xù)分析。用SnpEFF 軟件對(duì)Y 染色體X-退化區(qū)SNP 進(jìn)行注釋，DnaSP v5 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，計(jì)算單倍型多樣度Hd 和核苷酸多樣度Pi。隨后，使用RAxML-master v8.2.12 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。參數(shù)設(shè)置為：-f a -x 123 -p 23 -# 100 -m GTRGAMMA，結(jié)果文件通過(guò)FigTree v1.4.3 實(shí)現(xiàn)可視化。最后使用Network 10.2.0.0 軟件構(gòu)建Y-SNP 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 郟縣紅牛Y 染色體SNP 多態(tài)性 對(duì)16 頭郟縣紅牛和5 頭對(duì)照組牛Y 染色體X-退化區(qū)單拷貝基因位點(diǎn)進(jìn)行提取，共篩選到1 346 個(gè)位點(diǎn)，去掉存在缺失的位點(diǎn)后剩余827 個(gè)位點(diǎn)，其中有210 個(gè)位點(diǎn)存在多態(tài)性，在郟縣紅牛群體中有178 個(gè)Y-SNP 多態(tài)位點(diǎn)。轉(zhuǎn)換和顛換比值（Ts/Tv）為1.69，表明轉(zhuǎn)換比例大于顛換比例，符合堿基替換的特征。使用snpEFF 注釋這些位點(diǎn)，共包含7 個(gè)基因，分別是。郟縣紅牛的平均變異數(shù)（K）為51.14，單倍型多樣度（Hd±SD）為0.717±0.095，核苷酸多樣度（Pi±SD）為0.061 8±0.019 8。遺傳多態(tài)性分析結(jié)果表明郟縣紅牛Y 染色體序列遺傳多樣性豐富。

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析 以5 頭已知Y 染色體單倍型組的家牛個(gè)體作為對(duì)照組，對(duì)郟縣紅牛Y 染色體基因組的序列變異進(jìn)行分析，使用Fig Tree v1.4.3 軟件構(gòu)建郟縣紅牛的最大似然樹（圖1）。結(jié)果表明郟縣紅牛中共定義了5 種單倍型（JXR1～5），JXR4 屬于主要單倍型，占50%（8/16）；最大似然樹將郟縣紅牛Y 染色體基因組序列分為3 個(gè)單倍型組：Y1、Y2 和Y3。Y2 被細(xì)分為Y2a 和Y2b；Y3 又分為Y3a 和Y3b。郟縣紅牛中81.25%（13/16）屬于Y2 單倍型組，還有18.75%（3/16）的郟縣紅牛屬于Y3 單倍型組。參考個(gè)體均位于對(duì)應(yīng)支系中，說(shuō)明構(gòu)樹結(jié)果正確。

圖1 郟縣紅牛Y 染色體進(jìn)化樹

2.3 構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖 為進(jìn)一步分析單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究利用Network 5.0 軟件構(gòu)建郟縣紅牛的Network 網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。單倍型分析共鑒定10個(gè)單倍型，其中郟縣紅牛有5 個(gè)單倍型，各單倍型分布與構(gòu)建的最大似然樹相符，單倍型信息見表1。結(jié)果顯示，所研究的郟縣紅牛群體可分為普通牛（Y2a 和Y2b）單倍型組和瘤牛（Y3a）單倍型組。其中Y2b 為主要亞單倍型組，占75%（12/16），其次是Y3a，占18.75%（3/16），Y2a 最低，占6.25%（1/16），沒(méi)有Y1 和Y3b 單倍型組。

圖2 郟縣紅牛Y 染色體單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

表1 郟縣紅牛單倍型信息表

3 討 論

Y 染色體的MSY 區(qū)域已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性與父系起源的研究。從Y-SNPs到Y(jié)-STR再到二者的合用，對(duì)于MSY 區(qū)域的研究手段也層出不窮。先前的研究?jī)H將郟縣紅牛劃分為Y2 和Y3 2 個(gè)單倍型組。本研究利用全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)郟縣紅牛Y 染色體MSY 的X-退化區(qū)Y-SNPs 進(jìn)行掃描、聚類分析，結(jié)果顯示郟縣紅牛品種中Y2b 亞單倍型組占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與Chen 等的結(jié)論基本一致，但與之不同的是，Chen 等的研究結(jié)果中5 頭郟縣紅牛僅存在Y2b 和Y3a 亞單倍型組，而未在郟縣紅牛中檢測(cè)到Y(jié)2a 亞單倍型組，可能是其用到的樣本量太少所致。本研究首次在郟縣紅牛品種中發(fā)現(xiàn)Y2a 亞單倍型組，表明郟縣紅牛作為中國(guó)中原地區(qū)黃牛，同時(shí)受到北方普通牛和南方瘤牛的影響。該結(jié)論與之前有關(guān)郟縣紅牛Y 染色體形態(tài)與線粒體D-loop 區(qū)核苷酸變異的結(jié)果一致。

單倍型多樣性描述了從群體中隨機(jī)選取的兩條序列間存在核苷酸差異的概率，使用不同的標(biāo)記計(jì)算所得單倍型多樣度會(huì)有所不同。以郟縣紅牛為例，Li 等使用基因序列標(biāo)記位點(diǎn)計(jì)算所得單倍型多樣度明顯小于使用4 個(gè)Y-SNPs 和2 個(gè)Y-STRs 計(jì)算的單倍型多樣度。本研究中郟縣紅牛的Y 染色體單倍型多樣度（H±SD）為0.717±0.095，略高于Li 等所發(fā)現(xiàn)的郟縣紅牛Y 染色體單倍型多樣度（0.623±0.073），其原因是本研究所使用的Y-SNP 位點(diǎn)數(shù)增多從而提高了其單倍型多樣度。與此同時(shí)，該結(jié)果也大于中國(guó)地方黃牛的平均單倍型多樣度（0.607±0.016），說(shuō)明郟縣紅牛具有豐富的遺傳資源。

中國(guó)黃牛主要有Y2a、Y2b 和Y3a 3 個(gè)父系起源，少量的Y1 單倍型組可能是最近歐洲肉牛品種雜交的結(jié)果。在郟縣紅牛中未檢測(cè)到Y(jié)1 單倍型，說(shuō)明采集的樣本較純，未受到雜交影響。近年來(lái)，受到外來(lái)引入品種和存欄量下降的影響，許多地方品種到達(dá)瀕危的邊緣，郟縣紅牛也不例外。在引入外來(lái)品種的同時(shí)，需要采取措施保護(hù)郟縣紅牛等地方黃牛品種資源，避免造成種質(zhì)不純等問(wèn)題。

4 結(jié) 論

本研究以Y 染色體X-退化區(qū)單拷貝基因?yàn)槟繕?biāo)研究郟縣紅牛的父系遺傳背景，將郟縣紅牛的父系起源進(jìn)一步明確和細(xì)化。在郟縣紅牛品種中共檢測(cè)到Y(jié)2a、Y2b 和Y3a 3 種亞單倍型組，并以Y2b 亞單倍型組為主；16 個(gè)郟縣紅牛共分為5 個(gè)單倍型（JXR1-5），JXR1 屬于Y2a；JXR2、JXR3 和JXR4 均屬于Y2b；JXR5 屬于Y3a 亞單倍型組。郟縣紅牛為北方普通牛和南方瘤牛父系基因交流的產(chǎn)物，具有較為復(fù)雜的父系起源、較高的單倍型多樣性與核苷酸多樣性。