秦朋云，喬利英，劉建華，潘洋洋，侯文欣，車雨彤，趙 祥，劉文忠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

羊肉營養(yǎng)豐富，是高蛋白低固醇的肉類之一。中國傳統(tǒng)文化認(rèn)為羊肉具有一定食療藥補(bǔ)功效，因此其深受消費(fèi)者青睞。而脂肪堆積過多會降低綿羊胴體品質(zhì)和肉質(zhì)口感，影響肉用綿羊的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。脂肪組織作為動物體內(nèi)維持能量代謝平衡的主要器官，是動物體內(nèi)重要的儲能部位。脂肪的沉積不僅受到營養(yǎng)等環(huán)境因素影響，更受到諸多遺傳因素的調(diào)控。因此探究脂肪代謝相關(guān)的遺傳因素，對改善綿羊脂肪沉積方式具有重要作用。

脂肪儲存跨膜誘導(dǎo)蛋白（Fat Storage-Inducing Tra nsmembrane Protein，F(xiàn)IT/FITM）是一個(gè)獨(dú)特的蛋白質(zhì)家族，其家族包含2 個(gè)基因和，二者氨基酸序列相似性為50%，都定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。主要在骨骼肌和心臟中表達(dá)，而在全身各組織中普遍表達(dá)，尤其在白色和棕色脂肪組織中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，這2 種蛋白都有6 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N端和C 端均位于細(xì)胞質(zhì)。參與將甘油三酯打包成脂滴的過程，促進(jìn)脂滴在細(xì)胞中的積累，但不參與甘油三酯的合成。在肝臟中被鑒定為過氧化物酶體增殖物激活受體-（PPAR）激動劑誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物，后證明對脂滴的形成至關(guān)重要。的缺失導(dǎo)致細(xì)胞脂滴數(shù)量減少，過表達(dá)導(dǎo)致脂滴中脂質(zhì)儲存增加。研究表明小鼠脂肪組織中選擇性敲除會導(dǎo)致脂肪營養(yǎng)不良和代謝功能障礙。這些結(jié)果都表明FITM2 蛋白對動物脂肪沉積和生命維持具有關(guān)鍵作用。

前期對于的研究主要集中在人、小鼠和豬中，缺乏對該基因在反芻動物中的機(jī)制和功能的認(rèn)識，且關(guān)于的報(bào)道主要集中在生化作用，對于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面少見研究?；诒菊n題組前期對廣靈大尾羊和小尾寒羊脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，基因在不同品種綿羊的不同組織中差異表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過克隆廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)，分析序列特征及蛋白特性，并通過生物信息學(xué)軟件分析基因啟動子和可能與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，以及它們在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究廣靈大尾羊基因在脂肪沉積過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 本實(shí)驗(yàn)采集4 月齡廣靈大尾羊尾部脂肪組織，浸泡于含1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的無菌PBS 溶液中，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室用于分離前體脂肪細(xì)胞。隨機(jī)選取3 只8 月齡廣靈大尾羊安樂死后放血，采集尾部脂肪、皮下脂肪、腎周脂肪和背最長肌組織，用錫紙包裹置于液氮帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存，用于后續(xù)基因擴(kuò)增及組織表達(dá)分析。

1.2 主要試劑 Trizol 試劑、PrimeScriptRT reagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTARHS（Premix）高保真酶、TB Green Premix Ex TaqII qPCR 定量試劑盒、限制性內(nèi)切酶、基因組DNA 提取試劑均購自TaKaRa 公司；瓊脂糖、DH5感受態(tài)細(xì)胞、II 型膠原酶、LB 固體/液體培養(yǎng)基均購自索萊寶公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自O(shè)MEGA 公司；無縫克隆試劑盒購自諾唯贊公司；雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，Penicillin-Streptomycin Solution）、胎牛血清和高糖DMEM 培養(yǎng)液購自Biological Industries 公司；過表達(dá)載體pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-puro 購自漢恒生物科技（上海）有限公司。

1.3 總RNA 提取及cDNA 合成 采用Trizol 法提取4種組織的總RNA，用核酸蛋白測定儀（NanoDrop）檢測總RNA 濃度和純度（1.8＜A260/280＜2.0），保存于-80℃冰箱中備用。根據(jù)PrimeScriptRT reagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，保存于-20℃。

1.4 廣靈大尾羊基因的克隆 根據(jù)NCBI 中收錄的綿羊基因（XM_004014584.4）序列信息，利用Primer Primier 5.0 軟件設(shè)計(jì)基 因CDS 區(qū) 的特異性引物（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。以脂肪組織cDNA 為模板，通過PCR 擴(kuò)增出基因CDS 區(qū)全長，經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳后切割目的條帶，并純化回收。用I 和I 快切酶使載體線性化，按無縫克隆試劑盒說明書連接載體和目的片段。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂板后12 h 挑選單個(gè)陽性克隆菌落過夜搖菌，并將菌液送至北京六合華大基因有限公司進(jìn)行測序。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.5 廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)生物信息學(xué)分析 通過Jalview、MEGA X 軟件對廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)進(jìn)行氨基酸多序列比對和遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建；利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測基因編碼蛋白的特性（表2）。

1.6 廣靈大尾羊基因啟動子核心區(qū)、CpG 島及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析 從NCBI 中獲取綿羊基因（NC_040264.1）轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp 及下游100 bp 作為啟動子序列。利用BDGP 預(yù)測核心啟動子區(qū)；利用Methprimer 預(yù)測啟動子區(qū)CpG 島；利用JASPAR、Animal TFDB、ALGGEN 和ChEA3 軟件預(yù)測與基因啟動子潛在結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子（預(yù)測網(wǎng)站見表2）。

表2 生物信息學(xué)分析軟件

1.7 廣靈大尾羊前體脂肪細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 采集廣靈大尾羊尾部脂肪組織在75% 酒精中浸泡15 s，轉(zhuǎn)移到裝有PBS 緩沖液的培養(yǎng)皿中，用眼科鑷和眼科剪分離出肉眼可見的血管。將脂肪組織剪成小塊，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管，加入等體積2 mg/mL II 型膠原酶，37℃ 200 rpm條件下消化30 min，隨后加入等體積完全培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基中加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液）終止消化。室溫下1 000 rpm 離心10 min。挑去上層漂浮的脂肪，緩慢倒掉上清，盡可能吸干凈殘余液體，加入完全培養(yǎng)基重懸沉淀，用200 目和400 目細(xì)胞篩過濾重懸液，將細(xì)胞接種到10 cm 培養(yǎng)皿中，添加完全培養(yǎng)基至每皿10 mL。輕搖培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布有利于細(xì)胞貼壁，后置于37℃的5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h 后觀察細(xì)胞是否貼壁，如果貼壁則更換新的完全培養(yǎng)基，此后每2 d 更換一次培養(yǎng)基，每次換液前用PBS 洗滌，至細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%進(jìn)行傳代、凍存或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）

1.8.1 廣靈大尾羊基因在4 種不同組織中的表達(dá)利用NCBI 中Primer-BLAST 設(shè)計(jì)基因的特異性定量引物（表1），以-為對照，qPCR 檢測mRNA 在廣靈大尾羊尾脂、皮下脂肪、腎周脂肪和背最長肌組織中的表達(dá)量。反應(yīng)體系如下：cDNA（50 ng/μL）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，TB Green Premix Ex Taq II 5 μL，ddHO 補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min；95℃10 s，60℃15 s，72℃20 s，設(shè)置39 個(gè)循環(huán)；95℃5 s，65℃1 min，升溫速率5℃/s，從65℃遞增到97℃，反應(yīng)至40℃結(jié)束。

1.8.2 廣靈大尾羊基因和部分轉(zhuǎn)錄因子在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá) 待前體脂肪細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，更換分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并記做分化第0 d，此后每2 d 更換一次培養(yǎng)基，分化3～4 d 后顯微鏡觀察有可見脂滴生成。分別收集分化第0、2、4、6、8、10 天的細(xì)胞，提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Primer-BLAST 設(shè)計(jì)基因特異性定量引物（表1），以-作對照。以各時(shí)期的細(xì)胞cDNA 為模板進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系及程序同1.8.1。

1.9 數(shù)據(jù)處理及分析 qPCR 結(jié)果以-為內(nèi)參基因，用2來計(jì)算mRNA 相對表達(dá)量，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。＜0.05 表示差異顯著，＜0.01 表示差異極顯著。用GraphPad Prism 7.0 繪制柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)的克隆 成功克隆出廣靈大尾羊基因的CDS 區(qū)，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見圖1，可見一條約為900 bp的條帶（包含部分非編碼區(qū)），與理論擴(kuò)增目的條帶長度一致。

圖1 廣靈大尾羊FITM2 基因CDS 區(qū)擴(kuò)增

2.2 廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)生物信息學(xué)分析

2.2.1 廣靈大尾羊基因序列分析和蛋白理化性質(zhì)分析 利用NCBI 中的ORF Finder 對廣靈大尾羊基因的開放閱讀框進(jìn)行定位分析。結(jié)果顯示基因位于13 號染色體，包含一個(gè)長852 bp 的開放閱讀框。通過在線軟件Protparam 預(yù)測到廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)編碼蛋白質(zhì)有283 個(gè)氨基酸，分子式為CHNOS，相對分子質(zhì)量為32 162.64，理論等電點(diǎn)為9.59，該蛋白含有20 種氨基酸，含量最高的為亮氨酸（Leu），達(dá)到13.8%，含量最低的為天冬氨酸（Asp）僅為1.1%。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）：16，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）：31。預(yù)測到該蛋白的消光系數(shù)（Mcm，=280 nm）為78 880，不穩(wěn)定系數(shù)為49.51，說明這種蛋白不穩(wěn)定，容易降解或變性。脂溶指數(shù)為94.73，總平均親水性（GRAVY）為0.134，表明該蛋白為疏水性蛋白。該蛋白在哺乳動物生物體外的網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h。通過Protscale 對蛋白的疏水性進(jìn)行分析（圖2），其中正值表示疏水性，負(fù)值表示親水性，值越大則性能越強(qiáng)，而該圖中大部分位點(diǎn)所對應(yīng)的值都大于0，表明該蛋白為疏水性蛋白。

圖2 FITM2 蛋白疏水性分析

2.2.2 廣靈大尾羊FITM2 蛋白的亞細(xì)胞定位及跨膜結(jié)構(gòu)分析 通過PSORT II 軟件進(jìn)行FITM2 蛋白亞細(xì)胞定位分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該蛋白分別位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜、空泡、線粒體、高爾基體中，其比例分別為33.3%、33.3%、11.1%、11.1%、11.1%。通過在線軟件TMpred 預(yù)測FITM2 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)FITM2 編碼蛋白存在6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3）。

圖3 FITM2 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.2.3 廣靈大尾羊FITM2 蛋白的信號肽、磷酸化預(yù)測利用SignalP 5.0 在線軟件對廣靈大尾羊FITM2 蛋白序列進(jìn)行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白N 端不存在信號肽，是非分泌蛋白。磷酸化位點(diǎn)由NetPhos 2.0 在線軟件預(yù)測，對潛在磷酸化位點(diǎn)的3 種氨基酸即絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）進(jìn)行預(yù)測，若分值大于0.5，則被視為潛在位點(diǎn)。預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13 個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、10 個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)、3 個(gè)酪氨酸位點(diǎn)超過了閾值，表明這26 個(gè)位點(diǎn)可能成為蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)（圖4）。

圖4 FITM2 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

2.2.4 FITM2 蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過SOPMA 在線軟件分析預(yù)測，結(jié)果表明FITM2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和-轉(zhuǎn)角組成。其中-螺旋占55.48%，無規(guī)則卷曲占30.04%，延伸鏈占11.66%，-轉(zhuǎn)角占2.83%（圖5）。通過I-TASSER 在線軟件預(yù)測FITM2 蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖6。

圖5 FITM2 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖6 FITM2 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.5 廣靈大尾羊基因序列的多序列比對及遺傳進(jìn)化樹分析 利用Jalview、MEGA X 軟件對綿羊（XP_004014633.2）、山羊（XP_005688629.2）、人（NP_001073941.1）、小鼠（NP_775573.1）、大鼠（NP_001 101269.1）、豬（NP_001121932.1）、牛（NP_001096565.1）等7 個(gè)物種的基因序列進(jìn)行氨基酸多序列比對（圖7）和遺傳進(jìn)化樹分析（圖8）。從多序列比對看，很多氨基酸位點(diǎn)保守不變，說明基因編碼區(qū)在各物種中保守性較好。從遺傳進(jìn)化樹看，綿羊與山羊親緣關(guān)系最近，與牛、豬和人親緣關(guān)系次之，與小鼠和大鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖7 氨基酸多序列比對結(jié)果

圖8 不同物種FITM2 蛋白序列進(jìn)化樹分析

2.3 廣靈大尾羊基因啟動子生物信息學(xué)分析 選取基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG 上游2 000 bp 及下游100 bp作為基因的啟動子。通過BDGP 在線軟件預(yù)測到基因有3 個(gè)核心啟動子區(qū)，分別位于基因上游-1 624 bp～-1 575 bp，-1 597 bp～-1 548 bp，-167 bp～-118 bp（圖9A）。通 過Methprimer 軟件預(yù)測出在基因上-206 bp～+39 bp 的位置上有1 個(gè)245 bp 的CpG 島（圖9B）。通過啟動子在線分析軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)該啟動子序列包含有真核生物啟動子典型的TATA-box 和CAAT-box，并預(yù)測到大量可能存在的轉(zhuǎn)錄因子。

圖9 啟動子核心區(qū)和CpG 島預(yù)測

2.4基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測 通過在線軟件JASPAR、Animal TFDB、ALGGEN 和ChEA3 對啟動子上轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測，分別預(yù)測到633、584、312、65 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，使用Venn 在線軟件取4 個(gè)軟件預(yù)測結(jié)果的共同部分，得到9 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（圖10A），。結(jié)合在本課題組之前脂肪組織二代測序數(shù)據(jù)庫研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量較高的有，并在脂肪細(xì)胞生長過程中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。部分轉(zhuǎn)錄因子在部分啟動子上結(jié)合位點(diǎn)的相對位置如圖10B 所示。

圖10 預(yù)測出與FITM2 基因具有靶標(biāo)關(guān)系的轉(zhuǎn)錄因子及部分結(jié)合位點(diǎn)

2.5 廣靈大尾羊基因在4 種不同組織中的表達(dá)量 定量結(jié)果顯示，基因在4 種組織中都有表達(dá)，在脂肪細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于背最長肌組織，在淺層脂肪中的表達(dá)量顯著高于深層脂肪中的表達(dá)量（圖11A）。如圖11B 所示，基因的mRNA 表達(dá)量在分化過程中呈上升趨勢，表明可能促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化，并促進(jìn)脂滴的積累。轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)趨勢與一致，可能正調(diào)控基因并促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化。而在第4天之后呈下降趨勢，但與表達(dá)趨勢不完全相反。

圖11 實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果

3 討 論

是進(jìn)化上高度保守的基因，在細(xì)胞中將甘油三酯打包成脂滴的過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過基因克隆獲得廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)全長852 bp，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其編碼283 個(gè)氨基酸，沒有信號肽，與NCBI 上收錄的綿羊基因（XM_004014584.4）的編碼蛋白一致，但與豬、牛、人和小鼠的序列相比在5' 端多出21 個(gè)氨基酸。有研究表明，豬基因編碼262 個(gè)氨基酸，其中N 端的30 個(gè)氨基酸為信號肽，其作用是靶向運(yùn)輸分泌的FITM2 蛋白到胞外。但是廣靈大尾羊的FITM2 蛋白沒有預(yù)測到信號肽，可能與它在N 端多出的21 個(gè)氨基酸有關(guān)。生物信息學(xué)分析廣靈大尾羊FITM2 蛋白有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，二級結(jié)構(gòu)多為-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，前人研究發(fā)現(xiàn)FITM2 蛋白大部分結(jié)構(gòu)域是由跨膜結(jié)構(gòu)域組成的，而跨膜結(jié)構(gòu)域在本質(zhì)上是螺旋結(jié)構(gòu)，與本預(yù)測結(jié)果一致。本研究預(yù)測到廣靈大尾羊FITM2蛋白結(jié)構(gòu)含有多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可能成為蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)FITM2 蛋白和參與磷脂生物合成的基因之間有強(qiáng)相互作用，在之后的研究中發(fā)現(xiàn)FITM2 作為酰基輔酶A 雙磷酸酶在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)在脂滴中的正常儲存發(fā)揮作用。

脂肪細(xì)胞中含有大量脂滴，脂滴是細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)的主要儲存場所，由極性單磷脂層包裹疏水核心組成，參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)及脂類合成代謝等過程，是一個(gè)活動旺盛的多功能細(xì)胞器。研究表明，基因在哺乳動物組織中普遍表達(dá)，尤其在白色和棕色脂肪組織中表達(dá)最高。王靜對豬基因進(jìn)行組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)mRNA在各種組織中表達(dá)量都較高。研究發(fā)現(xiàn)基因沒有參與甘油三酯合成，只是在甘油三酯積累中發(fā)揮作用，基因主要表達(dá)于脂肪組織，其特點(diǎn)是產(chǎn)生大脂滴。本文對基因在廣靈大尾羊尾部、皮下、腎周脂肪和背最長肌組織中的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)mRNA 表達(dá)量在尾脂和皮下脂肪中不存在顯著差異，但和腎周相比差異顯著，且在3 種脂肪組織中的含量均顯著高于背最長肌組織，表明基因主要在脂肪組織中高表達(dá)，并且在綿羊前體脂肪細(xì)胞開始分化后，基因含量開始升高，表明基因可能促進(jìn)綿羊前體脂肪細(xì)胞分化，與前人研究一致。

真核生物基因表達(dá)量受多個(gè)水平的調(diào)控，尤其在轉(zhuǎn)錄水平，其中研究最多的是關(guān)于啟動子的研究，啟動子是啟動靶基因開始轉(zhuǎn)錄的DNA 序列，位于基因5'端上游序列中，可特異性識別和結(jié)合RNA 聚合酶并使之活化，從而起始轉(zhuǎn)錄。因此，研究啟動子有助于了解基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制。本研究預(yù)測到3 個(gè)核心啟動子區(qū)，分別位于基因上游-1 624 bp～-1 575 bp、-1 597 bp～-1 548 bp、-167 bp～-118 bp，發(fā)揮主要作用的核心區(qū)域需要進(jìn)一步通過構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告載體進(jìn)行雙熒光素酶活性分析驗(yàn)證。在啟動子的-206 bp～+39 bp的位置上預(yù)測到1 個(gè)長245 bp 的CpG 島，表明在此區(qū)間內(nèi)可能會發(fā)生甲基化修飾進(jìn)而影響基因的表達(dá)。在該啟動子序列中發(fā)現(xiàn)真核生物啟動子典型的TATA-box 和CAAT-box，并預(yù)測到大量可能存在的轉(zhuǎn)錄因子，做韋恩圖取交集并參照本課題組之前的脂肪組織轉(zhuǎn)錄組二代測序數(shù)據(jù)庫，篩選出和4 個(gè)在脂肪組織中含量較高的轉(zhuǎn)錄因子。因此本文初步研究了這4 種轉(zhuǎn)錄因子在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)趨勢，結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子和可能正調(diào)控基因表達(dá)并促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化，在第4 天之后表達(dá)量下降，與表達(dá)趨勢不一致且未完全相反，推測其可能不參與基因的表達(dá)調(diào)控。然而這些轉(zhuǎn)錄因子在成脂過程中能否通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)進(jìn)而影響前體脂肪細(xì)胞分化仍然未知，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)全長852 bp，編碼283 個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明FITM2 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有6 個(gè)跨膜域和26 個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，在哺乳動物間高度保守?；蛟谥窘M織中表達(dá)量高。初步篩選出STAT5A、YY1、USF2 和MAZ 4 個(gè)對基因活性可能有影響的轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探究廣靈大尾羊基因在脂肪沉積過程中的作用提供理論依據(jù)。