徐 晶，張昌政，鄭仰清，張廷榮，周李生

（青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109）

線粒體DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）是一種核外遺傳物質(zhì)，結(jié)構(gòu)較為簡單，分子量小，呈現(xiàn)嚴格的母系遺傳。mtDNA 由編碼區(qū)和非編碼區(qū)（包括D-loop 區(qū)）組成，編碼區(qū)編碼參與氧化磷酸化和生成ATP 的多肽，非編碼區(qū)包含復(fù)制起點以及轉(zhuǎn)錄啟動子等，是重要的調(diào)控區(qū)域。mtDNA 突變可能誘發(fā)疾病或個體表型差異，對其遺傳機制的解析具有一定的科學意義和實用價值。已有報道顯示：在人類中，mtDNA 突變可能影響許多疾病，如癌癥、糖尿病等；在畜禽中，發(fā)現(xiàn)mtDNA 突變與牛產(chǎn)犢率、肉質(zhì)、牛奶品質(zhì)性狀、胚胎生產(chǎn)效率、體重、豬繁殖力存在顯著關(guān)聯(lián)。但mtDNA 突變與豬生長和肉質(zhì)性狀之間關(guān)系的研究卻鮮有報道。

中國家豬資源豐富，品種繁多，大多數(shù)地方豬種都具有繁殖力高、抗逆性強等優(yōu)異種質(zhì)特質(zhì)，尤其肉質(zhì)品質(zhì)顯著優(yōu)于國外品種。魯萊黑豬作為具有代表性的中國培育新豬種，由我國萊蕪豬（具有代表性的中國地方豬品種）與約克夏豬雜交培育形成，肉質(zhì)優(yōu)良并以其肌內(nèi)脂肪含量高而聞名。因此本實驗重點研究魯萊黑豬mtDNA 中的突變位點與背膘厚度、背最長肌肌內(nèi)脂肪含量和背最長肌肌肉水分含量的關(guān)聯(lián)性，分析魯萊黑豬mtDNA 的遺傳效應(yīng)，從而為魯萊黑豬肉質(zhì)和生長等性狀的選育育種提供基礎(chǔ)可靠的研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究對象為433 頭魯萊黑豬，其中274 頭公豬，159 頭母豬。所有豬只均來源于萊蕪豬原種豬場。用耳號鉗采集耳組織樣品，放置于裝有75%酒精的離心管中，-20℃凍存，用于后續(xù)提取魯萊黑豬基因組DNA。

1.2 實驗分組 為盡可能搜尋魯萊黑豬群體中mtDNA的所有突變位點，本研究根據(jù)表型測定結(jié)果的差異，即背膘厚度（14.00～30.00 mm，30.00～45.00 mm，45.00～55.00 mm，＞55.00mm），背最長肌肌肉水分含量（54.00%～60.00%，60.00%～65.00%，65.00%～70.00%，70.00%～75.00%），肌內(nèi)脂肪含量（1.00%～4.00%，5.00%～10.00%，11.00%～15.00%，15.00%～19.00%）將實驗動物分為4 組，從每組中隨機挑選4 個個體，進行2 個樣本重復(fù)，共構(gòu)建8 個DNA 混池。具體如表1所示。

表1 DNA 混池樣品表

1.3 表型測定 魯萊黑豬體重達85 kg 左右時進行屠宰，屠宰后利用游標卡尺測量背中線肩部最厚處背膘厚（Backfat Thickness at the Shoulders，BFT_S）、胸腰椎結(jié)合處背膘厚（Backfat Thickness at Last Ribs，BFT_R）和腰薦椎結(jié)合處背膘厚（Backfat Thickness at the Loin，BFT_L）。取最后肋處背最長肌200 g 用于IMF和MMP 的測定。測定前，背最長肌需除去外周筋膜，用小型絞肉機攪碎放入65℃烘箱中烘干至恒重，根據(jù)烘干前后重量差占鮮重的百分比計算出水分含量。IMF含量采用索氏石油醚萃取法測定完成。

1.4 DNA 提取 采用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/細胞/ 組織基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN 生化科技公司）提取耳組織基因組DNA。用SpectraMax QuickDrop 超微量分光光度計對DNA 進行質(zhì)量檢測和濃度測定。A260/A280 比值在1.8～2.0、A260/A230 比值＞2.0 評定為合格的DNA。對合格的DNA 樣品使用雙蒸水（ddHO）統(tǒng)一稀釋濃度至20～50 ng/μL，用于后續(xù)實驗。

1.5 線粒體基因組測序 參照NCBI 中豬線粒體基因組序列（Sscrofa11.1 NC 000845.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，保證覆蓋線粒體的全部序列。每對引物的下游引物保證覆蓋下一對引物的上游引物并相距最少50 bp，擴增片段不超過1 000 bp 以保證測序的準確性，引物信息見表2。所有引物均由青島擎科生物公司合成。PCR 反應(yīng)體系：12.5 μL DreamTaqGreen PCR Master Mix（2X），8.5 μL ddHO，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板2 μL。PCR 擴增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳條件為180 V 35 min。將條帶明亮且單一的PCR 產(chǎn)物原液送由青島擎科生物公司Sanger 測序。如遇多拷貝序列，則正反向測序。

表2 魯萊黑豬mtDNA 測序PCR 引物及反應(yīng)條件

1.6 序列組裝及突變位點搜尋和分析 使用DNAMAN和Chromas 軟件查看測序結(jié)果比對峰圖，并且根據(jù)比對結(jié)果鑒定突變位點，獲取魯萊黑豬線粒體基因突變遺傳信息。使用SeqMan 軟件將35 對不同引物所測定的序列片段進行拼接，同時使用MEGA-X 軟件對拼接完整的全部mtDNA 序列進行核對。利用Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2）和SIFT-Protein（http://sift.jcvi.org）對突變位點進行功能預(yù)測，篩選有效的突變位點。使用在線網(wǎng)站Ensembl 進一步查閱位點保守性，越保守的位點發(fā)生變異越有可能對功能和結(jié)構(gòu)造成影響。根據(jù)突變位點的分析結(jié)果，將魯萊黑豬所有的耳組織DNA 樣品及篩選出的重要位點信息送至上海天昊生物科技有限公司進行SNaPshot 基因分型。

1.7 統(tǒng)計分析 利用R 包PerformanceAnalytics 中的函數(shù)chart.Correlation 計算表型BFT_S、BFT_R、BFT_L、背最長肌肌肉水分含量以及肌內(nèi)脂肪之間的相關(guān)顯著性并用Performance Analytics 繪制圖形進行數(shù)據(jù)可視化；使用PLINK 軟件中的線性模型進行關(guān)聯(lián)分析，將性別和體重作為固定效應(yīng)，其表達式為：y=+Xb+SNP×+e。其中，y 為測定表型值，表示總體平均值，X 是固定效應(yīng)的關(guān)聯(lián)矩陣，b 是性別和體重的固定效應(yīng)向量，為SNP 標記的效應(yīng)，e 為殘差。

2 結(jié)果

2.1 魯萊黑豬表型測定結(jié)果的相關(guān)性分析 該群體所測表型性狀均符合正態(tài)分布，由圖1 可見魯萊黑豬表型性狀之間的相關(guān)程度。肌內(nèi)脂肪與背最長肌肌肉水分含量相關(guān)性最強，呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.86；肌內(nèi)脂肪與BFT_S、BFT_R、BFT_L 都存在較弱的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.17、0.21、0.25；BFT_S、BFT_R、BFT_L 兩兩性狀之間存在強的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均大于0.6。除此之外，各性狀之間影響都極顯著（＜0.01）。

圖1 魯萊黑豬種群生長與肉質(zhì)性狀的表型相關(guān)系數(shù)

2.2 魯萊黑豬線粒體基因組突變位點的鑒定與生物學信息分析

2.2.1 mtDNA 突變鑒定 組裝拼接得到8 條魯萊黑豬的mtDNA 全序列，發(fā)現(xiàn)8 條mtDNA 序列的長度都約為16 750 kb。通過對隨機挑選的16 頭魯萊黑豬耳組織DNA 樣品測序結(jié)果進行比對，共在其線粒體基因組檢測到11 個突變位點，其中D-loop 區(qū)含有2 個突變（mt_241:T/C、mt_387:A/G），多肽編碼區(qū)9 個突變（mt_5351:A/T/ND2、mt_5666:T/C/ND2、mt_7992:A/G/COX1、mt_9130:A/G/ATP6、mt_9648:G/A/ATP6、mt_10537:T/C/COX3、mt_13751:G/A/ND5、mt_14326:T/C/ND5、mt_15141:A/G/ND6）。而12S rRNA、16S rRNA 以及tRNA 基因中未發(fā)現(xiàn)魯萊黑豬線粒體突變，如圖2 所示。

圖2 魯萊黑豬mtDMA 突變位點峰圖

2.2.2 mtDNA 突變位點分析 如表3 所示，在11 個突變位點中存在4 個錯義突變，僅突變位點mt_9648 氨基酸極性發(fā)生變化，其余突變位點氨基酸性質(zhì)沒有改變。同時對11 個突變位點進行有害性預(yù)測及保守性分析。利用在線網(wǎng)站Ensembl 查閱突變位點的保守性，基于90 種哺乳動物物種的多序列比對得到了位點的保守性分值。結(jié)果表明，位點mt_9648 分值絕對值最低，相對于其他位點保守性最低；位點mt_10537、mt_13751 以及mt_15141 保守性分值絕對值最高，位點也相對保守。采用Polyphen2 和SIFT-Protein 方法分別預(yù)測到2 個（mt_9130、mt_13751）和1 個（mt_9648）有害突變位點，見表4?；谏鲜龇治鼋Y(jié)果，mt_9130、mt_9648和mt_13751 3 個突變位點的多態(tài)性更容易對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能造成影響。

表3 魯萊黑豬mtDNA 突變位點氨基酸分析

表4 魯萊黑豬mtDNA 突變位點有害預(yù)測及保守分析

2.3 魯萊黑豬mtDNA 功能突變位點與生長和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析 通過位點有害性預(yù)測和保守性分析篩選出的3 個線粒體突變位點mt_9130、mt_9648、mt_13751與魯萊黑豬的背膘厚度、肌內(nèi)脂肪以及背最長肌肌肉水分含量進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mt_9130 和mt_9648 2 個突變位點均對魯萊黑豬的肌內(nèi)脂肪影響極顯著，對背最長肌肌肉水分含量影響顯著。mt_13751 突變位點在矯正性別與體重因素后，對BFT_R 影響顯著。除此之外，發(fā)現(xiàn)mt_9130 與mt_9648 2 個突變位點之間對性狀的影響效應(yīng)總是連鎖相同的（表5）。

表5 魯萊黑豬mtDNA 突變位點與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

背膘厚度、背最長肌肌肉水分含量和肌內(nèi)脂肪對豬的生長和肉質(zhì)具有重要的經(jīng)濟意義，而其是否受mtDNA 的影響是一個值得關(guān)注研究的問題。先前mtDNA 被廣泛報道與牛羊豬等動物的復(fù)雜性狀相關(guān)，但在豬生長和肉質(zhì)等方面的研究卻是極少。此外已有研究表明，在人類疾病中，線粒體編碼基因的突變會導(dǎo)致氧化磷酸化酶復(fù)合物的變化，因此可合理猜想線粒體DNA 對豬的經(jīng)濟性狀有影響。本研究則以魯萊黑豬為研究對象，探討mtDNA 變異與背膘厚度、MMP 以及IMF 之間的關(guān)聯(lián)。

母系遺傳的線粒體基因是雙鏈的，在豬中約為16.7 kb。本研究在魯萊黑豬群體中測得其全長約為16 750 bp，跟報道相一致。本研究根據(jù)表型差異分組，從組別中隨機挑選測序樣本，隨機性更強，范圍更廣，數(shù)據(jù)更加可靠。通過對魯萊黑豬群體線粒體基因測序，發(fā)現(xiàn)存在11 個突變位點。其中多肽編碼區(qū)存在9 個突變位點，D-loop 區(qū)存在2 個突變位點。D-loop 區(qū)的序列不編碼蛋白，是mtDNA 的調(diào)控區(qū)域，且該區(qū)域的變異高于其他mtDNA 區(qū)域或核基因，已被廣泛用于研究種群之間的關(guān)系。因此本研究重點探討了多肽編碼區(qū)突變位點對背膘厚度、背最長肌肌肉水分含量和肌內(nèi)脂肪的影響。

本實驗篩選出3 個突變位點（mt_9130、mt_9648、mt_13751）。mt_9130 與mt_9648 位于基因上游，mt_9130 同時位于基因末端?；蚴茿TP 合成酶F0 亞基6，基因是線粒體編碼的ATP合酶膜亞基8，兩者都是ATP 合成酶的重要亞基。ATP合酶在動物機體能量代謝中發(fā)揮重要作用，控制著ATP的合成，參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖等重要物質(zhì)的代謝活動，當、基因上位點發(fā)生突變時會引起ATP 合成酶功能的改變。據(jù)Ensembl 網(wǎng)站報道記錄，突變位點mt_9130 與mt_9648 可能與線粒體疾病以及線粒體DNA 缺失綜合征相關(guān)，且在人類基因上已存在突變個體。突變位點mt_13751 位于ND5 基因中，是mtDNA 的一個蛋白編碼基因，是NADH 脫氫酶的2 個亞基，而NADH 脫氫酶是呼吸鏈復(fù)合體I 的主要組成，在呼吸鏈中直接參與氫與電子傳遞并通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，進而參與能量代謝。有研究證明了mtDNA上的基因在不同品種雞中的異質(zhì)性對脂肪性狀和肉質(zhì)性狀產(chǎn)生顯著關(guān)聯(lián)，說明基因表達對脂肪性狀具有一定影響，可能原因是NADH脫氫酶在能量代謝中脂肪轉(zhuǎn)化過程的功能。

在混合線性模型分析中，不必要因素會干擾主要因素的估計。因此本研究的關(guān)聯(lián)分析模型中矯正了性別跟體重，結(jié)果表明背膘厚度、MMP 以及IMF 都會收到相應(yīng)突變位點遺傳效應(yīng)的影響。但位點mt_13751 僅對BFT_R 有顯著影響，可能原因：一是不同組織部位線粒體基因表達存在差異性，二是不同部位mtDNA 存在異質(zhì)性相關(guān)。根據(jù)研究結(jié)果，在今后魯萊黑豬育種選育過程中，可以適當淘汰少數(shù)野生型個體豬，以mt_9130、mt_9648 以及 mt_13751 的突變豬個體為母本進行繁殖交配，改善提高種群的背膘厚度、背最長肌肌肉水分含量和肌內(nèi)脂肪含量。綜上所述，本研究結(jié)果證實了mtDNA 遺傳變異對魯萊黑豬重要經(jīng)濟性狀存在遺傳效應(yīng)，并推動了對mtDNA 的進一步研究。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果突出了魯萊黑豬線粒體基因的突變，評價了mtDNA 突變對背膘厚度、背最長肌肌肉水分含量和肌內(nèi)脂肪的影響，表明了mt_9130、mt_9648 以及mt_13751 可以成為魯萊黑豬育種計劃中的潛在分子育種標記，并進一步將其應(yīng)用于標記輔助選擇來改良魯萊黑豬品種，改善肉品質(zhì)，提高經(jīng)濟效益。