崔琳琳 袁曉梅 高艷紅 姜佳峰 關永霞

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu的干燥果實，含有黃酮類、酚酸類、三萜類、生物堿等多種活性成分，具有降血糖、抗腫瘤等多種藥理活性[1]。隨著社會技術的發(fā)展進步，液質聯(lián)用技術已廣泛應用于中藥的有效活性成分鑒定研究中，其具有高選擇性、高靈敏度和高精準度等特點，實現(xiàn)了色譜和質譜的優(yōu)勢互補，對未知化合物的鑒定和識別展現(xiàn)出全面、精準的具大優(yōu)勢[2-3]。網(wǎng)絡藥理學是系統(tǒng)生物信息學研究的重要工具，利用網(wǎng)絡可視化方法分析疾病與藥物及靶點間復雜的相互作用關系，具有整體性和系統(tǒng)性特點，目前已廣泛用于預測中藥調控機體生物網(wǎng)絡的作用機制研究中[4]。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q-Orbitrap-MS)技術對覆盆子中化學成分進行全面快速的鑒定，并結合網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探索其治療糖尿病的作用機制，以期為覆盆子的藥效物質基礎、質量控制及臨床應用等提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

覆盆子(批號：200910)，購于安徽中藥飲片有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學翟延君教授鑒定為薔薇科植物華東覆盆子的干燥果實。

1.2 實驗試劑

山奈酚3-O-云香糖苷(批號：112007-201602)、鞣花酸(批號：111959-201903)、椴樹苷(批號：112000-201802)、槲皮素(批號：100081-201610)、金絲桃苷(批號：111521-201809)、山奈酚(批號：110861-201812)、蘆丁(批號：100080-201811)，均購自中國食品藥品檢定研究院；紫云英苷(批號：ps01137p-0025MG)，購自成都普菲德生物醫(yī)藥科技股份有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均為質譜純，其余為分析純。

1.3 實驗儀器

UPLC-Q-Orbitrap-MS四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)，XS105DU型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，DRHH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實驗設備有限公司)，KS-5200DE型數(shù)顯恒溫超聲波清洗機(昆山潔力美超聲儀器有限公司)。

1.4 色譜條件

Waters CORTECS C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)梯度洗脫：0-5分鐘，10%～20%B；5-20分鐘，20%～30%B；20-50分鐘，30%～35%B；50-65分鐘，35%～40%B；65-95分鐘，40%～50%B；95-100分鐘，50%～60%B；流速：0.3 mL/min；進樣量1 μL；柱溫30℃。

1.5 質譜條件

離子源采用HESI源，霧化電壓3.5 kV，鞘氣流速：35 μL/min；輔助氣流速：10 μL/min；毛細管溫度350℃；輔助氣加熱溫度：310℃；掃描模式Full MS/dd-MS2 模式，采用正、負離子模式采集，掃描m/z范圍：100～1 500。

1.6 覆盆子活性成分和作用靶點收集

基于液質聯(lián)用獲得的化學成分，通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)對成分進行篩選和補充，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug like，DL)≥0.15為篩選條件，獲得活性化合物及其作用的蛋白質靶點，篩選結束后，為標準化蛋白質靶點信息，統(tǒng)一在Uniprot蛋白質數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)將化合物作用的蛋白質靶點進行規(guī)范。

1.7 2型糖尿病相關靶點收集

以“Type 2 diabetes mellitus”為關鍵詞，應用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)得到2型糖尿病相關靶點。

1.8 PPI網(wǎng)絡的構建

為明晰覆盆子成分相關靶點與2型糖尿病靶點間的相互作用，將二者靶點取交集并繪制韋恩圖。進一步將交集靶點提交至STRING11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構建PPI網(wǎng)絡模型，利用Cytoscape3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡圖。

1.9 活性成分—疾病靶點生物功能與通路富集分析

將潛在靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，物種選擇為“Homo sapiens”，進行基因本體論(Gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，建立數(shù)據(jù)文件，利用Cytoscape3.7.1軟件構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡。

1.10 分子對接驗證

對覆盆子核心成分和PPI網(wǎng)絡得到的核心靶點進行分子對接驗證。從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫下載核心成分對應小分子配體的2D結構圖，通過PyMOL軟件將其轉化為3D結構，從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載核心靶點對應的大分子受體蛋白的3D結構，通過PyMOL軟件對其移除溶媒和配體分子，并導入AutoDockTools進行加氫等預處理。使用AutoDockTools確定受體蛋白對接區(qū)域后，最終運行AutoDockVina1.1.2對受體和配體進行分子對接并計算結合能，利用PyMOL對模型進行可視化。

2 結果

2.1 覆盆子化學成分分析

取覆盆子供試品溶液及混合對照品溶液，按1.4、1.5項下條件進樣分析，得到正、負離子質譜圖，見圖1、圖2。使用Xcalibur 3.0軟件對質譜信息進行數(shù)據(jù)分析，結合相關文獻報道及對照品進行化合物鑒別[5-9]，鑒定出36種成分，其中黃酮類成分16個，鞣質類成分12個，酚酸類成分8個，見表1。

圖2 覆盆子負離子模式下總離子流圖

表1 覆盆子主要化學成分表

續(xù)表

續(xù)表

2.2 活性成分與靶點信息

通過數(shù)據(jù)庫篩選，共篩選覆盆子活性成分8種，潛在靶點155個，獲得疾病相關靶點1882個。將覆盆子8種活性成分與155個潛在作用靶點導入Cytoscape3.7.1軟件中構建“活性成分-關鍵靶點”網(wǎng)絡圖。網(wǎng)絡中共涉及163個節(jié)點(靶點蛋白)和242條邊(蛋白相互作用)，其中倒三角代表活性成分，菱形代表關鍵靶點。根據(jù)網(wǎng)絡的拓撲學性質，對網(wǎng)絡進行度值評價，篩選重要成分共4種(度值≥17)，有槲皮素、山奈酚、甾谷醇和鞣花酸，推測其是覆盆子治療2型糖尿病的關鍵成分。見圖3。

圖3 覆盆子活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.3 PPI網(wǎng)絡的構建

將篩選的覆盆子活性成分靶點與疾病靶點取交集，并繪制韋恩圖，進而將靶點提交至STRING11.0平臺，將STRING11.0數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點蛋白相互作用數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡。PPI網(wǎng)絡中共有97個節(jié)點，776條邊。

節(jié)點大小和顏色深淺代表度值的大小，節(jié)點越大，顏色越深，其對應的度值越大；邊的粗細程度代表結合分數(shù)，邊越粗則結合分數(shù)值越大。在該網(wǎng)絡中，節(jié)點平均度值16，大于平均度值的核心節(jié)點共有36個，其中Akt1、IL6、TP53、TNF、VEGFA、MAPK1和JUN靶點蛋白度值較高(>40)，是關鍵靶點，這提示覆盆子可能通過這些靶點網(wǎng)絡發(fā)揮作用，同時也提示著各成分之間可能存在的協(xié)同作用。見圖4、圖5。

圖4 覆盆子治療2型糖尿病相關靶點韋恩圖

圖5 覆盆子治療2型糖尿病的潛在作用靶點相互作用網(wǎng)絡圖

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

對覆盆子治療2型糖尿病的核心靶點進行GO分類和KEGG富集分析，GO功能富集包括生物過程、細胞組分和分子功能3個部分，其中生物過程主要涉及對脂多糖的反應、炎癥反應、活性氧代謝過程、上皮細胞增殖等；細胞組分主要涉及膜筏、細胞質核周區(qū)、細胞外基質和質膜蛋白復合物等；分子功能主要涉及DNA結合轉錄因子結合、蛋白質同二聚化活性、細胞因子受體結合和蛋白域特異性結合等。KEGG結果顯示主要涉及癌癥途徑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路和HIF-1信號通路等，推測覆盆子是通過調節(jié)這些通路治療2型糖尿病的。見圖6～9。

圖6 覆盆子治療2型糖尿病的生物過程氣泡圖

圖7 覆盆子治療2型糖尿病的細胞組分氣泡圖

圖8 覆盆子治療2型糖尿病的分子功能氣泡圖

圖9 覆盆子治療2型糖尿病的KGGG通路氣泡圖

2.5 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡的構建

將富集分析得到KEGG通路對應覆盆子治療2型糖尿病的靶點及成分，構建“成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡，此網(wǎng)絡由168個節(jié)點和694條邊構成，其中圓形代表活性成分，菱形代表關鍵靶點，倒三角代表信號通路。根據(jù)網(wǎng)絡的拓撲學性質，對網(wǎng)絡進行度值評價，根據(jù)度值、介度、緊密度確定關鍵節(jié)點。其中度值較高的成分有槲皮素(126)、山奈酚(52)、甾谷醇(29)、鞣花酸(17)。度值較高的通路有Pathways in cancer(60)、TNF信號通路(49)、MAPK信號通路(47)、AGE-RAGE信號通路(37)。

結果顯示覆盆子每種活性成分對應多個靶點，每個靶點連接多種成分，體現(xiàn)了“多成分、多靶點”的作用機制，同時，多條通路之間是通過共有靶點連接而非獨立分開的，表明各條通路之間可發(fā)揮協(xié)同作用起到治療作用。見圖10。

圖10 覆盆子治療2型糖尿病的“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖

2.6 分子對接

選取PPI網(wǎng)絡中度值排名前7的靶點蛋白，即Akt1、IL6、TP53、TNF、VEGFA、MAPK1和JUN與“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡中度值排名前5的活性成分：槲皮素、山奈酚、甾谷醇、鞣花酸和兒茶素。利用AutoDock Tools進行分子對接，結果見表2。對接分數(shù)的絕對值越大，化合物與靶點結和力越強，分子構象越穩(wěn)定，結果顯示槲皮素、山奈酚與TP53的親和力最強，鞣花酸、兒茶素與TNF的結合能力最強，甾谷醇與VEGFA的結合能力最強。其中親和力較強的分子對接圖見圖11?？梢杂^察到藥物活性成分與靶點蛋白相結合的具體位點，黃色連線為二者之間的氫鍵相互作用力，是促使分子結合到活性位點的主要作用力。

表2 覆盆子治療T2DM核心成分與靶點的分子對接結果

圖11 覆盆子治療2型糖尿病核心成分與靶點分子對接圖

3 討論

本研究前期分別對提取溶劑(水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇)以及提取方法(超聲、回流)進行了考察，以篩選最佳提取方法。結果表明采用70%甲醇回流提取時，各分析物響應最好，提取率最高，提取效果最優(yōu)。在優(yōu)化色譜條件時，本研究重點比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水和乙腈(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸水分別作為流動相時的色譜行為，結果表明采用甲醇-0.1%甲酸水溶液做流動相時的色譜峰較多且分離度較好。

本研究通過液質聯(lián)用技術鑒定出覆盆子36種成分，其中黃酮類成分16個，鞣質類成分12個，酚酸類成分8個，并通過數(shù)據(jù)庫篩選出槲皮素、山奈酚、甾谷醇和鞣花酸等8個活性成分。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素通過上調大鼠胰島細胞瘤細胞活性，促進胰島素的分泌[10]。此外，槲皮素還可改善高糖引起的細胞損傷，改善糖尿病大鼠的糖代謝水平，保護大鼠胰島細胞瘤細胞免受高糖損傷。山奈酚可以與α-葡萄糖苷酶直接結合，表現(xiàn)出酶抑制效應，降低體內血糖含量[11]。鞣花酸[12]可顯著改善糖尿病小鼠脂肪組織異常的胰島素信號，降低脂肪組織Beclin1和LC3II/I蛋白表達。

KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)覆盆子治療2型糖尿病的主要信號通路有癌癥途徑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路和HIF-1信號通路等。癌癥途徑主要與癌癥疾病相關，與該通路相關的靶基因有61個，這提示2型糖尿病與癌癥存在某些共同的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs-RAGE是糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展主要原因之一，當機體糖尿病應激狀態(tài)時，RAGE出現(xiàn)異常高表達，激活下游NF-κB等轉錄因子高表達，引發(fā)炎癥反應，使IL-6及TNF-α等炎癥因子大量釋放，出現(xiàn)組織細胞的功能障礙和結構損傷，引起各種病理變化，從而參與糖尿病多種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[13-14]。HIF-1信號通路是機體低氧應激反應時的主要靶點,研究表明，抑制HIF-1α表達能降低糖尿病小鼠的血糖水平[15]。TNF-α是一類重要炎性遞質，與胰島素抵抗有密切關系，TNF-α可干擾胰島素信號的轉導通路進而導致機體發(fā)生胰島素抵抗[16-17]。

綜上，本研究通過UPLC-Q-Orbitrap-MS技術結合網(wǎng)絡藥理學方法，對覆盆子的化學成分進行解析并對其治療2型糖尿病的作用機制進行預測分析，建立了覆盆子“成分-疾病-通路”的生物學網(wǎng)絡，并從多個角度探索覆盆子治療2型糖尿病的潛在分子機制，為覆盆子后續(xù)的藥效物質基礎以及作用機制研究提供了參考。