胡 昕， 駱葉晴， 孫耀斌， 陳紅兵， 謝彥海,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院， 江西 南昌 330047； 3.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院， 江西 南昌 330047)

食物過(guò)敏是由于接觸或攝入食物引起的異常免疫反應(yīng)[1]。水產(chǎn)品過(guò)敏是最常見(jiàn)的食物過(guò)敏之一，其中八大類(lèi)過(guò)敏食物中水產(chǎn)品就占兩大類(lèi)，即魚(yú)類(lèi)和甲殼類(lèi)[2]。我國(guó)水產(chǎn)品生產(chǎn)量和消費(fèi)量位于世界前列，2020年我國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到6 549.0萬(wàn)t[3]，但隨著水產(chǎn)品消費(fèi)量的逐年增加，尤其是甲殼類(lèi)水產(chǎn)品引起的食物過(guò)敏問(wèn)題愈加突出。日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)，俗稱(chēng)河蝦，是我國(guó)常見(jiàn)食用淡水蝦之一。日本沼蝦體內(nèi)的原肌球蛋白(tropomyosin, TM)為蝦蟹類(lèi)的泛過(guò)敏原蛋白，易引起部分敏感人群產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)[4]。

巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，在機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用[5]。巨噬細(xì)胞極化是指在不同因素誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的表型與功能[6]。激活后的巨噬細(xì)胞表型一般分為2種：經(jīng)典激活途徑M1型和替代激活途徑M2型[7]。M1型巨噬細(xì)胞通常由TLR配體如脂多糖(LPS)和細(xì)胞因子如干擾素- γ(IFN- γ)等刺激產(chǎn)生，具有高抗原提呈能力和促炎效果，在宿主抵抗感染中起關(guān)鍵作用[8]。M2型巨噬細(xì)胞通常由細(xì)胞因子IL- 4、IL- 10和IL- 13等刺激產(chǎn)生，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能[9]。

巨噬細(xì)胞與食物過(guò)敏的關(guān)系至今不清晰，有研究表明巨噬細(xì)胞或參與食物過(guò)敏反應(yīng)。在IFN- γ的作用下，巨噬細(xì)胞可發(fā)揮專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞(APC)功能，巨噬細(xì)胞表達(dá)的MHC Ⅰ和Ⅱ類(lèi)分子水平顯著升高，可提呈抗原肽- MHC Ⅱ類(lèi)分子復(fù)合物給CD4+T細(xì)胞，參與食物過(guò)敏反應(yīng)[5]。食物過(guò)敏反應(yīng)主要為IgE介導(dǎo)，巨噬細(xì)胞高表達(dá)IgE低親和力特異性受體FcεRII，可能通過(guò)FcεRII受體參與減輕或降低過(guò)敏現(xiàn)象，還可能在食物過(guò)敏原的口服耐受中起重要作用[10]。巨噬細(xì)胞是肺中最豐富的免疫細(xì)胞，在致敏原誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中十分重要，因此可以猜測(cè)巨噬細(xì)胞在食物過(guò)敏起到一定的作用[11]。在中國(guó)龍蝦和卵清蛋白食物過(guò)敏小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2組過(guò)敏小鼠肺部出現(xiàn)炎癥性改變，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)中包含大量巨噬細(xì)胞[12]。巨噬細(xì)胞表達(dá)的 DC- SIGN和TIM- 4可能誘導(dǎo)食物過(guò)敏反應(yīng)產(chǎn)生特異性IgE[13]。Kim等[14]在卵清蛋白致敏小鼠模型中發(fā)現(xiàn)CHI3L1促進(jìn)Th2相關(guān)炎癥反應(yīng)和M2型巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而影響食物過(guò)敏的發(fā)展進(jìn)程。但巨噬細(xì)胞極化與水產(chǎn)品過(guò)敏的相關(guān)機(jī)制還不明確，本研究為了解原肌球蛋白與巨噬細(xì)胞極化間的作用機(jī)制，對(duì)原肌球蛋白和細(xì)胞因子刺激后的小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序，篩選差異基因和相關(guān)信號(hào)通路。最后利用熒光定量PCR驗(yàn)證信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的變化，了解原肌球蛋白參與巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)的相關(guān)通路，為進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞極化與食物過(guò)敏的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性BALB/c小鼠，6～7周齡，18～20 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019- 0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已得到南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、100×青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺、50 mmol/L β-巰基乙醇，美國(guó)Gibco公司；LPS、IL- 4、IFN- γ、Tri-zol，美國(guó)Invitrogen公司；HiScript III RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Applied Biosystems Quant Studio TM3型實(shí)時(shí)熒光PCR儀、NanoDrop ONEC型超微量核酸蛋白測(cè)定儀，美國(guó) Thermo Fisher公司；CKX41 型倒置熒光顯微鏡，日本 Olympus 公司。Nova Seq6000型測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1日本沼蝦原肌球蛋白的提取純化

將新鮮日本沼蝦蝦肉搗碎，預(yù)冷丙酮除脂，室溫下風(fēng)干沉淀得到丙酮粉，溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH 值7.4)中攪拌12 h，離心(10 000 r/min、30 min、4 ℃)取上清液。用硫酸銨(277 g/L)鹽析蛋白粗提液，硫酸銨全部溶解后繼續(xù)攪拌30 min。離心(10 000 r/min、30 min、4 ℃)取沉淀，沉淀用10 mL 0.02 mol/L Tris- HCl(pH值8.0)復(fù)溶，沸水浴加熱10 min后離心(10 000 r/min、30 min、4 ℃)，上清液用于層析柱上樣。

陰離子交換層析柱(DEAE- Sepharose)純化原肌球蛋白：20 mmol/L Tris- HCl緩沖液(pH值8.0)充分平衡后上樣，20 mmol/L Tris- HCl緩沖液(pH值8.0)洗脫未結(jié)合柱材的雜質(zhì)，進(jìn)行梯度洗脫(含0.8 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris- HCl緩沖液，pH值8.0)，280 nm處檢測(cè)吸光度，流速1.5 mL/min，收集對(duì)應(yīng)洗脫峰的洗脫液，經(jīng)SDS- PAGE和質(zhì)譜分析鑒定為原肌球蛋白。將原肌球蛋白除鹽濃縮，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用EpiData 3.1軟件錄入數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較分析采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

小鼠麻醉后脫頸處死，體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡5 min，分離大腿股骨和脛骨，用注射器吸5 mL BMDM培養(yǎng)基(100 mL IMDM培養(yǎng)基、10 mL胎牛血清、1 mL雙抗、1 mL 非必需氨基酸、1 mL丙酮酸鈉、30 mL L929細(xì)胞上清液)沖洗骨髓腔，再用注射器吸取培養(yǎng)基反復(fù)吹打骨髓，使細(xì)胞均勻分散，補(bǔ)充培養(yǎng)基至20 mL后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后再加入10 mL BMDM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，第7天收集細(xì)胞。

1.3.3原肌球蛋白誘導(dǎo)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞極化

將巨噬細(xì)胞接種至6孔板(細(xì)胞量2.5×106個(gè)/孔)，分為PBS組(PBS對(duì)照組)、TM組(原肌球蛋白誘導(dǎo)組)、LPSIFN組(LPS和 IFN- γ聯(lián)合誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞組)、IL4組(IL- 4誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞組)共4組。將6孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。隨后向TM組培養(yǎng)基中加入原肌球蛋白(終質(zhì)量濃度為10 μg/mL)，其他組加入等體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，接著向LPSIFN組培養(yǎng)基中加入LPS(終質(zhì)量濃度為100 ng/mL)和IFN- γ(終質(zhì)量濃度為20 ng/mL)，IL4組培養(yǎng)基中加入IL- 4(終質(zhì)量濃度為20 ng/mL)，其他組加入等體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別誘導(dǎo)骨髓源巨噬細(xì)胞極化為M1型和M2型。誘導(dǎo)結(jié)束后收集細(xì)胞用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3.4轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，加入Trizol溶液，放入液氮速凍。樣品合格的標(biāo)準(zhǔn)為OD260/280=1.8～2.2、OD260/230≥2.0、RNA 完整值(RIN)≥7.0、28S/18S≥1.0、總量>1 μg。RNA提取及測(cè)序過(guò)程由上海派森諾生物科技有限公司完成，經(jīng)Illumina NovaSeq6000測(cè)序平臺(tái)得到原始數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)過(guò)濾后用于后續(xù)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)分析。

1.3.5巨噬細(xì)胞總RNA的提取

用1.3.3方法誘導(dǎo)骨髓源巨噬細(xì)胞極化。離心收集細(xì)胞，用PBS清洗2次，加入1 mL Trizol吹打后加入200 μL氯仿，渦旋15 s，靜置3 min后離心(12 000 r/min、15 min、4 ℃)。吸取上清液，加入等量異丙醇后混勻，靜置10 min后離心(12 000 r/min、10 min、4 ℃)。棄上清液，加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇重懸，離心(7 500 r/min、10 min、4 ℃)后棄上清液，重復(fù)1次。加入無(wú)核酶ddH2O溶解RNA沉淀。RNA的質(zhì)量和完整性用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳和OD260/280值來(lái)評(píng)價(jià)。最后用HiScript Ⅲ RT SuperMix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.6熒光定量PCR驗(yàn)證

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果初步篩選出巨噬細(xì)胞極化可能的信號(hào)通路，如NOD樣受體信號(hào)通路、Jak- STAT 信號(hào)通路、NF- κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路。利用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)。反應(yīng)體系為：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，無(wú)菌ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)(95 ℃、 10 s，60 ℃、 30 s)。β-actin為內(nèi)參基因，所有熒光定量引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用2-ΔΔCT方法來(lái)計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算及繪圖。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)量分析

對(duì)PBS組、TM組、IL4組、LPSIFN組共12個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)(堿基數(shù))和過(guò)濾后的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)質(zhì)量見(jiàn)表2。Q20(堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基占比)最低值為96.09%，Q30(堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基占比)最低值為91.01%，均大于90%，證明樣品轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較好，測(cè)序數(shù)據(jù)可進(jìn)行后續(xù)分析。

表2 樣本數(shù)據(jù)整理及測(cè)序質(zhì)量

2.2 表達(dá)量分析

樣品表達(dá)水平相關(guān)性是衡量實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的重要指標(biāo)之一，采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)表示樣品間基因的表達(dá)水平相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)越接近1，表明樣品間表達(dá)水平相關(guān)性越高。樣品基因表達(dá)水平相關(guān)性分析見(jiàn)圖1。同組樣品的相關(guān)系數(shù)均大于0.90，證明樣品間相似度高，數(shù)據(jù)具有可靠性。

圖1 樣品基因表達(dá)水平相關(guān)性Fig.1 Correlation of gene expression levels among samples

2.3 基因表達(dá)差異分析

對(duì)TM組、IL4組、LPSIFN組巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)與PBS組進(jìn)行差異分析，基因表達(dá)差異重疊結(jié)果如圖2，共有17個(gè)相同差異基因。與PBS組相比，差異基因最多的為L(zhǎng)PSIFN組。根據(jù)表達(dá)差異倍數(shù)大于1，P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)，繪制差異基因統(tǒng)計(jì)圖(圖3)。在顯著差異基因比對(duì)中，PBS組與LPSIFN組共有2 379個(gè)顯著差異基因，LPSIFN組上調(diào)1 151個(gè)基因，下調(diào)1 228個(gè)基因。PBS組與IL4組共有556個(gè)顯著差異基因，IL4組上調(diào)298個(gè)基因，下調(diào)258個(gè)基因。IL4組與LPSIFN組共有2 440個(gè)顯著差異基因，LPSIFN組上調(diào)1 255個(gè)基因，下調(diào)1 185個(gè)基因，表明：M1型與M2型巨噬細(xì)胞之間存在大量的DEGs，其中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因iNOS、Fpr2在LPSIFN組中顯著上調(diào)，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因Arg、Egr2顯著下調(diào)，印證了誘導(dǎo)方法的正確性。TM刺激后，與PBS組相比，TM組上調(diào)69個(gè)基因，下調(diào)154個(gè)基因。TM組與IL4組共有901個(gè)差異基因，TM組上調(diào)455個(gè)基因，下調(diào)446個(gè)基因。TM組與LPSIFN組共有2 706個(gè)差異基因，TM組上調(diào)1 346個(gè)基因，下調(diào)1 360個(gè)基因。

圖2 差異表達(dá)基因韋恩圖Fig.2 Venn diagram of differentially expressed genes

圖3 不同組間顯著差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistics of expressed genes with significant differences between different groups

2.4 差異表達(dá)基因GO通路富集分析

GO(gene ontology)分析是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類(lèi)體系，可以全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO分析涵蓋3方面：細(xì)胞組分(cellular component, CC)、生物學(xué)功能(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)。對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果均包含3種類(lèi)別，但主要以生物學(xué)功能為主。

顯著性高的前20個(gè)基因功能分類(lèi)如圖4。對(duì)不同極化巨噬細(xì)胞進(jìn)行分析，IL4組與LPSIFN組[圖4(a)]基因功能分類(lèi)均為生物學(xué)功能，主要涉及免疫系統(tǒng)過(guò)程、防御反應(yīng)、免疫反應(yīng)等，證實(shí)了不同極化表型的巨噬細(xì)胞在免疫功能方面具有一定差異。PBS組與TM組[圖4(b)]注釋到的細(xì)胞組分主要為細(xì)胞外基質(zhì)、胞外區(qū)，生物學(xué)功能主要為細(xì)胞分化、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、細(xì)胞發(fā)育過(guò)程等，分子功能為蛋白質(zhì)結(jié)合。LPSIFN組與TM組[圖4(c)]注釋到的生物學(xué)功能較多，涉及免疫反應(yīng)、對(duì)外部刺激的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等，在分子功能方面，差異基因主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合過(guò)程。IL4組與TM組[圖4(d)]注釋到的生物學(xué)功能主要與細(xì)胞增殖相關(guān)，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、基因復(fù)制等，分子功能注釋到蛋白質(zhì)結(jié)合等。

圖4 GO通路富集差異基因分析Fig.4 GO pathway enrichment analysis of differential genes

2.5 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)是整合了基因組、化學(xué)、系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，可對(duì)代謝通路進(jìn)行注釋。

為確定巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)途徑，對(duì)4組樣品差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，見(jiàn)圖5。IL4組和LPSIFN組[圖5(a)]，共富集到306條通路，主要屬于人類(lèi)疾病、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)、環(huán)境信息加工。306條通路中與炎癥和免疫應(yīng)答相關(guān)的通路包括抗原加工和呈遞、NOD樣受體信號(hào)通路、Jak- STAT 信號(hào)通路、細(xì)胞因子- 細(xì)胞因子受體相互作用、NF- κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。

PBS組與TM組[圖5(b)]差異基因KEGG通路富集分析得到180條通路，排名前20的通路主要屬于人類(lèi)疾病、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)、新陳代謝、環(huán)境信息加工，涉及氨基酸代謝、細(xì)胞黏附、糖脂類(lèi)通路、MAPK信號(hào)通路等通路。LPSIFN組與TM組[圖5(c)]KEGG通路富集分析得到308條通路，排名前20的通路屬于人類(lèi)疾病、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)、新陳代謝，308條通路中與免疫反應(yīng)相關(guān)通路包括抗原加工和呈遞、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞因子- 細(xì)胞因子受體相互作用、 Jak- STAT 信號(hào)通路、NF- κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等。IL4組與TM組[圖5(d)]KEGG通路富集分析得到269條通路，排名前20的通路屬于人類(lèi)疾病、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)、基因信息處理、環(huán)境信息加工，其中細(xì)胞因子- 細(xì)胞因子受體相互作用、Jak- STAT信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、NF- κB信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等與免疫反應(yīng)相關(guān)。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 巨噬細(xì)胞極化信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性和推測(cè)巨噬細(xì)胞極化與原肌球蛋白的關(guān)系，根據(jù)通路富集結(jié)果，選擇NOD樣受體信號(hào)通路、Jak- STAT 信號(hào)通路、NF- κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路5條相關(guān)通路，對(duì)這5條通路中具有顯著性差異的關(guān)鍵基因NOD2、TLR2、AKT3、NLRP3、Caspase- 1、CD14、Lat、Myd88、NFKBIA、STAT1進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，基因變化趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果基本一致。與PBS組和IL4組相比，LPSIFN組中NOD2、TLR2、AKT3、NLRP3、Caspase- 1、CD14、Myd88、NFKBIA、STAT1的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，Lat的相對(duì)表達(dá)量顯著下降。TM組NOD2、TLR2、NLRP3、STAT1的相對(duì)表達(dá)量相較于PBS組顯著增加，其余基因變化無(wú)顯著差異。此外，結(jié)果還證實(shí)LPS、IFN- γ和TM聯(lián)合刺激后NOD2、TLR2相對(duì)表達(dá)量顯著增加，而AKT3、Myd88、NFKBIA、STAT1的相對(duì)表達(dá)量上升但不顯著。初步推測(cè)原肌球蛋白可能通過(guò)NOD樣受體信號(hào)通路、Jak- STAT信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞的極化。在IL- 4和TM聯(lián)合刺激后TLR2相對(duì)表達(dá)量顯著升高，NOD2、AKT3、NLRP3、Caspase- 1、CD14、Lat的相對(duì)表達(dá)量降低，Myd88、STAT1相對(duì)表達(dá)量升高，但不存在顯著性差異。初步預(yù)測(cè)原肌球蛋白可能通過(guò)Toll樣信號(hào)通路調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞的極化。

不同小寫(xiě)字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖6 熒光定量PCR基因驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 Fluorescence quantitative PCR of gene verification results

3 討 論

食物過(guò)敏是一個(gè)多因素影響的免疫反應(yīng)，涉及固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，但巨噬細(xì)胞在固有免疫反應(yīng)中的作用尚不明確。巨噬細(xì)胞的極化特性反映其功能的多變，本研究選擇日本沼蝦原肌球蛋白作為致敏原刺激巨噬細(xì)胞，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平研究原肌球蛋白和不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的基因表達(dá)差異。

TM組和PBS組進(jìn)行差異基因比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要富集到細(xì)胞黏附、氨基酸代謝等通路。細(xì)胞黏附因子是介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞外基質(zhì)間結(jié)合的一種蛋白質(zhì)分子，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[15]。氨基酸的代謝可影響巨噬細(xì)胞的功能，同型半胱氨酸是甲硫氨酸與蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，使其向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化[16]。SLAMF9、Macro、Fpr2屬于TM組與PBS組的差異基因，在TM組顯著上調(diào)，與M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)趨勢(shì)一致。SLAMF9共同調(diào)控LPS誘導(dǎo)且由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟炎癥[17]。習(xí)大林等[18]等沉默巨噬細(xì)胞中Macro基因后巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力降低，Macro在TM組上調(diào)表明TM或可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力。Fpr2是新的M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因[19]，F(xiàn)pr2在IL4組下調(diào)，LPSIFN組和TM組上調(diào)。

M1與M2型巨噬細(xì)胞差異基因的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，其主要涉及的免疫相關(guān)通路有NOD樣受體信號(hào)通路、Jak- STAT 信號(hào)通路、NF- κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路等，這些通路均與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)。TM組與IL4組、TM組與LPSIFN組富集到的通路較多，其中包含這5條免疫相關(guān)通路。原肌球蛋白刺激巨噬細(xì)胞后NOD2、TLR2、NLRP3、STAT1基因表達(dá)量顯著增加。LPS、IFN- γ和TM聯(lián)合刺激后NOD2、TLR2基因表達(dá)量顯著增加，IL- 4和TM聯(lián)合刺激后TLR2基因表達(dá)量顯著升高。TLR2是固有免疫反應(yīng)中的一個(gè)重要因子，可促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞的極化，TLR2拮抗劑cu- cpt22可將LPS體外誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細(xì)胞[20]。Jak- STAT 信號(hào)通路可與Toll樣受體信號(hào)通路中的TLR相互作用，共同調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞極化和炎癥反應(yīng)[21]。STAT1是一種非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化，Zhu等[22]證實(shí) miR- 19a- 3p靶向作用于STAT1，下調(diào)STAT1的表達(dá)，抑制M1型巨噬細(xì)胞極化。

4 結(jié) 論

本研究用熒光定量驗(yàn)證了與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的NOD樣受體信號(hào)通路、Jak- STAT 信號(hào)通路、NF- κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路表達(dá)差異關(guān)鍵基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與M2型巨噬細(xì)胞相比，M1型巨噬細(xì)胞中NOD2、TLR2、AKT3、NLRP3、Caspase- 1、CD14、Mdy88、NFKBIA和STAT1基因的表達(dá)增高，而Lat基因表達(dá)下降。與PBS組相比，當(dāng)巨噬細(xì)胞中加入原肌球蛋白后，NOD2、TLR2、NLRP3、STAT1這4個(gè)基因具有顯著差異性，LPS、IFN- γ和TM聯(lián)合刺激和IL- 4和TM聯(lián)合刺激巨噬細(xì)胞后，TLR2表達(dá)量均顯著上升，表明原肌球蛋白可能通過(guò)NOD樣受體信號(hào)通路、Jak- STAT 信號(hào)通路和Toll樣信號(hào)通路調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞極化，但仍需要更多的研究來(lái)證明。巨噬細(xì)胞的M1/M2型極化并不是嚴(yán)格意義上的2種極端，在某些環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可以表現(xiàn)為混合表型，具有與M1和M2型相似的特征[23-24]。M1與M2表型的動(dòng)態(tài)變化與某些疾病狀況的發(fā)展有關(guān)，例如腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎等[25]，因此下一步研究將重點(diǎn)關(guān)注不同時(shí)間段原肌球蛋白刺激巨噬細(xì)胞極化的變化。