顏毛毛, 徐笑非, 彭思敏, 吳少輝, 郝占西, 魏遠安,*
(1.量子高科(廣東)生物有限公司, 廣東 江門 529081;2.華南理工大學 生命科學研究院, 廣東 廣州 510006)
益生元是一類選擇性地被宿主微生物吸收代謝,從而賦予宿主有益影響的化合物。益生元已被廣泛用于保健食品添加以調(diào)節(jié)機體代謝或增強機體免疫力,近期也被用于臨床上干預(yù)和預(yù)防許多免疫相關(guān)疾病[1-3]。由于目前認為益生元主要通過調(diào)節(jié)腸道微生物的組成及代謝,依賴其代謝產(chǎn)物(比如短鏈脂肪酸)作用于宿主細胞,從而激活相關(guān)分子通路發(fā)揮調(diào)節(jié)宿主代謝或免疫功能作用[4-5],且增殖雙歧桿菌和乳酸桿菌一直以來都作為判斷是否為益生元的標準[6],不同的益生元往往被認為具有相同或相似的功能。因此,目前實際應(yīng)用中益生元往往被當作類似物使用。然而越來越多的研究表明益生元除了通過腸道菌群間接發(fā)揮作用以外,還可以直接作用于宿主細胞發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥和增強免疫作用[7-8]。雖然不同益生元通過腸道菌群發(fā)揮的功效具有一定的相似性,其直接作用于宿主細胞發(fā)揮的功效是否也類似目前所知甚少。另外,很多應(yīng)用實例表明:在應(yīng)用這些益生元預(yù)防或干預(yù)某些疾病時,并不是所有的益生元都有很好的效果,同一種益生元也不是對所有人群有效,暗示不同的益生元可能有不同的功效,適合應(yīng)用的特征人群也可能不同。為此,益生元精準化應(yīng)用的概念應(yīng)運而生,即通過深入研究不同益生元的生理作用機制,針對不同人群或個體的菌群、疾病狀態(tài)、代謝、營養(yǎng)特征和需求,以獨立或協(xié)同作用的方式,實現(xiàn)益生元在健康產(chǎn)品、生物醫(yī)藥研發(fā)、醫(yī)療服務(wù)上的精準化定制和科學配方[9]。為了實現(xiàn)益生元的精準化,就必須從細胞生物學及分子生物學的層面研究清楚各種益生元的生理功能及機制。
由于益生元進入人體腸道之后能夠直接作用于人體的腸上皮細胞和樹突狀細胞[10],且小鼠及臨床上的數(shù)據(jù)表明某些益生元對于腸道屏障功能紊亂及炎癥性腸病有較好地緩解作用[11-13]。而腸上皮細胞在致病菌刺激下的炎癥響應(yīng)及樹突狀細胞的成熟與炎癥性腸病的發(fā)展息息相關(guān)[14],因此,本研究將探討目前市場上可售的6種益生元[蔗果三糖(1-kestose,GF2)、2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL)、低聚果糖(fructooligosaccharides,F(xiàn)OS)、低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)、低聚甘露糖(mannooligosaccharides,MOS)及菊粉(Inulin)]對于由出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)引起的人腸上皮細胞炎癥響應(yīng)及人樹突狀細胞成熟的影響,旨在為益生元的精準化應(yīng)用提供指導方向及數(shù)據(jù)依據(jù)。
人腸上皮HCT- 8細胞系(產(chǎn)品編號CCL- 244)、EHEC(enterohemorrhagicE.coli,菌株O157:H7,產(chǎn)品編號ATCC43894),美國ATCC細胞庫;胎牛血清(產(chǎn)品編號16000044),美國Gibco公司;RPMI- 1640培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號PM150110),武漢Procell公司;GF2(質(zhì)量分數(shù)≥85%)、2′-FL(質(zhì)量分數(shù)≥90%)、FOS(質(zhì)量分數(shù)≥95%)及GOS(質(zhì)量分數(shù)≥90%),江門量子高科(廣東)生物有限公司;MOS(低聚甘露糖,質(zhì)量分數(shù)≥90%),恩施天天佳生物科技有限公司;Inulin(菊粉,質(zhì)量分數(shù)≥92%),比利時Beneo- Orafti公司。
phospho- NF- κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb(產(chǎn)品編號3033)、NF- κB p65 (L8F6) Mouse mAb(產(chǎn)品編號6956)、I- κB- α(L35A5) Mouse mAb(產(chǎn)品編號4814)、GAPDH(14C10) Antibody(產(chǎn)品編號2118),美國Cell Signalling Technologies公司;Pacific BlueTManti-human CD11b Antibody(產(chǎn)品編號101224)及APC anti-human CD83 Antibody(產(chǎn)品編號305312),美國BioLegend公司;免疫印跡所用二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(產(chǎn)品編號G- 21040)及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(產(chǎn)品編號G- 21234),美國Thermo Fisher公司;BeyoECL Plus化學發(fā)光試劑盒(產(chǎn)品編號P0018S),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Trizol試劑(產(chǎn)品編號15596- 026)、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(產(chǎn)品編號KR118)、Talent熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)(產(chǎn)品編號FP209),北京天根生化科技有限公司;淋巴細胞分離液Lymphoprep(產(chǎn)品編號AS1114547),挪威Axis- shield公司;細胞因子GM- CSF(產(chǎn)品編號300- 03- 5)和IL- 4(產(chǎn)品編號200- 04- 20),美國PeproTech公司。
Cytoflex型流式細胞儀,美國Beckman公司;GeneQuant100型分光光度計,英國Biochrom公司;Cytation imaging reader型酶標儀,美國BioTek公司;Roter Gene- Q型熒光定量PCR儀,德國Qiagen公司;ChemiScope6000EXPTouch型化學發(fā)光成像系統(tǒng),上海勤翔科學儀器有限公司。
30名獻血志愿者,平均年齡38.47±1.60歲,男女比例5∶1,所有志愿者都簽署了知情同意書。
1.4.1免疫印跡法
配置質(zhì)量分數(shù)為10%的SDS- PAGE膠,15孔1.5 mm上樣梳。每孔上樣10 μL樣品,100 V電泳分離樣品中蛋白質(zhì),之后通過轉(zhuǎn)膜儀將分離開的蛋白質(zhì)印跡至0.2 μm孔徑硝酸纖維素膜上。膜經(jīng)過質(zhì)量分數(shù)5%的脫脂奶粉水溶液封閉1 h之后,分別與phospho- NF- κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb、NF- κB p65 (L8F6) Mouse mAb、I- κB- α (L35A5) Mouse mAb、GAPDH(14C10) Antibody在4 ℃孵育過夜,之后用TBST buffer洗滌3次,每次10 min。再與相應(yīng)的二抗在室溫孵育1 h。膜經(jīng)TBST buffer洗滌3次,每次10 min之后,通過BeyoECL Plus化學發(fā)光試劑盒顯色,其顯色圖像用化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集。
1.4.2實時熒光定量PCR法
HCT- 8細胞以30%~40%愈合度接種于6孔板中,總共8孔,其中6孔分別加入終質(zhì)量濃度10 mg/mL的不同益生元,待細胞培養(yǎng)48 h之后,加入感染復數(shù)MOI=100的EHEC(在加入前一天用LB培養(yǎng)基37 ℃搖菌培養(yǎng)過夜,之后用分光光度計測量OD595 nm,按1 OD=1×108個/mL計算細菌濃度)刺激3 h,收取細胞,離心去除培養(yǎng)基,用400 μL Trizol試劑重懸溶解。室溫放置10 min之后,加入等體積三氯甲烷混勻,12 000 r/min離心取上層水相,加入150 μL異丙醇混勻,12 000 r/min離心,棄上清液,沉淀用體積分數(shù)75%乙醇清洗一遍,再用20 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液溶解得總RNA(含總mRNA)。取4 μL總RNA與FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑配制成對應(yīng)體系,42 ℃孵育15 min,95 ℃滅活3 min得cDNA。用Talent熒光定量檢測試劑盒及對應(yīng)引物在Roter Gene- Q熒光定量PCR儀上檢測各實驗組樣品cDNA中TNF- α、IL- 6及GAPDH的擴增曲線。根據(jù)擴增曲線用Roter Gene- Q series software分析得到各曲線的循環(huán)數(shù)閾值(cycle threshold,ct)。以GAPDH為對照計算各組cDNA中的TNF- α及IL- 6的Δct,再以培養(yǎng)基對照組的TNF- α及IL- 6的Δct為基準計算實驗組TNF- α及IL- 6的ΔΔct,最終各實驗組的TNF- α及IL- 6的相對mRNA的轉(zhuǎn)錄水平則由式(1)計算得到。
相對mRNA表達量=2-ΔΔct。
(1)
1.4.3益生元對HCT- 8細胞活性影響的測定
HCT- 8細胞以每孔2 000個的密度接種到96孔板中,同時分別加入對照培養(yǎng)基(NC組)或終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的不同益生元(GF2組、2′-FL組、FOS組、GOS組、MOS 組和Inulin組),每組6個平行實驗孔。48 h之后加入MTT溶液至終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。加入100 μL甲臜(formazan)溶解液,待紫色結(jié)晶全部溶解用酶標儀測定OD570 nm作為細胞活性指標。最終各實驗組的相對細胞活性值為各實驗組與NC組的OD570 nm比值。
1.4.4EHEC誘導HCT- 8細胞炎癥響應(yīng)時間的測定
HCT- 8細胞以30%~40%愈合度接種于24孔板中,細胞培養(yǎng)48 h之后,加入感染復數(shù)MOI=100的EHEC刺激,之后分別在刺激的0、20、40、60、80、100 min時吸去培養(yǎng)基,并迅速加入1倍濃度的 sample loading buffer刮取細胞,細胞裂解液在100 ℃加熱10 min充分變性。最后通過免疫印跡法分析得到細胞裂解液中各蛋白的相對蛋白表達水平。
1.4.5益生元對HCT- 8細胞炎癥響應(yīng)影響的測定
HCT- 8細胞以30%~40%愈合度接種于24孔板的14個孔中,分為7組,分別加入對照培養(yǎng)基或終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的不同益生元,待細胞培養(yǎng)48 h后,加入感染復數(shù)MOI=100的EHEC刺激,之后每組的兩個孔分別在刺激的0 min和 40 min 時收取細胞裂解液樣品。最后通過免疫印跡法分析得到細胞裂解液中各蛋白的相對蛋白表達水平。
1.4.6樹突狀細胞的分離
無菌抽取人外周血,用PBS等體積稀釋后,用淋巴細胞分離液按說明書步驟分離單個核細胞。用質(zhì)量分數(shù)0.84% NH4Cl水溶液裂解紅細胞10 min,離心,PBS清洗一遍后,細胞計數(shù)。調(diào)整細胞濃度至1×107個/mL后,以每孔1 mL的量加入24孔平底細胞培養(yǎng)板37 ℃貼壁2 h,去除貼壁的單個核細胞,剩余細胞按2×106~5×106個/mL濃度每孔100 μL接種到96孔平底細胞培養(yǎng)板。
1.4.7益生元對樹突狀細胞成熟影響的測定
加入新鮮配制的含有GM- CSF和IL- 4的細胞因子溶液至終質(zhì)量溶度為0.1 ng/mL,同時分別加入對照培養(yǎng)基或終質(zhì)量濃度為5 mg/mL的不同益生元處理,細胞繼續(xù)在37 ℃體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。第3天進行半量換液,繼續(xù)培養(yǎng)至第6天,收取樹突狀細胞。離心棄上清,每個96孔板的孔所有細胞用100 μL 1倍濃度的PBS重懸,加入1 μL Pacific BlueTManti-human CD11b Antibody及1 μL APC anti-human CD83 Antibody。混勻后于室溫避光孵育15 min。300 g離心5 min,棄上清。用200 μL 1倍濃度的PBS重懸,并用流式細胞儀檢測表面表型并分析。
Western blot產(chǎn)生的灰度圖用ImageJ進行灰度定量,所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5軟件雙邊配對t檢驗進行統(tǒng)計分析,*代表P<0.05;**代表P<0.01;***代表P<0.001;****代表P<0.000 1。
在比較不同益生元的功效之前,需要確定一個使用濃度。由于母乳中低聚糖的總質(zhì)量濃度大約為10 mg/mL[15],因此本研究選用同一濃度10 mg/mL的不同益生元去處理腸上皮細胞,來比較不同益生元對于腸上皮細胞炎癥的影響。在此之前,檢測了該質(zhì)量濃度下各益生元對于細胞活性的影響,以確保接下來的實驗結(jié)果存在生理學上的意義。分別用不同益生元處理HCT- 8細胞48 h,然后通過MTT實驗檢測不同組細胞的相對活性,見圖1。
圖1 6種益生元對于HCT- 8細胞活性的影響Fig.1 Effect of 6 kinds of prebiotics on cell viability of HCT- 8 cells
由圖1可知,10 mg/mL的6種益生元都不影響HCT- 8細胞的活性。
為了比較不同益生元對于細胞炎癥的影響,本研究首先利用EHEC刺激HCT- 8細胞以建立細胞炎癥模型,并檢測炎癥激活的響應(yīng)時間曲線。HCT- 8細胞用EHEC刺激后,在不同的時間點收取細胞裂解液,免疫印跡檢測裂解液中炎癥信號通路中關(guān)鍵蛋白NF- κB p65的磷酸化情況,見圖2。
圖2 EHEC誘導的HCT- 8細胞中NF- κB炎癥信號通路激活時間曲線Fig.2 Time-course of EHEC-induced activation of NF- κB inflammatory signal pathway in HCT- 8 cells
由圖2可知,HCT- 8細胞在受到EHEC刺激后,NF- κB信號通路被激活,NF- κB p65蛋白的磷酸化水平(phospho-p65)迅速升高,在40 min左右達到峰值,之后出現(xiàn)下降,再升高。這與前期文獻報道的脂多糖LPS刺激下NF- κB信號通路激活曲線類似[16]。另外,本研究的結(jié)果顯示磷酸化的p65占總p65的比例也出現(xiàn)了同樣的變化趨勢。因此接下來本研究選取EHEC刺激40 min時的NF- κB信號通路激活水平來比較不同益生元對于EHEC誘導的NF- κB激活的影響。
用10 mg/mL質(zhì)量濃度的不同益生元預(yù)處理HCT- 8細胞48 h,再用EHEC刺激產(chǎn)生細胞炎癥,在刺激后的40 min收取細胞裂解液,分析其中NF- κB p65的磷酸化情況,結(jié)果見圖3。
*,**,***分別代表P<0.05,P<0.01及P<0.001。圖3 6種益生元對于EHEC誘導的HCT- 8細胞NF- κB炎癥信號通路激活的影響Fig.3 Effect of 6 kinds of prebiotics on EHEC-induced activation of NF- κB inflammatory signal pathway in HCT- 8 cells
由圖3可知,EHEC刺激40 min時,無論對照組(NC)還是益生元處理組,磷酸化的p65(phospho-p65)的量及磷酸化的p65占總p65的比例(phospho-p65/p65)相比EHEC刺激前(0 min)都出現(xiàn)顯著的增加。但EHEC刺激40 min后,對照組與不同益生元處理組的p65的磷酸化水平及磷酸化的p65占總p65的比例存在明顯的差異。與不加益生元處理的對照組相比較,加2′-FL或GOS的處理組p65的磷酸化水平及磷酸化的p65占總p65的比例明顯偏低,且統(tǒng)計學上存在顯著性差異,說明2′-FL或GOS處理顯著降低EHEC誘導的NF- κB p65的磷酸化激活,即炎癥響應(yīng)。相同處理情況下,檢測NF- κB下游效應(yīng)因子TNF-α及IL- 6的mRNA表達水平,結(jié)果也與NF- κB本身激活水平類似[見圖3(d)和圖3(e)]。GF2處理組的p65的磷酸化水平及磷酸化的p65占總p65的比例的平均值也比對照組低,且3次獨立實驗的每一次結(jié)果(未顯示)也都比對照組低。只不過由于3次實驗之間的誤差相對較大,3次重復實驗不足以顯示統(tǒng)計學顯著性差異。另外,GF2處理組其下游效應(yīng)子TNF-α的mRNA表達水平也顯著低于對照組,因此可以說GF2處理也降低EHEC誘導的腸上皮細胞炎癥響應(yīng)。而FOS及MOS處理組則對于抑制EHEC引起的炎癥響應(yīng)并無一致性效果。
為了測試不同聚糖類益生元對于人源樹突狀細胞成熟的影響,本研究首先從志愿者的周環(huán)血中分離得到未成熟單核樹突狀細胞,并在體外培養(yǎng)及誘導成熟分化的過程中加入不同的益生元,觀察其成熟情況。CD83分子與其配體的結(jié)合是樹突狀細胞實現(xiàn)抗原呈遞功能的基礎(chǔ),而樹突狀細胞成熟的最典型變化就是抗原呈遞能力的增強,因此CD83分子很早就被公認為成熟樹突狀細胞的標志物[17]。而最近的文獻又表明:CD11b分子通過與整合素分子的相互作用參與細胞遷移過程,在炎癥因子刺激的情況下,CD11b從細胞表面內(nèi)在化轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi),從而促進樹突狀細胞往淋巴結(jié)遷移[18]。因此,本研究通過流式細胞術(shù)分析樹突狀細胞表面CD11b及CD83分子的水平來監(jiān)測樹突狀細胞的成熟情況,結(jié)果見圖4。
由圖4可知,圖4(a)多邊形框中為成熟的樹突狀細胞,相對于未成熟細胞其CD11b表達下降,CD83表達上升。紅色字體表示成熟的樹突狀細胞占總樹突狀細胞的比例。本研究將益生元處理組的成熟比例除以對照組的成熟比例,得到益生元處理帶來的成熟比例變化倍數(shù),然后取對數(shù)之后統(tǒng)計分析30個志愿者收集到的數(shù)據(jù),結(jié)果顯示2′-FL(上升次數(shù)比例22/30)及Inulin(上升次數(shù)比例19/30)處理顯著增加樹突狀細胞的成熟比例,而GOS(下降次數(shù)比例22/30)顯著降低樹突狀細胞的成熟比例。GF2(上升次數(shù)比例8/14)及MOS(上升次數(shù)比例18/30)處理也促進樹突狀細胞成熟,但統(tǒng)計未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。FOS(上升次數(shù)比例14/30)處理則對于樹突狀細胞成熟沒有一致性影響。
免疫調(diào)節(jié)是益生元應(yīng)用的重要方向,而應(yīng)用益生元輔助治療炎癥性腸病則是免疫調(diào)節(jié)方向的一個典型運用[19]。腸上皮細胞在炎癥因子刺激下的過度炎癥響應(yīng)是造成炎癥性腸病的關(guān)鍵因素[14]。之前有研究報道指出2′-FL可以明顯地降低脂多糖LPS引起的HCT- 8腸上皮細胞炎癥響應(yīng)[8],且其他多項已經(jīng)報道的工作也提出2′-FL可以抑制TLR4/NF- κB炎癥信號通路[11-12, 20-21]??紤]到LPS被認為是EHEC上刺激細胞炎癥響應(yīng)的主要因子之一[22],本研究結(jié)果與之前報道相符。另外,本研究還發(fā)現(xiàn)GOS以及GF2也可以直接抑制EHEC引起的腸上皮細胞炎癥響應(yīng),目前還沒有相關(guān)的文獻報道類似結(jié)果。FOS中含有很大比例的GF2(約50%),但卻沒有發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用,可能是FOS中其他非GF2組分不具有抑制炎癥效果或者反而干擾GF2的抑制炎癥效果,暗示益生元組分的純度可能對于其發(fā)揮功能至關(guān)重要。
樹突狀細胞的成熟可以顯著的增強樹突狀細胞的抗原呈遞能力,因此對于機體盡快啟動特異性免疫清除外源炎癥刺激因子起到很重要的作用[23]。之前有文獻提出2′-FL處理并不能直接影響人樹突狀細胞成熟[24],但本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)2′-FL處理可以顯著促進樹突狀細胞的成熟。這其中的差異可能是由于文獻中處理細胞時使用的2′-FL濃度不夠,本研究使用的質(zhì)量濃度(5 mg/mL)要高于文獻所用質(zhì)量濃度(0.5 mg/mL),這也提示了益生元使用劑量的重要性。之前有文獻表明2′-FL可以直接結(jié)合樹突狀細胞表面受體蛋白DC- SIGN(dendritic cell-specific intracellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin)[25],而DC- SIGN受體可以通過激活細胞內(nèi)ERK1/2-NF- κB等信號通路促進樹突狀細胞成熟及細胞因子分泌[26],2′-FL是否通過與DC- SIGN結(jié)合從而激活NF- κB信號通路促進樹突狀細胞成熟還需要實驗驗證。另外,本研究的研究發(fā)現(xiàn)Inulin雖然對于EHEC引起的腸上皮細胞炎癥沒有明顯的調(diào)節(jié)作用,但卻可以顯著地促進樹突狀細胞的成熟。GOS可以明顯地抑制EHEC引起的腸上皮細胞炎癥,但同時也會抑制樹突狀細胞的成熟。FOS雖然含有大比例的GF2,但似乎FOS中除了GF2以外的其他組分發(fā)揮著與GF2相反的效果,導致FOS總體上對于腸上皮細胞炎癥及樹突狀細胞成熟都無明顯效果,提示提升FOS中GF2含量的必要性。雖然GOS、Inulin及GF2都能影響樹突狀細胞的成熟,但具體分子機制如何還需進一步研究。據(jù)筆者所知,目前還沒有與它們結(jié)合的受體及它們直接調(diào)節(jié)樹突狀細胞的相關(guān)報道,可能是由于糖類化合物的相互作用蛋白不容易鑒定。不過隨著相關(guān)糖蛋白組學技術(shù)[27-29]的發(fā)展,相信未來各種糖類益生元的直接細胞生物學功能機制也將逐漸被揭露出來??偟膩碚f,本研究的結(jié)果說明不同的益生元其對宿主的生理作用都具有其特異性,還有很多種的益生元以及更多相關(guān)的生物學功能有待被研究,這樣的研究將有助于了解清楚不同益生元細致的作用機制,促進益生元的精準化應(yīng)用。