趙 軍 劉 巖 李 昕 董重陽 田廣芳 王雄耀 師建平常 虹 高小明 莫日根 王振華

(1.內蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內科,內蒙古 呼和浩特 010020; 2.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中醫(yī)科,內蒙古 呼和浩特 010050; 3.內蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院,內蒙古 呼和浩特 010110; 4甘肅省中醫(yī)院痹癥科,甘肅 蘭州 735000)

骨質疏松(Osteoporosis，OP)屬蒙醫(yī)經典文獻“骨枯癥”范疇。受“腎主骨生髓，髓養(yǎng)骨；腎虛骨枯髓減”等古醫(yī)籍闡發(fā)，蒙醫(yī)認為OP根本病因為腎虛。絕經后骨質疏松癥(PMOP)因女性絕經后卵巢功能衰退所致，屬高轉換型OP。19世紀蒙醫(yī)著作經典《觀者之喜》記載：“老年人赫依偏盛，易骨枯，治以補為主，補暖補精，而抑赫依過剩……”[1，2]。蒙藥藍刺頭性涼，味苦，效輕、稀、柔、鈍，可接骨愈傷、固骨質[3]。本實驗觀察了蒙藥藍刺頭對去卵巢OP大鼠右側股骨骨密度(BMD)、左側股骨過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)mRNA調節(jié)作用、骨髓充質干細胞(MSCs)源性的脂肪細胞形態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥品、試劑 蒙藥藍刺頭制劑由廣州中醫(yī)藥大學科技產業(yè)園提供。強骨膠囊：北京岐黃制藥有限公司，規(guī)格：0.25 g/粒，30粒/瓶，產品批號：188103，國藥準字Z20030007。己烯雌酚片：合肥久聯(lián)制藥有限公司，規(guī)格：0.5 mg/片，產品批號：20180925，國藥準字H34021250。RT-PCR檢測主要試劑：TRizol(Invitrogen)，氯仿(Amresco)，無RNase水(康為試劑)，Reverse Transcriptase(Promega)，RNase inhibitor(Promega)，SYBR Mix(康為試劑)；HE染液；5%堿性美藍溶液；PBS緩沖液。

1.1.2 實驗動物 4月齡Wistar大鼠雌性84只，購于內蒙古大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(蒙)2002—0001。內蒙古醫(yī)科大學基礎實驗樓病理實驗室飼養(yǎng)，每籠12只，購回適應性喂養(yǎng)7 d左右。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、模型制備 將84只大鼠隨機平均分7組[藍刺頭高劑量組、中、低劑量組及強骨膠囊組、己烯雌酚組、模型組、假手術組(以下分別簡稱高組、中組、低組、強組、己組、模組、假組)]。參考文獻[4]行PMOP模型復制，假組不切卵巢只切卵巢周圍少量脂肪，縫合創(chuàng)口后5 d，將大鼠陰道脫落細胞涂片確定造模成功(見圖1、圖2)，30 d后任意選取2只行子宮HE染色觀察(見圖3、圖4)。

圖1 雌鼠光鏡下動情期陰道涂片(400×)

圖2 雌鼠光鏡下動情間期陰道涂片(400×)

圖3 光鏡下雌鼠假手術組子宮HE染色(400×)

圖4 光鏡下雌鼠模型組子宮HE染色(400×)

1.2.2 藥物干預、標本采集 90 d后行藥物干預灌胃給藥。低組、中組、高組據(jù)人鼠體質量比、人鼠代謝速率比折算以6.875 mg/mL、13.750 mg/mL、27.500 mg/mL給藥，臨床等效劑量以低組為準，高組、中組、低組劑量比例為4∶2∶1。己烯雌酚0.0313 mg/mL，強骨膠囊23.438 mg/mL，均按有效成人量給藥；生理鹽水體積相應對假組、模組灌胃。終每組按9只計。采血離心；剖取雙側股骨，采用4%多聚甲醛固定。

1.2.3 骨密度儀右側股骨BMD計量學指標分析 骨密度儀離體骨BMD測定。

1.2.4 采用RT-PCR法測定PPARγmRNA表達 按RT-PCR檢測試劑盒說明書步驟測定左側股骨PPARγ mRNA表達。

1.2.5HE染色方法檢測右側股骨頭骨髓脂肪細胞截面面積、數(shù)量 (1)大鼠股骨脫鈣、蠟塊制備[5]：4%多聚甲醛將大鼠右側股骨固定10 d，EDTA脫鈣液配制 ，在 1000 mL 的燒杯中加入 186 g EDTA-2Na·2H2O，189.4 g Na2HPO4、10.6 g NaH2PO4，加水約700 mL，將燒杯放置于加熱攪拌器上并通電，NaOH 20 g再入，攪拌加熱至 65 ℃，透明澄清液體顏色，測定調節(jié)溶液pH值為8.0，總量1000 mL定容。錐形瓶中移入大鼠右側股骨，脫鈣液EDTA加入，液/骨體積比約4∶1，換液定時每2 d一次，25 ℃左右室溫，脫鈣連續(xù)20 d，針尖刺入股骨，暢通無阻則完全脫鈣。蠟塊制備，常規(guī)行免疫組化染色觀察。(2)左側股骨骨髓HE染色：梯度酒精脫水HE染色觀察。每組大鼠取5張切片(n0)，每張切片隨機選5個視野(n1)，光學顯微鏡觀察各組染色情況，采用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，光鏡下骨髓脂肪細胞體積、數(shù)量定量(n2、n3)。

2 結果

2.1 骨密度計量變化 顯微CT掃描大鼠右側股骨近心端，測BMD示：模組與假組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；中組、低組、假組、強組、己組與模組比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；高組與模組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；低組、中組、己組、強組、假組與高組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中組、低組、強組、己組、假組之間比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 去卵巢骨質疏松模型大鼠骨密度計量結果比較

表1 去卵巢骨質疏松模型大鼠骨密度計量結果比較

組別鼠數(shù)BMD藍刺頭高劑量組120.197±0.017△藍刺頭中劑量組120.320±0.034*藍刺頭低劑量組120.315±0.028*強骨膠囊組120.313±0.027*己烯雌酚組120.390±0.013*模型組120.190±0.017假手術組120.425±0.019*

注：與假手術組比，△P<0.05；與模型組比，*P<0.01。

2.2RT-PCR測定左側股骨頭目標基因表達 測骨組織PPAR-γ2目標基因表達示：(1)與假組比，模組大鼠骨PPAR-γ2明顯升高(P<0.05)。(2)與模組比，高組、中組、低組、強組、己組、假組PPAR-γ2明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(3)與己組比，高組、低組骨PPAR-γ2表達降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；藍刺頭中劑量組骨PPAR-γ2表達與其比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(4)與強組比，高組、低組骨PPAR-γ2表達較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中組與強組比較，PPAR-γ2表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 蒙藥藍刺頭對去卵巢骨質疏松模型大鼠骨PPAR-γ2表達的影響

2.3 各組大鼠右側離體股骨頭骨髓脂肪細胞截面面積、數(shù)量 右側股骨頭HE染色，觀察MSCs源性的脂肪細胞形態(tài)變化，骨髓脂肪細胞體積、數(shù)量比較，模組與假組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中組、低組、假組、強組、己組與模組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高組與模組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；低組、中組、己組、強組、假組與高組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中組、低組、強組、己組、假組之間比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3、圖5。

表3 各組大鼠右側離體股骨頭骨髓脂肪截面面積、數(shù)量比較

圖a：高組；圖b：中組；圖c：低組；圖d：強組；圖e：己組；圖f：模組；圖g：假組圖5 各組大鼠右側離體股骨頭骨髓脂肪細胞體積、數(shù)量(400×)

3 討論

OP骨微結構改變，全身骨量減少，骨脆性增加，骨折易發(fā)。OP包括原發(fā)、繼發(fā)，原發(fā)最常見，多發(fā)生于絕經后中老年婦女，全身老年性改變在骨骼系統(tǒng)反映[5]。PPARs是核激素受體家族中受配體激活核內轉錄因子，歸屬于類固醇、甲狀腺、維甲酸受體超家族。據(jù)蛋白結構、功能不同，PPARs可分為PPARa、PPARβ/δ和PPARγ3個亞型；據(jù)啟動子結構和mRNA拼接方式的不同，PPARγ基因可分為為PPARγ1、PPARγ2、PPARγ3、PPARγ4 4種類型。PPARγ 是 PPARs 家族中最具有脂肪專一性的一員，它在脂肪組織和脂肪細胞系中表達水平最高[6,7]。骨髓間充質干細胞成脂分化、成骨分化是骨形成重要過程。去除卵巢后大鼠骨髓組織內可見有脂肪細胞增多，脂肪細胞體積較大，數(shù)量較多，密度有所增大，一定數(shù)量的脂肪細胞聚集在一起，之間相互擠壓，呈圓形或多邊形。本實驗觀察蒙藥藍刺頭干預后，模組、高組、中組、低組、己組、強組股骨PPARγ表達差異，進一步分析藥物干預下骨成骨、成脂分化能力，以明確其作用機制。實驗表明蒙藥藍刺頭在適當劑量可抑制去卵巢大鼠骨組織PPARγ表達，抑制骨髓脂肪細胞體積、數(shù)量，提高BMD，起一定抗骨破壞、保護骨作用。

綜上，大鼠在去卵巢以后骨組織PPARγ表達增高，骨髓脂肪細胞體積、數(shù)量增高，BMD明顯降低；蒙藥藍刺頭可抑制骨組織PPARγ表達，抑制骨髓脂肪細胞體積、數(shù)量，效果同己烯雌酚、強骨膠囊相似，起有效抗骨破壞、保護骨作用，為蒙醫(yī)“補暖補精-清鎮(zhèn)赫依-固骨質壯骨”理論防治PMOP提供實驗依據(jù)。