崔 妮，衛(wèi)向鋒△，張 紅，孫婷婷，陳 霄，杜曉剛

（1.西安中醫(yī)腦病醫(yī)院，陜西 西安 710032；2.陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，陜西 西安 710031）

牛麝開(kāi)竅散是西安中醫(yī)腦病醫(yī)院的院內(nèi)中藥復(fù)方制劑，由人工牛黃、人工麝香、冰片、當(dāng)歸、黃芪、石菖蒲、桃仁、郁金、肉桂、甘草等中藥組方。為了有效控制其質(zhì)量，確保臨床療效，本研究中建立了定性鑒別牛麝開(kāi)竅散中當(dāng)歸、黃芪、人工牛黃、石菖蒲的薄層色譜（TLC）法［1］，以及測(cè)定人工牛黃中主要有效成分膽酸含量的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLCELSD）法，為其質(zhì)量控制提供客觀(guān)的定性定量分析方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UP3200H型超聲波清洗機(jī)（熊貓集團(tuán)南京電子計(jì)量有限公司）；JM-B20001型電子天平（余姚市紀(jì)銘稱(chēng)重校驗(yàn)設(shè)備有限公司，精度為0.1 g）；SQP型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器<北京>有限公司，稱(chēng)量范圍1 mg至120 g、10 mg至220 g）；Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），配有1260LC工作站；Alltech3300型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（上海宸喬生物科技有限公司）；硅膠G（青島海洋化工有限公司，批號(hào)為02101029）。

1.2 試藥

膽酸對(duì)照品（批號(hào)為078-9312，供含量測(cè)定用），黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)為110781-200613），石菖蒲對(duì)照藥材（批號(hào)為121098-201406），當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)為120927-201315），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純；牛麝開(kāi)竅散（西安中醫(yī)腦病醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào)分別為20200401，20200402，20200403）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

黃芪：取樣品9 g，置錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理40 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，依次提取50，30，30 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺黃芪的陰性對(duì)照品溶液；取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種溶液各15 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）在10℃下放置的下層液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液顯色，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰［2］。供試品溶液色譜中，與對(duì)照品溶液色譜有相應(yīng)斑點(diǎn)出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 A。

當(dāng)歸：取樣品7 g，置錐形瓶中，加乙醚30 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺當(dāng)歸的陰性對(duì)照品溶液；取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g，加乙醚20 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。分別吸取上述3種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1，V/V）為展開(kāi)劑，置紫外光燈（365 nm）下檢視［3］。供試品溶液色譜中，與對(duì)照藥材溶液色譜有相應(yīng)斑點(diǎn)出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 B。

人工牛黃：取樣品9 g，置錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺人工牛黃的陰性對(duì)照品溶液；取膽酸對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯-醋酸（36%乙酸）-甲醇（20∶25∶2∶3，V/V/V/V）的上層液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液顯色，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視［4］。供試品溶液色譜中，與對(duì)照品溶液色譜有相應(yīng)斑點(diǎn)出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 C。

石菖蒲：取樣品2 g，置錐形瓶中，加石油醚（60～90℃）20 mL，超聲處理40 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)邮兔眩?0～90℃）1 mL使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺石菖蒲的陰性對(duì)照品溶液；取石菖蒲對(duì)照藥材0.2 g，加石油醚（60～90℃）20 mL，超聲處理40 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加石油醚（60～90℃）1 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。分別吸取上述3種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4∶1，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視［5］。供試品溶液色譜中，與對(duì)照藥材溶液色譜有相應(yīng)斑點(diǎn)出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 D。

圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Reference solution 5.Reference solution of medicinal materials 6.Negative reference solutionA.Astragali Radix B.Angelicae Sinensis Radix C.Bovis Calculus Artifactus D.Acori Tatarinowii RhizomaFig.1 TLC chromatograms

2.2 膽酸含量測(cè)定［6］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（1～10 min時(shí)15%A～32%A，10～20 min時(shí)32%A～50%A，20～28 min時(shí)50%A～68%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)器：ELSD。

2.2.2 溶液制備

取膽酸對(duì)照品7.25 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.145 mg/mL的對(duì)照品溶液。取樣品17.6 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，用溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例及制備工藝制備缺人工牛黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下3種溶液各適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.Cholic acidA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線(xiàn)性關(guān)系考察：取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣6，8，10，12，14 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄相應(yīng)峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、色譜峰面積（Y）的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y=1.6048X+2.5502，r=0.9998（n=5）。結(jié)果表明，膽酸進(jìn)樣量在0.87～2.03 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果的RSD為0.27%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20200401）17.6 g，精密稱(chēng)定，共6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果膽酸平均含量為0.5083 mg/g，RSD為1.04%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20200401）17.6 g，精密稱(chēng)定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為0.64%（n=7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密稱(chēng)定6份已知含量的樣品（批號(hào)為20200401），置100 mL容量瓶中，分別精密加入膽酸對(duì)照品4.40 mg，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3批（批號(hào)分別為20200401，20200402，20200403）樣品各適量，精密稱(chēng)定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批樣品中膽酸含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab.2 Results of content determination of cholic acid in the three batches of samples（mg/g）

3 討論

神昏病屬于一種特殊的意識(shí)障礙，是由于各種原因造成腦嚴(yán)重?fù)p害后出現(xiàn)的一種沒(méi)有感知的覺(jué)醒狀態(tài)。中醫(yī)學(xué)的“神昏”常表現(xiàn)為神昏、昏厥、昏蒙、昏迷、不省人事及外感熱病、痰證、中風(fēng)、脫證等，多繼發(fā)癡呆、中風(fēng)、外感熱病、毒邪犯腦、腦外傷等病［7］。牛麝開(kāi)竅散組方是在李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》所創(chuàng)造的當(dāng)歸補(bǔ)血湯基礎(chǔ)上，合用人工牛黃、人工麝香等醒神開(kāi)竅之品形成的協(xié)定方。該制劑從中醫(yī)對(duì)神昏?。ǔ掷m(xù)植物狀態(tài)）的病機(jī)痰、瘀為標(biāo)，氣血虛為本，本虛標(biāo)實(shí)證出發(fā)立法，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、活血化瘀、豁痰化濁、醒神開(kāi)竅、明蒙啟閉之功效，用于治療因氣血逆亂產(chǎn)生痰、瘀、氣虛、血虛導(dǎo)致腦絡(luò)不通、腦竅失養(yǎng)、神明蒙蔽的長(zhǎng)期神昏竅閉。

牛麝開(kāi)竅散中含貴重藥材人工牛黃、人工麝香，根據(jù)《陜西省醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑備案管理實(shí)施細(xì)則（試行）》［8］要求，貴重中藥應(yīng)建立含量測(cè)定方法。人工牛黃由膽酸、豬去氧膽酸、牛膽粉、?；撬?、膽固醇、膽紅素等加工制成。本研究預(yù)試驗(yàn)中欲將膽酸、豬去氧膽酸作為人工牛黃藥材的含量測(cè)定指標(biāo)［9］，結(jié)果測(cè)定豬去氧膽酸含量時(shí)有干擾，故最終僅以膽酸作為人工牛黃的含量測(cè)定指標(biāo)。牛麝開(kāi)竅散1 kg處方中含人工麝香0.55 g。參考文獻(xiàn)［10］，本研究中采用氣相色譜（GC）法對(duì)該處方人工麝香中指標(biāo)性成分麝香酮進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該處方中麝香酮平均含量為0.003%（低于0.01%）。根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典（一部）》中制劑指標(biāo)性成分含量測(cè)定及院內(nèi)制劑研發(fā)質(zhì)控指標(biāo)的選擇慣例，當(dāng)制劑處方中中藥化學(xué)成分含量低于0.01%時(shí)，一般不能作為制劑的含量測(cè)定指標(biāo)，故未將麝香酮納入該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本研究中對(duì)牛麝開(kāi)竅散中的當(dāng)歸、黃芪、人工牛黃、石菖蒲藥材進(jìn)行了TLC鑒別，結(jié)果重復(fù)性好、陰性對(duì)照無(wú)干擾。此外，建立了測(cè)定膽酸含量的HPLC法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單可行、結(jié)果準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于牛麝開(kāi)竅散的質(zhì)量控制。