華金仁，程慧明，嚴菁，曾丹，潘玫

(江西省婦幼保健院，江西 南昌 330006)

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤之一。目前的治療手段主要有手術(shù)、化療、放療及靶向治療等。約有70%的子宮內(nèi)膜癌診斷時，腫瘤局限于子宮體，屬于臨床早期，預后較好。然而晚期子宮內(nèi)膜癌患者復發(fā)率高(66.7%)、預后差、生存期短，5年生存率僅為16.0%?，F(xiàn)階段，圍繞子宮內(nèi)膜癌發(fā)病分子機制展開深層次研究，從中找出個性化精準治療靶點，已成為子宮內(nèi)膜癌基礎(chǔ)性、全面性研究的重心所在[1]。報道[2]指出，長鏈非編碼RNA(LncRNA)可能參與信號通路調(diào)控機制，與microRNA(miRNA)相互作用，從而對子宮內(nèi)膜癌的生長與發(fā)展造成影響。另有研究[3]強調(diào)，核受體亞家族2組F成員2反義RNA1(NR2F2-AS1)在非小細胞肺癌、結(jié)腸癌、直腸癌及前列腺癌組織中表達上調(diào)，且與癌細胞的凋亡和增殖相關(guān)，但其在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未明了。本文經(jīng)Lnc Base預測得知，微小RNA-129-5(miR-129-5p)可能是NR2F2-AS1的靶基因。在子宮內(nèi)膜癌細胞中，miR-129-5p的表達下調(diào)。針對過表達miR-129-5p來分析，其不僅能夠有效抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，而且能抑制其遷移與侵襲，另外還可以對細胞凋亡實施相應(yīng)誘導。本研究圍繞子宮內(nèi)膜癌細胞(Ishikawa)，就miR-129-5p和LncRNA NR2F2-AS1對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及凋亡的影響進行探討。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2020年4月—2020年12月收治的經(jīng)病理學檢查確診的子宮內(nèi)膜癌患者50 例，術(shù)前均沒有進行放療和化療，年齡(43.25±5.49) 歲，子宮內(nèi)膜癌分期：Ⅳ期12 例、Ⅲ期15 例、Ⅱ期10 例、Ⅰ期13 例。

美國Gibco公司生產(chǎn)的高糖杜爾貝科改良鷹培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS)；美國ATCC公司生產(chǎn)的人子宮內(nèi)膜癌細胞株(Ishikawa)；美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)的二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶；賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)；寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-time PCR)試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑；美國BD公司生產(chǎn)的流式細胞儀和流式試劑；上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)的雙熒光素酶報告載體(NR2F2-AS1野生型和突變型)、真核表達載體(pcDNA，陰性對照)、miRNA陰性對照(miR-NC)、miR-129-5p抑制劑、miR-129-5p模擬物(miR-129-5p)、NR2F2-AS1過表達載體(pc DNA-NR2F2-AS1)、NR2F2-AS1干擾劑(si-NR2F2-AS1)；美國Santa Cruze公司生產(chǎn)的甘油醛-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)抗體、轉(zhuǎn)染p21基因(p21)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)；美國Promega公司生產(chǎn)的兔抗人單克隆(Bax)抗體和雙熒光素酶報告系統(tǒng)；美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的全自動酶標儀和Real-time PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

采用高糖DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含1%青-鏈霉素、10% FBS)進行培養(yǎng)，然后把培養(yǎng)瓶置入到二氧化碳(CO2)(5%)培養(yǎng)箱(溫度設(shè)為37 ℃)中，濕度控制在95%。當細胞生長至對數(shù)期時，進行洗滌消化，并按照1∶3傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染

收集子宮內(nèi)膜癌組織樣本轉(zhuǎn)染后的Ishikawa細胞，依據(jù)特定比例，接種在6孔板中(每孔2×105個)。需要指出的是，在細胞培養(yǎng)過程中，當融合成一層時，便可進行轉(zhuǎn)染操作。采用當前比較常用的Lipofectamine 2000，把pc DNA-NR2F2-AS1，miR-129-5p和真核表達質(zhì)粒(pc DNA)等轉(zhuǎn)染到Ishikawa細胞中，培養(yǎng)時間控制在4 h，然后向完全培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞。

1.2.3 Real-time PCR檢測RNA表達

收集子宮內(nèi)膜癌組織樣本轉(zhuǎn)染后的Ishikawa細胞，對組織樣本和細胞總RNA進行提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后將cDNA當作模板，實施Real-time PCR反應(yīng)，合成miR-129-5p和LncRNA NR2F2-AS1。反應(yīng)程序：72 ℃ 40 s，59 ℃ 40 s，94 ℃40 s，95 ℃ 5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.4 經(jīng)四唑鹽比色法準確測定細胞活性

收集已經(jīng)完成轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞，同樣依據(jù)特定比例(每孔2×103個)，圍繞96微孔板，實施逐一接種操作，完成后，均置入事先準備好的培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，分別在24 h，48 h，72 h進行MTT實驗。各孔均置入20 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)4h，棄上清，加入DMSO，每孔150μL，振蕩10 min，用酶標儀對吸光度(OD)(490 nm)進行測定。

1.2.5 測定細胞凋亡率

Ishikawa細胞均培養(yǎng)至對數(shù)期，實施轉(zhuǎn)染，然后接種于6孔板，培養(yǎng)48 h；收集細胞進行洗滌，次數(shù)不易過多，兩次為宜。根據(jù)凋亡試劑盒說明書展開各項操作，用流式細胞儀獲取凋亡率。

1.2.6 用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行相關(guān)實驗

參照上述手段，以Ishikawa細胞為研究對象，進行培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染等操作。選取兩種雙熒光素酶報告載體[一種為野生型LncRNA NR2F2-AS1(WT-NR2F2-AS1)，另一種為突變型LncRNA NR2F2-AS1(MUT-NR2F2-AS1)]，聯(lián)合miR-129-5p，以Ishikawa細胞為對象，進行共轉(zhuǎn)染處理，48 h后對細胞實施各項操作(如收集、裂解等)。最后進行離心操作，收集上清液，檢測其熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織中miR-129-5p和LncRNA NR2F2-AS1的表達

子宮內(nèi)膜癌組織中LncRNA NR2F2-AS1含量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)，miR-129-5p含量顯著低于正常子宮內(nèi)膜組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織當中miR-129-5p和LncRNA NR2F2-AS1的表達

2.2 干擾LncRNA NR2F2-AS1表達對Ishikawa增殖的抑制情況si-NR2F2-AS1組LncNR2F2-AS1表達量

低于si-NC組(P<0.05)(si-NR2F2-AS1表示加入NR2F2-AS1干擾劑；si-NC表示陰性對照)，OD490在各時間段(24 h，48 h，72 h)及CyclinD1表達量都低于si-NC組(P<0.05)，p21表達量顯著高于si-NC組(P<0.05)(見圖1與表2)，提示干擾LncNR2F2-AS1表達能夠抑制Ishika增殖。

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達

2.3 干擾LncRNA NR2F2-AS1表達對Ishikawa凋亡的影響

si-NR2F2-AS1組Ishikawa凋亡率和Bax含量高于si-NC組(P<0.05)，Bcl-2含量低于si-NC組(P<0.05)(見圖2和表3)，表明干擾LncRNA NR2F2-AS1表達可誘導Ishikawa凋亡。

表2 干擾LncRNA NR2F2-AS1表達對Ishikawa增殖的影響

(a)為凋亡相關(guān)蛋白表達；(b)為細胞凋亡流式圖

表3 干擾LncRNA NR2F2-AS1表達 對Ishikawa凋亡的影響

2.4 miR-129-5p過表達可抑制Ishikawa增殖和誘導其凋亡

miR-129-5p組在48 h和72 h時OD490明顯低于miR-NC組(P<0.05)(miR-129-5p表示miR-129-5p模擬物，miR-NC表示陰性對照)，細胞凋亡率高于miR-NC組(P<0.05)，CyclinD1和Bcl-2含量低于miR-NC組(P<0.05)，p21和Bax含量高于miR-NC組(P<0.05)(見圖3和表4)，提示過表達miR-129-5p能夠抑制Ishikawa細胞增殖，加速細胞凋亡。

(a)為增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達，(b)為細胞凋亡流式圖

表4 過表達miR-129-5p對Ishikawa細胞增殖與凋亡的影響

2.5 LncRNA NR2F2-AS1靶向調(diào)控miR-129-5p表達

LncBase預測結(jié)果顯示，LncRNA NR2F2-AS1序列中含有與miR-129-5p互補的序列(見圖4)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，過表達miR-129-5p組野生型WT-NR2F2-AS1的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)，而突變型MUT-NR2F2-AS1的螢火蟲熒光素酶相對活性無明顯變化(見表5)。提示LncRNA NR2F2-AS1在細胞中與miR-129-5p之間可能存在相關(guān)性。

(a)為增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達，(b)為細胞凋亡流式圖

表5 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

2.6 LncRNA NR2F2-AS1與miR-129-5p的調(diào)控關(guān)系

qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pcDNA的miR-129-5p為(1.00±0.08)，pcDNA-NR2F2-AS1的miR-129-5p為(0.51±0.04)，si-NC的miR-129-5p為(0.99±0.07)，si-NR2F2-AS1的miR-129-5p為(2.47±0.23)。pcDNA-NR2F2-AS1的miR-129-5p水平低于pcDNA(t=3.741，P<0.05)，si-NR2F2-AS1的miR-129-5p水平高于si-NC(t=4.162，P<0.05)，提示過表達NR2F2-AS1可顯著下調(diào)miR-129-5p含量；干擾NR2F2-AS1表達顯著上調(diào)miR-129-5p表達量。

3 討 論

LncRNA不僅在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，而且在子宮內(nèi)膜癌細胞的代謝、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中扮演非常重要的角色[4]。對于LncRNA NR2F2-AS1來說，當前已證實，其在許多類型的腫瘤組織中均存在不同程度的表達異常[5]。針對此情況，適當下調(diào)其表達，可以達到有效抑制癌細胞增殖的目的，另外還可促進細胞的快速凋亡[6-7]。既往研究[6]還發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p在乳腺癌、胃癌、前列腺癌中均存在明顯的低表達；miR-129-5p過表達不僅可以抑制腫瘤增殖，加速細胞凋亡，而且對腫瘤的遷移、侵襲同樣有著良好的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中的LncRNA NR2F2-AS1呈現(xiàn)高表達，miR-129-5p呈現(xiàn)低表達，表明LncRNA NR2F2-AS1與miR-129-5p在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮著重要作用。干擾LncRNA NR2F2-AS1表達后，LncRNA NR2F2-AS1在Ishikawa細胞中的含量明顯下降，各時間段OD490及Cyclin D1的表達量都有降低，p21表達則與之相反，呈現(xiàn)明顯升高趨勢，提示干擾NR2F2-AS1表達可抑制Ishikawa細胞的增殖。還需指出的是，在過表達miR-129-5p后，Ishikawa細胞中的miR-129-5p含量有明顯增加；48 h和72 h OD490明顯下降，miR-129-5p細胞凋亡率高于miR-NC，CyclinD1和Bcl-2含量降低，p21和Bax含量升高，提示過表達miR-129-5p能夠抑制Ishikawa細胞增殖，加速細胞凋亡。從LncBase預測得知，在LncRNA NR2F2-AS1序列中，含有互補于miR-129-5p的核苷酸序列，提示miR-129-5p與NR2F2-AS1之間可能存在調(diào)控關(guān)系，或者是結(jié)合位點，這為LncRNA NR2F2-AS1靶向調(diào)控miR-129-5p的表達提供理論基礎(chǔ)。提示LncRNA NR2F2-AS1與miR-129-5p之間可能存在相關(guān)性。從qRT-PCR結(jié)果得知，pcDNA-NR2F2-AS1的miR-129-5p水平低于pcDNA，si-NR2F2-AS1的miR-129-5p水平高于si-NC，提示過表達NR2F2-AS1可顯著下調(diào)miR-129-5p含量；干擾NR2F2-AS1表達顯著上調(diào)miR-129-5p表達量，表明miR-129-5p與NR2F2-AS1之間可能存在調(diào)控關(guān)系，這為LncRNA NR2F2-AS1靶向調(diào)控miR-129-5p的表達提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，干擾LncRNA NR2F2-AS1可以靶向促進miR-129-5p的表達，從而抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，可望為子宮內(nèi)膜癌的治療提供新的靶點。但是本研究樣本量較少，在之后的研究中，我們會擴充樣本量，進行進一步研究。