石慧君，張文麗

九江市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心，江西 九江 332000

小兒咳喘靈顆粒是由麻黃等七味中藥制得，適用于緩解感冒、喘癥等［1-2］?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第四冊及20 個(gè)注冊標(biāo)準(zhǔn)，具體包括金銀花或甘草酸銨的薄層色譜鑒別、綠原酸或鹽酸麻黃堿的高效液相色譜含量測定等項(xiàng)目［3］，尚未從安全性和非法添加方面進(jìn)行全面的質(zhì)量控制。處方中苦杏仁為富含淀粉、油脂的種子類藥材，瓜蔞、甘草等藥材在加工、貯藏及運(yùn)輸過程中易發(fā)生霉變，根據(jù)2020 年版《中國藥典》中藥中真菌毒素測定指導(dǎo)原則規(guī)定，糧谷類、種子類、油性成分多的品種應(yīng)注意黃曲霉毒素的檢測以及處方中含有易污染藥材的中成藥品種應(yīng)注意相關(guān)真菌毒素的檢測［4］，故有必要研究該中成藥中黃曲霉毒素的安全性。但目前未見小兒咳喘靈顆粒中黃曲霉毒素測定相關(guān)研究，而且應(yīng)用較為廣泛的相關(guān)檢測方法為柱后光化學(xué)衍生HPLC 法［5-7］。另外雖已有不少文獻(xiàn)涉及金銀花非法摻偽山銀花，但是基本采用薄層定性鑒別和HPLC-ELSD 法定量確認(rèn)［8-9］。隨著技術(shù)手段不斷更進(jìn)，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因具高通量、色譜無需完全分離及能夠解決假陽性等特點(diǎn)，越來越多應(yīng)用在定性篩查及定量方面。2019 年有文獻(xiàn)［10］報(bào)道采用UPLC-MS/MS 檢測小兒咳喘靈顆粒樣品中摻偽山銀花的特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙，需先進(jìn)行HPLC-ELSD 法篩查及定量，陽性樣品再用UPLC-MS/MS 法定性確證是否摻雜山銀花。為了檢驗(yàn)檢測手段更加快速、便捷，本研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體儀器及實(shí)際應(yīng)用，建立了UPLC-MS/MS 法（MRM模式下）對小兒咳喘靈顆粒中4 種黃曲霉毒素及灰氈毛忍冬皂苷乙的定性定量分析，找到響應(yīng)值高的監(jiān)測離子對和最優(yōu)儀器參數(shù)條件，以期為小兒咳喘靈顆粒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)提升做參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Xevo-TQD 串聯(lián)四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters 公司，ACQUITY 系統(tǒng)，MassLynxV4.1 工作站，ESI 離子源）；離心機(jī)（上海Anke 儀器廠）；Sartorius BP211D 天平（Sartorius 公司）；Sartorius BSA 124s 天平（Sartorius 公司）。

1.2 試藥

黃曲霉毒素Mix-4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液［中國食品藥品檢定研究院，黃曲霉毒素B1（AFB1）0.93 μg/mL、黃曲霉毒素B2（AFB2）0.30 μg/mL、黃曲霉毒素G1（AFG1）0.93 μg/mL、黃曲霉毒素G2（AFG2）0.35 μg/mL，批號610001-201804］；灰氈毛忍冬皂苷乙標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號111814-201604，含量以94.4%計(jì)）。甲醇和乙腈為質(zhì)譜級（德國默克公司）；水為屈臣氏飲用水；甲酸為色譜純。小兒咳喘靈顆粒樣品為18 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的51 個(gè)批次。

2 黃曲霉毒素的含量測定

2.1 溶液配制

2.1.1 黃曲霉毒素Mix-4 儲備溶液的制備精密吸取黃曲霉毒素Mix-4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μL，加70%甲醇制得每1 mL 含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2分別為46.50 ng、15.00 ng、46.50 ng、17.50 ng 的混合儲備溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備取小兒咳喘靈顆粒約6 g，精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液50 mL，高速攪拌2 min，離心5 min，精密量取上清液25 mL，置于50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，過濾，精密移取續(xù)濾液20 mL 于免疫親和柱中，用水20 mL 洗脫，棄去洗脫液，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置于2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 空白基質(zhì)溶液的制備取不含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的小兒咳喘靈顆粒樣品，依照“2.1.2”項(xiàng)下制備方法制得。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為UPLC ACQUITY BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）。梯度洗脫程序?yàn)?～1 min，20%A；1～4 min，20%→40%A；4～5 min，40%A；5～6.8 min，40%A→100%A；6.8～7.0 min，100%A→20%A；7.0～9.0 min，20%A。流速為0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。ESI+離子源模式；離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓20 V；脫溶劑氣溫度620 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h；離子源溫度：150 ℃；MS/MS 操作模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。用于定性、定量的離子對和相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)如表1 所示。

表1 黃曲霉毒素（AF）B1、B2、G1、G2的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液及空白基質(zhì)溶液的MRM 圖見圖1，結(jié)果顯示，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液呈現(xiàn)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2色譜峰，且空白基質(zhì)溶液無干擾。

圖1 4種黃曲霉毒素MRM圖：A.基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；B.供試品溶液；C.空白基質(zhì)溶液

2.3.2 線性關(guān)系考察將上述對照品儲備液分別精密吸取20 μL 于5 mL 容量瓶中及40、160、240、320、400 μL 于2 mL 容量瓶中，用“2.1.3”項(xiàng)下的空白基質(zhì)溶液以配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別進(jìn)樣分析。以定量離子對的譜峰峰面積（Y）與對照品濃度（X）進(jìn)行線性回歸得出回歸方程，3 倍、10倍信噪比值時(shí)得出的是檢出限和定量限，結(jié)果可知在各濃度范圍內(nèi)檢測相關(guān)系數(shù)良好，見表2。

表2 4種黃曲霉毒素線性關(guān)系及檢出限、定量限 ng/mL

2.3.3 回收率考察選取未檢出黃曲霉毒素的小兒咳喘靈顆粒為空白樣品，精密添加“2.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液高、中、低3 個(gè)不同水平（1 mL、0.5 mL、0.25 mL），每個(gè)水平各3 份，按“2.1.2”項(xiàng)下步驟制備加樣待測溶液，分別計(jì)算添加回收率，結(jié)果見表3。

表3 樣品中黃曲霉毒素添加回收率測定結(jié)果

2.3.4 精密度考察取“2.3.3”項(xiàng)下制備的中水平加樣待測溶液1 份，在“2.2”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次測定AFB1、AFB2、AFG1及AFG2的峰面積，計(jì)算精密度RSD 分別為1.0%、2.7%、3.1%、3.4%。

2.3.5 重復(fù)性考察平行制備六份“2.3.3”項(xiàng)下中水平加樣待測溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定AFB1、AFB2、AFG1及AFG2的平均含量，計(jì)算重復(fù)性RSD 值分別為0.9%、1.5%、2.0%、2.2%。

2.3.6 穩(wěn)定性考察取“2.3.3”項(xiàng)下中水平加樣待測溶液1 份，分別在0，2，4，8，12，24 h 進(jìn)行測定，計(jì)算其穩(wěn)定性RSD 值為1.5%、1.7%、2.0%、2.5%。

2.4 樣品測定

按照建立的方法檢測18 個(gè)廠家51 批小兒咳喘靈顆粒中4 種黃曲霉毒素，結(jié)果表明51 批小兒咳喘靈顆粒樣品中4 種黃曲霉毒素均在檢出限以下。

3 灰氈毛忍冬皂苷乙的含量測定

3.1 溶液配制

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備精密稱取灰氈毛忍冬皂苷乙標(biāo)準(zhǔn)品8.83 mg，置100 mL 量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，即得灰氈毛忍冬皂苷乙儲備液。

3.1.2 供試品溶液的制備取小兒咳喘靈顆粒約2 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液25 mL，稱定重量，超聲處理30 分鐘，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液1 mL 到10 mL 容量瓶中加75%甲醇稀釋至刻度，即得供試品溶液。

3.1.3 空白基質(zhì)溶液的制備取不含灰氈毛忍冬皂苷乙的小兒咳喘靈顆粒樣品，依照“3.1.2”項(xiàng)下制備方法制得。

3.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為UPLC ACQUITY BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）。梯度洗脫程序?yàn)?～0.3 min，5%A；0.3～7 min，5% →95%A；7～8 min，95%A；8～8.1 min，95%→5%A；8.1～10 min，5%A。流速為0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μL。ESI-離子源模式；離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓：2.8 kV；錐孔電壓：65 V；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/hr；錐孔反吹氣流量：50 L/hr；離子源溫度：150 ℃；MS/MS 操作模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。定量離子對1 397.8＞1 074.36，錐孔電壓值65 V，碰撞能設(shè)47 V；定性離子對1 397.8＞536.44，錐孔電壓值65 V，碰撞能設(shè)55 V。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性考察基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液及空白基質(zhì)液的MRM 圖見圖2，結(jié)果顯示，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品色譜呈相同保留時(shí)間的灰氈毛忍冬皂苷乙色譜峰，且空白基質(zhì)液無干擾。

圖2 灰氈毛忍冬皂苷乙MRM圖：A.基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；B.供試品溶液；C.空白基質(zhì)溶液

3.3.2 線性關(guān)系考察精密吸取“3.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL 于100 mL 容量瓶中，用“2.1.3”項(xiàng)下的空白基質(zhì)溶液配制成833.552 ng/mL 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀。以定量離子對的譜峰峰面積（Y）和對照品進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=0.817 72X-5.190 52，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0，說明在0.083～2.501 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；將標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋，當(dāng)信噪比（S/N）為3 時(shí)，確定灰氈毛忍冬皂苷乙的檢測限為0.556 ng/mL。

3.3.3 回收率考察精密稱取1 g 檢出灰氈毛忍冬皂苷乙的供試品共9 份，置錐形瓶中，分別精密添加“3.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液低、中、高3 個(gè)不同水平（0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL），每個(gè)水平各3 份，依照“3.1.2”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算添加回收率，結(jié)果見表4。

表4 樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙添加回收率測定結(jié)果

3.3.4 精密度考察取“3.3.3”項(xiàng)下配制成的中水平加樣待測溶液，在“3.2”項(xiàng)條件下連續(xù)測定6 次灰氈毛忍冬皂苷乙的峰面積，計(jì)算精密度RSD 值為3.9% 。

3.3.5 重復(fù)性考察選取“3.3.3”項(xiàng)下同一批號的供試樣品，平行制備6 份供試品溶液，在“3.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定灰氈毛忍冬皂苷乙的平均含量，計(jì)算重復(fù)性RSD 值為3.1%。

3.3.6 穩(wěn)定性考察取“3.3.3”項(xiàng)下同一批號的供試樣品1 份，分別在0，2，4，8，12，24 h 進(jìn)行測定，計(jì)算其穩(wěn)定性RSD 值7.8%。

3.4 樣品測定

取18 個(gè)廠家51 批小兒咳喘靈顆粒的樣品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果3 批樣品檢出灰氈毛忍冬皂苷乙，檢出含量分別為0.068 55 mg/g、1.013 mg/g、0.288 5 mg/g。

4 討論

4.1 凈化條件的優(yōu)化

小兒咳喘靈顆粒成分復(fù)雜，產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)是影響UPLC-MS/MS 檢測準(zhǔn)確度的主要因素，本研究采用免疫親和柱對樣品進(jìn)行純化，有效去除基質(zhì)中大量輔料及醇不溶性雜質(zhì)，回收率結(jié)果令人滿意，操作簡便。

4.2 UPLC-MS/MS 儀器參數(shù)的優(yōu)化

4.2.1 測定黃曲霉毒素比較乙腈/甲醇-甲酸溶液、甲醇/乙腈-醋酸銨溶液等不同系統(tǒng)流動相，其中乙腈系統(tǒng)峰形及分離度較好，保留時(shí)間較短，更能實(shí)現(xiàn)快速分析。流動相水相加入甲酸時(shí)，正離子模式的4 種黃曲霉毒素離子響應(yīng)強(qiáng)度很好；當(dāng)加入醋酸銨時(shí)，響應(yīng)值較之更低。也考察了甲酸的濃度0.1%、0.2%、0.3%，其中0.2%的甲酸濃度色譜峰型效果和離子化效果最佳，故選擇乙腈-0.2%甲酸溶液作為流動相測定4 種黃曲霉毒素。配制黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的標(biāo)準(zhǔn)品，在調(diào)諧（mass tune）界面中，選正離子MS 模式根據(jù)母離子響應(yīng)強(qiáng)度優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和脫溶劑氣溫度等，打開碰撞氣氬氣，MS/MS 模式下做子離子掃描（daughter scan）采集。確定定量和定性子離子，設(shè)定好母離子和碎片離子，通過優(yōu)化碰撞能，使子離子響應(yīng)強(qiáng)度最高。

4.2.2 測定灰氈毛忍冬皂苷乙結(jié)合文獻(xiàn)資料［10-11］，ESI 正離子源模式下，離子對1 421.6＞1 097.5，確定［M+Na］+。通過MS SCAN 模式掃描，不能提取到1 421.6 的母離子，下一步手動調(diào)諧尋找母離子，選擇不同毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑氣溫度，最終確定正離子模式下最優(yōu)條件：毛細(xì)管電壓：3.2 kV；錐孔電壓：53 V；脫溶劑氣溫度：450 ℃；離子源溫度：150 ℃，此時(shí)m/z 1 421.6 離子響應(yīng)值最大。打開碰撞氣氬氣，做daughter scan 采集提取到子離子936.08 和1 097.64，然而設(shè)定好母離子和碎片離子，通過優(yōu)化碰撞能，并不能在質(zhì)譜觀測窗口看到任何采集圖譜。于是建立了ESI-模式下的UPLC-MS/MS 法，按照手動調(diào)諧步驟，重復(fù)上述操作，優(yōu)化條件得到毛細(xì)管電壓：2.8 kV；錐孔電壓：65 V；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/hr；錐孔反吹氣流量：50 L/hr；離子源溫度：150 ℃。確定m/z 1 397.8 離子響應(yīng)強(qiáng)度最大，對應(yīng)母離子［M-H］-，繼續(xù)優(yōu)化碰撞能，得到子離子1 074.36（離子響應(yīng)最高）和536.44（響應(yīng)次之）。實(shí)驗(yàn)中采用MRM 監(jiān)測模式定性定量，所建立的方法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于準(zhǔn)確篩查小兒咳喘靈顆粒中山銀花的使用情況。

4.3 含量測定結(jié)果分析

建立的免疫親和柱凈化UPLC-MS/MS 法檢測4種黃曲霉毒素，樣品中均未檢出，說明小兒咳喘靈顆粒均無黃曲霉毒素污染察，質(zhì)量安全性良好。建立的UPLC-MS/MS 快速測定樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙，檢出3 批存在摻雜山銀花違規(guī)現(xiàn)象，因此應(yīng)加強(qiáng)中藥制劑中對山銀花代替金銀花投料的監(jiān)管，嚴(yán)防非法添加山銀花的現(xiàn)象發(fā)生。

該研究從質(zhì)量安全和非法添加出發(fā)，實(shí)現(xiàn)了建立UPLC-MS/MS 方法定性定量分析小兒咳喘靈顆粒中4 種黃曲霉毒素及灰氈毛忍冬皂苷乙，能夠快速、有效地對小兒咳喘靈顆粒進(jìn)行質(zhì)量把控。