張 波，馬 婭，張欣鈺

（1.蘭州石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省中醫(yī)藥大學(xué) 定西校區(qū)，甘肅定西 743000）

1 牛乳中慶大霉素的殘留

抗生素在預(yù)防及治療奶牛疾病中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)人體長期食用含有抗生素的牛奶會應(yīng)危害人體建康，因此，1979年世界衛(wèi)生組織（WHO）明確提出牛奶中不應(yīng)檢出抗生素。牛奶中應(yīng)檢測的抗生素種類如表1所示。

表1 牛奶中應(yīng)檢測的抗生素種類

慶大霉素（Gentamicin）屬于氨基糖苷類抗生素，是靜止期殺菌藥，抗菌活性強(qiáng)且高，因價(jià)廉易得而廣泛應(yīng)用于禽畜疾病的預(yù)防和治療。慶大霉素抗菌活性作用機(jī)理：依靠離子吸附在菌體表面，造成膜的損傷，與細(xì)菌核糖體30S小亞基不可逆結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄和病原菌蛋白質(zhì)的合成，從而消滅病菌，可以治療需氧革蘭氏陰性細(xì)菌所致的感染，但其有比較嚴(yán)重的耳毒性和腎毒性。奶牛在養(yǎng)殖過程中使用過量的慶大霉素會在體內(nèi)殘留、積聚，影響所獲乳品的質(zhì)量，人們長期食用會誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重甚至?xí)l(fā)毒性作用。耳毒性的主要表現(xiàn)是：眩暈、平衡失調(diào)、聽力減退、耳鳴甚至耳聾。腎毒性癥狀可為蛋白尿、腎功能減退嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)腎衰竭和尿毒癥[1]。為了保證人體的安全，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中，規(guī)定了牛奶中慶大霉素的最高殘留標(biāo)準(zhǔn)為 200μg/kg。

2 慶大霉素殘留的檢測方法

2.1 理化分析法

理化分析方法基于慶大霉素的理化性質(zhì)來分離和檢測，檢測部分多采用紫外分析、熒光分析、質(zhì)譜等方法，而分離部分多采用色譜分離技術(shù)和電泳分離技術(shù)。理化分析方法因其檢測靈敏度高、分離效果好，所獲得的結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性高、準(zhǔn)確可靠而得到了廣泛應(yīng)用。慶大霉素因?yàn)榫哂辛己玫乃苄裕蟮姆肿恿考皹O性等特征，適合使用液相色譜進(jìn)行分析，而采用氣相色譜進(jìn)行分析的報(bào)道極為少見。

Kowalczuk D 等建立了一種慶大霉素簡單靈敏的檢測方法，該方法基于鄰苯二醛（OPA）與N-乙酰半胱氨酸（NAC）在堿性培養(yǎng)基中的結(jié)合反應(yīng)。用NAC代替液體硫醇形成異吲哚衍生物，避免了形成的硫醇化合物令人不快的氣味。該測定方法所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為 0.4～12.8μg/mL（r=0.9997），該方法的精密度在1.5～8.5。平均回收率可達(dá)100.02%[2]。

Kabra 等建立了一種簡便、準(zhǔn)確、特異的液相色譜法測定50μL血清中慶大霉素的方法。慶大霉素在70℃反應(yīng)30min，轉(zhuǎn)化為其三硝基苯衍生物。用氯仿從粗混合物中提取衍生物，用流動(dòng)相沖洗反相辛基柱將慶大霉素分離為三種主要異構(gòu)體。洗脫后的化合物在340nm處檢測，并根據(jù)峰高或峰面積進(jìn)行定量，色譜分析在11min內(nèi)完成。慶大霉素的檢出下限小于0.5mg/L，分析回收率為96.6%～99.3%，線性范圍為15.0mg/L，精密度為2.2%～2.9%[3]。

高效液相色譜法（HPLC）又稱“高壓液相色譜”，指利用高壓輸送系統(tǒng)，通過液體流動(dòng)相將樣品泵入色譜柱，不同抗生素在柱內(nèi)高效分離，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，完成分析。高燕霞等[4]用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）法，以三氟乙酸-甲醇為流動(dòng)相使硫酸慶大霉素在Apollo C18柱中得到了有效分離。依據(jù)ELSD原理，樣品濃度與檢測器對數(shù)響應(yīng)呈線性關(guān)系，以此來測定硫酸小諾霉素、硫酸西索米星的濃度，該方法準(zhǔn)確性好，靈敏度高。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是牛乳中抗生素分離和檢測的一種重要的分析方法。色譜法最大的優(yōu)勢在于分離效率高，為混合物的檢測提供了有力的保證。質(zhì)譜法能幫助分析人員進(jìn)行雜質(zhì)分析，樣品分析用量少，分析時(shí)間短，結(jié)果可靠準(zhǔn)確。但是樣品預(yù)處理復(fù)雜，為了能夠最大限度地發(fā)揮每種分析方法的優(yōu)勢，常將兩種方法聯(lián)用，聯(lián)用技術(shù)有：薄層液相色譜-質(zhì)譜（TLCMS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、毛細(xì)管區(qū)域電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（GIE-MS）等。劉雪紅等報(bào)道了一種采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，準(zhǔn)確、簡單、快速地檢測了牛奶中的7種氨基糖苷類抗生素（鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、安普霉素、大觀霉素）。分析過程采用乙酸銨緩沖溶液提取樣品，分離色譜柱為CORTECS HILIC，流動(dòng)相采用甲酸銨溶液洗脫。采用該方法所獲的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1～5μg/m L（r＞0.996），平均回收率可達(dá)80%～117.5%，檢測限為10μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%[5]。

2.2 微生物法

微生物檢測法是牛乳中抗生素檢測的一種傳統(tǒng)方法，能夠比較直觀地反映抗生素的抗菌活性，使用的檢測儀器簡單，檢測價(jià)格低廉，檢測速度快，檢測靈敏度高，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。微生物檢測的原理是：抗生素會對微生物的代謝產(chǎn)生抑制作用，以此來定性、定量確定牛乳中放熱抗生素。如氯化三苯基四氮唑試驗(yàn)法（TTC法）、紙片法（PD法）和試劑盒法等。

TTC法的檢測原理是在牛乳中生長的嗜熱鏈球菌會將無色TTC溶液還原為紅色的三苯甲臜，而牛乳中有抗生素存在會抑制嗜熱鏈球菌的生長，TTC不會被還原溶液呈無色。TTC法應(yīng)用廣泛價(jià)格便宜。黃怡君等[6]使用TTC法對牛乳中的抗生素（青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等9種）進(jìn)行了檢測，檢測的靈敏性均達(dá)到了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對抗生素殘留最高限量的要求。

王志強(qiáng)等報(bào)道了一種牛奶中多種抗生素殘留的快速檢驗(yàn)方法。該方法基于抗生素對細(xì)菌的抑制作用，快速檢測牛奶中10種殘留抗生素。該方法氨芐青霉素、青霉素最低檢出限為0.001μg/mL，金霉素、土霉素、紅霉素、四環(huán)素最低檢出限為0.01μg/mL，鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素最低檢出限為0.1μg/mL，該方法最低檢出限結(jié)果優(yōu)于GB/T 4789.27—2003TTC法。采用本方法成本低、靈敏度高、穩(wěn)定性好，檢測時(shí)間短，能同時(shí)測定10種抗生素[7]。

紙片法，目前主要使用的是：枯草桿菌法、嗜熱脂肪桿菌法。枯草桿菌法只能檢測β內(nèi)酰胺類抗生素，而嗜熱鏈球菌法可以檢測除了β內(nèi)酰胺類抗生素的多種抗生素。檢測原理為浸有牛奶的濾紙片貼在含有枯草桿菌或嗜熱脂肪桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。若牛奶中含有抗生素會抑制菌種的生長，紙片周圍會出現(xiàn)抑菌圈。若牛奶中不含有抗生素，菌種正常地生長，紙片周圍有不透明的菌層[8]。

Qin Wu等建立了一種微生物抑制法，用于牛奶中抗生素的快速篩選。該方法樣品預(yù)處理簡便，以嗜熱地芽孢桿菌 ATCC12980 作為指示菌，該試劑盒對牛奶中34種常見抗生素殘留的檢出限均低于或接近歐盟和中國規(guī)定的最大殘留限量，包括β-內(nèi)酰胺類（13）、氨基糖苷類（6）、四環(huán)素類（4）、磺胺類（6）、大環(huán)內(nèi)酯類（4）、林可酰胺類（1）。檢測的假陽性率為1%，假陰性小于5%。該試劑盒在4℃條件下，保質(zhì)期超過6個(gè)月。此外，試劑盒檢測結(jié)果與采用超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法結(jié)果保持一致，該試劑盒可用于牛乳中的抗生素篩查。該試劑盒具有靈敏度、特異性高、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、可靠性高、操作簡單、成本低、通量大等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。[9]

2.3 免疫分析法

免疫測定法基于抗原、半抗原同抗體特異性結(jié)合，檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，測定成本低，廣泛引用于醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。免疫分析法和其他方法的聯(lián)用也是牛乳中慶大霉素檢測技術(shù)發(fā)展的重要方向之一。

Yeluri T 等描述了基于 cyclamn-Au NPs的敏感比色法檢測新霉素和慶大霉素的進(jìn)展。利用紫外-可見光譜、傅里葉變換紅外光譜、透射電子顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射和zeta電位等方法對cyclamn-Au NPs進(jìn)行了表征。在新霉素和慶大霉素存在下cyclamn-Au NPs會聚集，導(dǎo)致顏色從紫色變?yōu)樗{(lán)色，530nm處的特征吸收峰被紅移到一個(gè)更長的波長（660nm）。采用紫外-可見吸收法測定了新霉素和慶大霉素的檢出限，分別為 1.87 × 10-8mol/L 和 2.35 × 10-8mol/L[10]。

R.M Van Es等為了開發(fā)一種簡單、快速的基于現(xiàn)場方法將牛奶中的慶大霉素量化到監(jiān)管范圍中，已經(jīng)評估了許多方法，包括免疫分析與流動(dòng)注射分析和電化學(xué)檢測相結(jié)合。抗慶大霉素抗體被吸附在硝酸纖維素和聚碳酸酯固相載體上，并放置在與流動(dòng)池安裝的電極接觸或電極-電池組件的上游。在競爭性免疫測定之后，根據(jù)電化學(xué)測量的葡萄糖氧化酶標(biāo)記活性的程度對分析物水平進(jìn)行量化。完全組裝的流動(dòng)池裝置（原位方法）能夠在10min內(nèi)檢測牛奶中 0到 100μg/kg的慶大霉素，變異系數(shù)值為 13.2%，并且沒有樣品預(yù)處理。在細(xì)胞組裝和信號測量之前，流通池外需要孵育90min和高達(dá) 38.7% 的 CV 值。原位測定操作簡單、可自動(dòng)化，并且通過使用廉價(jià)、可大量生產(chǎn)的絲網(wǎng)印刷電極，適合開發(fā)一次性使用測量盒[11]。

王永智等[12]基于免疫分析法抗原和抗體的高特異性，結(jié)合表面等離子共振（SPR）技術(shù)將慶大霉素-BSA-GM偶聯(lián)到S系列CM5芯片上，利用競爭抑制性準(zhǔn)確高效地檢測了牛乳中的慶大霉素。該方法檢測準(zhǔn)確度高，平均回收率為102.60%，RSD為9.58。采用該檢測方法結(jié)果的重復(fù)性好，牛乳中慶大霉素濃度為3.2、12.8、51.2ng/mL時(shí)，計(jì)算所得的 RSD 結(jié)果分別為4.56%、4.83%、3.84%。本實(shí)驗(yàn)測得的中間精密度高，選擇實(shí)驗(yàn)員A和B獨(dú)立操作，檢測六次，計(jì)算所得RSD為4.65%。慶大霉素在 0.8～102.4ng/mL的濃度范圍內(nèi)，儀器響應(yīng)單位（Ru）和慶大霉素的濃度（ng/mL）有良好的線性回歸關(guān)系（R2=0.997 7）。

3 結(jié)束語

牛乳中抗生素殘留的常用的三種檢測方法：理化分析法、微生物法及免疫分析法。理化檢測法檢測速度快、靈敏性高、特異性好、重復(fù)性強(qiáng)，但是儀器價(jià)格昂貴、樣品的前處理過程復(fù)雜、程序復(fù)雜，常用于技術(shù)部門。微生物法操作簡單、價(jià)格低廉但是微生物的培養(yǎng)時(shí)間較長，與檢測人員的操作水平關(guān)系密切，在企業(yè)中使用較為廣泛。免疫分析法靈敏度高，特異性強(qiáng)，樣品處理量大，檢測時(shí)間短，但是方法建立難度大，使用范圍逐漸擴(kuò)大。