莊婕，楊美香，李欣欣，王彥博，孫曉紅,3，張玉剛,4

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東青島 266109；2.青島市城陽第四中學(xué)，山東青島266109；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；4.山東省園藝作物基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號級聯(lián)系統(tǒng)廣泛存在于真核生物體內(nèi)，是一種信號傳遞系統(tǒng)，負(fù)責(zé)將胞外多種生物或非生物脅迫的刺激信號傳遞至胞內(nèi)，引起胞內(nèi)應(yīng)答[1]；在信號傳遞過程中，MAPK級聯(lián)信號系統(tǒng)能夠?qū)⑿盘栒稀⒎糯蠛蛡鬟f，起著承上啟下的作用。當(dāng)植物受到外界信號的刺激，比如射線、病原體、干旱等，靜止?fàn)顟B(tài)的MAPK、MAPK激酶(MAPK kinase,MAPKK)和MAPKK激酶(MAPK kinase kinase,MAPKKK)會發(fā)生改變，產(chǎn)生順序磷酸化反應(yīng)，從而激活下游靶標(biāo)基因的表達(dá)，對基因的表達(dá)、植物的生長和發(fā)育及對環(huán)境的適應(yīng)進(jìn)行調(diào)控[2]。在擬南芥中，可以通過4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫代葡萄糖苷(4-methoxyindolyl-3-methylglucosinolates,4MI3G)的生物合成和積累，提供MAPK介導(dǎo)的信號通路來響應(yīng)非生物脅迫[3]。

在擬南芥中MKK9-絲裂原活化蛋白激酶6(mitogen-activated protein kinase 6,MAPK6)級聯(lián)系統(tǒng)通過調(diào)控Rubisco活化酶(rubisco activator,RCA)、質(zhì)體核糖體蛋白1 (plastid ribosomal protein 1,PRPS1)、葉綠體分裂蛋白(chloroplast division protein,Ftsz2-2)和微管蛋白(tubulin,TOR2)的磷酸化在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮功能[1]。據(jù)報(bào)道，MKK9作為鹽處理擬南芥愈傷組織中積累H2O2的正因子，與絲裂原活化蛋白激酶3/6(mitogen-activated protein kinase 3/6,MAPK3/6)形成通路在增強(qiáng)呼吸作用中起關(guān)鍵作用[4]；輕度滲透脅迫激活了MKK9-MAPK3/6級聯(lián)信號系統(tǒng)，促進(jìn)其在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮功能[5]；MKK9-MAPK3/6級聯(lián)反應(yīng)的激活促進(jìn)了擬南芥幼苗的磷吸收[6]；核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶合成因子22(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase assembly factor 22,RAF22)-MKK7/MKK9-MAPK3/MAPK6形成一個(gè)完整的過程級聯(lián)，可能通過參與蔗糖的分解代謝調(diào)控?cái)M南芥的生長[7]；磷脂酸(phosphatidic acid,PA)能夠同時(shí)結(jié)合MAPK6和MKK9，增強(qiáng)MKK9對MAPK6的磷酸化活性[8]；MKK9的組成型和誘導(dǎo)型過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥葉片過早衰老，MAPK6作為MKK9的直接靶標(biāo)，敲除MKK9或MAPK6后葉片衰老被延遲[9]；擬南芥中MKK9是MAPK級聯(lián)信號途徑MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MKKs)中D組重要成員，可以響應(yīng)低氮、低磷的脅迫調(diào)控花青苷的合成[10]。而蘋果中MKK9在氮脅迫下對花青苷合成的調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道。

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果育種課題組于2017年選育的R1R6型[成髓細(xì)胞瘤域蛋白質(zhì)(myeloblastosis domain protein,MYB)10啟動(dòng)子區(qū)域有1個(gè)重復(fù)序列為R1，6個(gè)重復(fù)序列為R6]紅肉蘋果新品種‘黛紅’(品種權(quán)號為CNA20162427.9)果實(shí)為綠皮紅肉，是鮮食與加工兼用、具有廣闊推廣前景的紅肉蘋果新品種[8]。本試驗(yàn)以紅肉蘋果‘黛紅’和‘新疆4號’為試材，提取成熟果實(shí)果皮果肉RNA，構(gòu)建紅肉蘋果cDNA文庫，利用實(shí)驗(yàn)室前期擴(kuò)增得到的MdMKK9為誘餌篩選文庫。通過酵母雙雜交驗(yàn)證及體內(nèi)雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)方法進(jìn)行MdMKK9互作蛋白驗(yàn)證，為紅肉蘋果花青苷生物合成調(diào)控機(jī)理提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為10年生紅肉蘋果‘黛紅’和‘新疆4號’，定植于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技服務(wù)中心，砧木為八棱海棠。采集果實(shí)膨大期和成熟期的‘黛紅’和‘新疆4號’果皮及果肉，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)藥品

1.1.3 試驗(yàn)儀器

PCR儀(TaKaRa公司 TP-600)、植物活體熒光儀(法國Vilber公司 Newton 7.0)、電泳儀(上海艾研生物科技有限公司 PowerPac-3000)、凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司 FluorChem R)、恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司 DHP-9052)及搖床(廣州市深華生物技術(shù)有限公司 IS-RDV1)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅肉蘋果cDNA文庫構(gòu)建

取適量果皮/果肉在液氮中迅速研磨成粉末，加入β-巰基乙醇及裂解液SL等試劑，對果皮果肉進(jìn)行RNA提取，將檢測合格的RNA樣品送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建，經(jīng)單檢混檢均合格后得到紅肉蘋果cDNA酵母文庫。

1.2.2 篩選基因載體構(gòu)建

根據(jù)pGADT7載體圖譜，按照同源重組方法設(shè)計(jì)MdAER、MdDFR、MdNRT2.7含XhoI酶切位點(diǎn)的引物，MdWRKY71、MdWRKY56、MdWRKY55、MdWRKY48、MdMYB87、MdANR、MdAlaAT2、MdMYB114、MdMAPK3含BamHI酶切位點(diǎn)的引物(見表1)。

表1 載體構(gòu)建所用引物序列Table 1 The primers for construct vector

1.2.2.1 載體單酶切試驗(yàn)

文化不是虛的，強(qiáng)化企業(yè)文化建設(shè)，要塑造的是大家在一起做一番事業(yè)是意義和興趣所在。企業(yè)文化更多的是組織對員工的承諾，同時(shí)也是員工對組織的承諾。其實(shí)是一種精神鎖定，是一種心靈契約的鎖定。員工在這種組織氛圍下，無形之中會做出一種承諾，組織中的一群人都是這樣的，如果自己將來不是這樣，自己會受煎熬。同時(shí)，企業(yè)文化最重要的且最終是一種選擇機(jī)制。企業(yè)文化不是解決所有的問題，不是所有人都會這樣，而是盡量減少未來動(dòng)蕩的風(fēng)險(xiǎn)。

將上述反應(yīng)體系，12 000 r/min渦旋離心1 min，充分混勻，37 ℃金屬浴單酶切3～6 h，回收目的條帶。

表2 載體單酶切反應(yīng)體系Table 2 Carrier single enzyme digestion reaction system

1.2.2.2 同源重組連接試驗(yàn)

將上述反應(yīng)體系手動(dòng)輕輕吸打混勻，以12 000 r/min離心1 min后將反應(yīng)液收集至管底。50 ℃金屬浴15～30 min，降至4 ℃或立即置于冰上冷卻。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取LB+Amp板上單克隆搖菌，菌液經(jīng)交叉引物PCR篩選后進(jìn)行測序，測序成功后命名為pGADT7-MdAER，pGADT7-MdDFR，pGADT7-MdNRT2.7，pGADT7-MdWRKY71，pGADT7-MdWRKY56，pGADT7-MdWRKY55，pGADT7-MdWRKY48，pGADT7-MdMYB87，pGADT7-MdANR，pGADT7-MdAlaAT2，pGADT7-MdMYB114，pGADT7-MdMAPK3將質(zhì)粒與菌液于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表3 同源重組連接反應(yīng)體系Table 3 Homologous recombination linkage reaction system

1.2.3 酵母雙雜交試驗(yàn)

1.2.3.1 Y2H Gold感受態(tài)的制備

用酵母膏蛋白胨葡萄糖腺嘌呤培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose adenine medium,YPDA)活化酵母菌，30 ℃培養(yǎng)3 d。將單菌落點(diǎn)到含有3 mL YPDA培養(yǎng)基中。于250 r/min搖床上，在30 ℃下震蕩培養(yǎng)8～12 h后，取適量菌液加入到50 mL新的YPDA培養(yǎng)基中。搖床振蕩培養(yǎng)16 h至OD600=0.2。培養(yǎng)好的菌液用離心機(jī)7 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，用100 mL YPDA進(jìn)行重懸，吸打混勻，30 ℃孵育5 h至OD600=0.5。將搖好的菌液分裝到50 mL滅菌離心管中，7 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入30 mL無菌去離子水吸打重懸。將重懸液在7 000 r/min下離心5 min，棄上清液，用1.5 mL 1.1×TE/LiAC重懸液重懸。把上述細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到兩個(gè)1.5 mL的離心管中，以12 000 r/min離心15 s后棄上清液。用600 μL 1.1×TE/LiAC重懸。

1.2.3.2 Y2H Gold感受態(tài)轉(zhuǎn)化

將Bait質(zhì)粒pGBKT7-MdMKK9質(zhì)粒與Prey質(zhì)粒pGADT7-MdCHS、pGADT7-MdSPX3按以下步驟共轉(zhuǎn)Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞。

表4 酵母感受態(tài)轉(zhuǎn)化體系Table 4 Yeast competent transformation system

1.2.3.3 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞

將上述重懸液均勻涂在SD/-Leu-Trp培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。分別設(shè)置陽性(pGBKT7-53+pGADT7-T)與陰性(pGBKT7-Lam+pGADT7-T)對照。分別挑取對照與試驗(yàn)組培養(yǎng)基上的單菌落，用滅菌ddH2O稀釋10倍，取8 μL點(diǎn)于SD-Ade-His-Leu-Trp/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上，觀察菌落顏色變化。

表5 酵母感受態(tài)轉(zhuǎn)化體系Table 5 Yeast competent transformation system

1.2.4 BiFC驗(yàn)證互作

將無MdMKK9終止密碼子的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(coding sequences,CDS)克隆到pCAMBIA1300-nLUC載體中，并將MdSPX3克隆到pCAMBIA1300-cLUC載體上，將兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，送公司測序成功后，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101中。菌液于28 ℃搖床，搖至OD600=0.5～0.8，離心后用重懸液重懸，將nLUC-MdMKK9+cLUC-MdSPX3、nLUC-MdMKK9+cLUC、nLUC+cLUC-MdSPX3重懸液均勻混合，注射本生煙，培養(yǎng)2～3 d，使用活體熒光儀檢測螢光素酶(luciferase,LUC)表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅肉蘋果cDNA文庫構(gòu)建及篩庫

MdMKK9在紅肉蘋果、尤其是本試驗(yàn)主要研究品種‘黛紅’中發(fā)揮功能的互作蛋白還未可知。因此以‘黛紅’和‘新疆4號’2個(gè)時(shí)期果皮果肉為試材提取RNA(圖1A)，由上海歐易公司經(jīng)過RNA的單檢及混檢合格后構(gòu)建紅肉蘋果cDNA文庫，并進(jìn)行互作蛋白的篩選驗(yàn)證。

注：A.紅肉蘋果cDNA文庫構(gòu)建提取RNA；M.DL2 000 Maker；1-4(左圖)，‘黛紅’果皮果肉RNA；1-8(右圖)，‘新疆4號’果皮果肉RNA；B.紅肉蘋果cDNA文庫篩庫過程；a.將共轉(zhuǎn)酵母菌液涂于SD-Trp-Leu+300 ng/μL AbA培養(yǎng)基；b.SD-Trp-Leu+300 ng/μL AbA培養(yǎng)基長出單克隆菌斑；c.SD-Ade-His-Trp-Leu+300 ng/μL AbA+X-α-gal顯色反應(yīng)。圖1 紅肉蘋果cDNA文庫構(gòu)建及篩庫Fig.1 Construction and screening of cDNA library of red flesh apple

如圖1B，將pGBKT7-MdMKK9為誘餌蛋白，與紅肉蘋果cDNA文庫質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)Y2H Gold感受態(tài)，涂于SD-Trp-Leu+300 ng/μL AbA培養(yǎng)基長出單克隆菌斑，并于SD-Ade-His-Trp-Leu+300 ng/μL AbA+X-α-gal培養(yǎng)基進(jìn)行顯色反應(yīng)。

2.2 單克隆PCR及測序分析

2～3 d后，在SD-Ade-His-Trp-Leu+300 ng/μL AbA+X-α-gal培養(yǎng)基上得到400個(gè)藍(lán)色菌斑，挑取菌斑，根據(jù)菌斑直徑大小用滅菌雙蒸水稀釋10～20倍，取1～2 μL稀釋液進(jìn)行PCR篩選。選擇單片段插入PCR產(chǎn)物20 μL進(jìn)行測序分析。

將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對分析，最終選擇了10個(gè)候選基因進(jìn)行互作鑒定：花青苷合成相關(guān)基因ANR、DFR；氮素相關(guān)基因AER、AlaAT2及NRT2.7；抗逆相關(guān)基因WRKY71、WRKY48、MYB87、MYB114、MAPK3。以‘黛紅’cDNA為模板克隆分別得到MdANR、MdMdAER、MdAlaAT2、MdDFR、MdNRT2.7、MdWRKY71、MdWRKY48、MdMYB87、MdMYB114、MdMAPK3。

注：M.DL2000Marker；1-24.SD-Ade-His-Trp-Leu+300 ng/μL AbA+X-α-gal培養(yǎng)基上得到菌斑稀釋后PCR產(chǎn)物電泳。圖2 候選克隆PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR validation of candidate clones

表6 互作蛋白功能注釋Table 6 Functional annotation of the interacting protein

2.3 酵母雙雜交驗(yàn)證互作

構(gòu)建AD-MdANR、AD-MdMdAER、AD-MdAlaAT2、AD-MdDFR、AD-MdNRT2.7、AD-MdWRKY71、AD-MdWRKY48、AD-MdMYB87、AD-MdMYB114、AD-MdMAPK3載體，分別與MdMKK9共轉(zhuǎn)于Y2H Gold感受態(tài)，涂于SD-Trp-Leu+300 ng/μL AbA與SD-Ade-His-Trp-Leu+300 ng/mL AbA+X-α-gal培養(yǎng)基上。選取AD-MdANR+BD、AD-MdMdAER+BD、AD-MdAlaAT2+BD、AD-MdDFR+BD、AD-MdNRT2.7+BD、AD-MdWRKY71+BD、AD-MdWRKY48+BD、AD-MdMYB87+BD、AD-MdMYB114+BD、AD-MdMAPK3+BD、BD-MdMKK9+AD作為對照。

由圖3結(jié)果顯示，在SD-Trp-Leu+300 ng/μL AbA培養(yǎng)基上，AD-MdANR、AD-MdMdAER、AD-MdAlaAT2、AD-MdDFR、AD-MdNRT2.7、AD-MdWRKY71、AD-MdWRKY48、AD-MdMYB87、AD-MdMYB114、AD-MdMAPK3與MdMKK9、BD共轉(zhuǎn)菌斑均生長。但在SD-Ade-His-Trp-Leu+300 ng/μL AbA培養(yǎng)基上只有AD-MdMYB87+BD-MdMKK9菌斑生長且顏色變藍(lán)，其他菌斑均未生長及變色。試驗(yàn)結(jié)果表明，只有MdMYB87可以與MdMKK9互作。

圖3 酵母點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證Fig.3 Point-to-point validation of yeast

2.4 BiFC驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證MdMYB87與MdMKK9的互作情況，構(gòu)建了pCAMBIA1300-nLUC-MdMKK9、pCAMBIA1300-cLUC-MdMYB87載體，進(jìn)行BiFC試驗(yàn)，通過觀察LUC表達(dá)情況得知MdMKK9與MdMYB87在體內(nèi)互作。

注：A.pCAMBIA1300-nLUC-MdMKK9、pCAMBIA1300-cLUC-MdMYB87載體構(gòu)建圖；B.LUC基因表達(dá)情況。圖4 BIFC驗(yàn)證MdMKK9與MdMYB87互作Fig.4 The interaction between MdMKK9 and MdMYB87 by BIFC verification

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)的互作及互作研究具有十分重要的生物學(xué)意義，在細(xì)胞接受內(nèi)外源信號、通過信號途徑調(diào)節(jié)基因表達(dá)、保持植物生物學(xué)特性的過程中，蛋白質(zhì)都占有重要地位，且大部分的蛋白質(zhì)是通過與伴侶分子或其他的蛋白質(zhì)復(fù)合物一起發(fā)揮作用。因此，我們需要通過酵母雙雜技術(shù)篩選出蛋白質(zhì)的互作蛋白，用來更好的研究蛋白質(zhì)單體、復(fù)合物的功能以及細(xì)胞生物學(xué)活性。

本試驗(yàn)以MdMKK9作為誘餌蛋白，提取了‘黛紅’及‘新疆4號’果實(shí)RNA構(gòu)建紅肉蘋果cDNA文庫，通過篩選MdMKK9在紅肉蘋果中的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)了與抗逆相關(guān)的基因MdMYB87。在近期的研究中：張順倉等[11]研究發(fā)現(xiàn)SmMYB87蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均有分布，在根、莖、葉和花中均有表達(dá)，該基因通過介導(dǎo)丹參對生物或非生物脅迫的響應(yīng)來調(diào)控其有效成分的積累；嵌合抑制因子MYB87的組成性表達(dá)會抑制多個(gè)器官的縱向、徑向生長，通過細(xì)胞壁組織和重塑調(diào)控?cái)M南芥的形態(tài)發(fā)生[12]；生物序列的相似性搜索(basic local alignment search tool,BLAST)分析表明，在擬南芥中，包含MYB36、MYB37、MYB38、MYB68、MYB84和MYB87的R2R3Myb基因亞群與番茄(blind-like1,Bl)基因的相似性最高，番茄Bl基因編碼一種R2R3Myb轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子在營養(yǎng)和生殖發(fā)育期間對腋生分生組織起始的調(diào)節(jié)中起著核心作用[13]；對擬南芥根細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，得出了形成層表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因包括短營養(yǎng)期(short vegetative period,SVP)、花瓣損失(petal loss,PTL)和MYB結(jié)構(gòu)域87(MYB87)，在擬南芥中，位于形成層的維管干細(xì)胞在次生生長過程中不斷自我更新和分化，干細(xì)胞持續(xù)進(jìn)行細(xì)胞增殖，并產(chǎn)生傳導(dǎo)性組織，持續(xù)的干細(xì)胞活動(dòng)依賴于細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化之間的嚴(yán)格平衡[14]。

通過酵母雙雜交及BiFC最終驗(yàn)證MYB87與MdMKK9互作。但MdMYB87對MdMKK9在響應(yīng)逆境脅迫花青苷合成的途徑中的調(diào)控功能尚不清楚，有待進(jìn)一步展開研究。