劉敏，孫鵬，張彥彬，冷露，潘慶杰，董煥聲

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東濰坊 261061)

近年來，在豬生產(chǎn)中人工授精技術(shù)的應(yīng)用變得愈發(fā)普遍。衡量公豬繁殖力的指標(biāo)有精液品質(zhì)與精子體外的受精能力[1]，最主要的衡量指標(biāo)當(dāng)屬精液品質(zhì)。精子活力和精子形態(tài)這兩項指標(biāo)決定精液品質(zhì)的優(yōu)良程度，在精液常規(guī)指標(biāo)中最能反映出精液質(zhì)量與受精能力[2]。精子活力作為精子受精能力的中心指標(biāo)能充分顯示出豬的繁殖性能。在現(xiàn)代生產(chǎn)中，新鮮精液的精子活力低、畸形率高成了公豬繁殖力低的主要原因。盡管在生產(chǎn)中可以輸入更多數(shù)目的精子來提高由于精子活力低或畸形率高形成的母豬受胎率降低等問題，但提升精液品質(zhì)的首要目標(biāo)仍是提高公豬精子的活力[3]。

睪丸曲細(xì)精管上皮的重要組成部分為支持細(xì)胞，支持細(xì)胞為發(fā)育中的雄性生殖細(xì)胞提供了環(huán)境與營養(yǎng)的輔助作用，另外還擁有非常重要的分泌功能。支持細(xì)胞分泌的一種旁分泌因子——乳酸，其功能是調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的發(fā)育[4]。睪丸支持細(xì)胞可通過糖酵解的方式將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，因為粗線期精母細(xì)胞和圓形精子的首選代謝底物為乳酸，所以乳酸對于生殖細(xì)胞來說極為重要。Alves等[5]稱糖尿病會使得支持細(xì)胞的乳酸代謝失衡并使得支持細(xì)胞與生精細(xì)胞之間的代謝平衡紊亂，最后會使精子活力降低并導(dǎo)致其生殖能力下降。徐蕊等[6]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸支持細(xì)胞分泌的雄激素結(jié)合蛋白缺乏將會導(dǎo)致大鼠進行性不育。由此可見，睪丸支持細(xì)胞的分泌物會影響雄性動物的生殖能力。目前利用體外添加豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液的技術(shù)鮮少有人研究，所以本試驗以豬精子為研究對象，在體外條件下向豬精液中添加豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液，并通過計算機輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)測定其對精子活力的影響，為提高豬體外授精效率提供新的方式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 豬睪丸與豬精液的獲取

本試驗所用精液購自即墨市某種公豬站，試驗所用豬睪丸取自即墨某豬場健康去勢仔豬。

1.1.2 試驗試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、胰蛋白酶均購于Thermo公司；膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶購自Sigma公司；D NaseI購自上海生工公司；胎牛血清購自Gibco公司；培養(yǎng)皿、離心管均購自Corning公司；PBS緩沖液購自Solarbio公司。

1.1.3 試驗器材

體視顯微鏡(Nikon SMZ-1000)，高速離心機(Eppendorf)，自動高壓蒸汽滅菌器(SANYO)，精子分析儀(SCA)，超凈工作臺(哈東聯(lián))，精子采集板(Barcelona)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬睪丸支持細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

將豬睪丸組織放入培養(yǎng)皿中，在PBS緩沖液中去除白膜及表面血管，并用PBS洗滌3次；加入0.1%膠原酶Ⅳ 1 mL和透明質(zhì)酸酶1 mL置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中消化5 min后終止消化，1 200 r/min離心5 min，棄上清；加1 mL胰酶和1 mL DNase酶吹打混勻，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中消化4 min，每隔2 min用手劇烈震蕩一次，加入等體積培養(yǎng)液終止消化，依次通過80目、200目及300目細(xì)胞篩過篩得到細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心5 min，棄上清液；加入新的培養(yǎng)液，分皿，置于培養(yǎng)箱，2 h后棄上清液，加入PBS洗滌3次，加入新的培養(yǎng)液培養(yǎng)；10 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液的獲取方法

將分離培養(yǎng)的豬睪丸支持細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，48 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞呈梭形且基本鋪滿6 cm培養(yǎng)皿時開始收集培養(yǎng)液至離心管中，每隔24 h收集1次，-20 ℃保存。

1.2.3 精子活力分析

利用精子分析儀和精子活力檢測板測定對照組和培養(yǎng)液組精子活力。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計分析軟件SPSS進行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗的統(tǒng)計方法，參數(shù)設(shè)置為：P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬睪丸支持細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

如圖1所示，豬睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)后2 h貼壁生長，形狀呈圓形(圖1A)，10 h后逐漸呈三角形(圖1B)，60 h后細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隙縮小(圖1C)。

圖1 豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)圖(200×) Fig.1 Porcine testis Sertolicular cell culture diagram (200×)

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)不同時間后培養(yǎng)液對精子活力的影響

由圖2所示：將睪丸支持細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，分別間隔1 h、8 h和24 h獲取其細(xì)胞培養(yǎng)液，使用精子分析儀測量對照組與培養(yǎng)液組精子活力。結(jié)果為間隔1 h獲取的細(xì)胞培養(yǎng)液使精子活力提高最多，為47.47%±0.53%，顯著高于對照組39.63%±0.94%(P<0.01)，間隔8 h培養(yǎng)液組的精子活力41.43%±0.93%，與對照組的差異不顯著，間隔24 h培養(yǎng)液組的精子活力43.63%±0.80%，與對照組差異不顯著。

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)不同時間獲得的培養(yǎng)液對精子活力的影響Fig.2 The effect of culture medium obtained at different time of cell culture on sperm motility注：與對照組相比，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3 睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液對精子活力的影響

根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，精子運動分為4個等級：a級表示精子快速直線前向運動，直線運動(紅色)；b級表示精子緩慢或呆滯向前移動，緩慢運動(綠色)；c級表示精子非向前運動，原地運動(藍(lán)色)；d級表示精子不能活動，不運動(黃色)。

試驗分為對照組與培養(yǎng)液組，使用精子分析儀測定精子的前進性、速度值以及WHO標(biāo)準(zhǔn)所測得的運動情況，對精子活力進行比較。由圖3與表1所示：快速向前運動的精子由8.8%±0.28%增加到11.9%±0.35%，慢速向前運動的精子由35.5%±1.03%增加到39.0%±1.07%，極慢或不動的精子數(shù)量由31.6%±2.73%下降到24.8%±1.35%。精子活力由44.3%±1.06%增加到50.9%±2.44%，差異極顯著。

A.對照組檢測圖像；B.培養(yǎng)液組檢測圖像。圖3 睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液對精子活力的影響 Fig.3 The effect of Sertoli cell culture medium on sperm motility

表1 根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)測定精子活力Table 1 Determination of sperm motility according to WHO standard

2.4 精子活力差異性分析

由圖4所示：利用SPSS軟件統(tǒng)計分析得出結(jié)論：培養(yǎng)液組精子活力為50.9%±2.44%，顯著高于對照組44.3%±1.06%(P<0.01)。

圖4 精子活力的差異性分析圖Fig.4 Analysis of differences in sperm motility注：與對照組相比，**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

由于精子正常的運動能力可以使得受精過程順利進行，所以正確評估精子活力具有非常重要的意義。據(jù)文獻(xiàn)報道在大鼠常規(guī)運動的精子中發(fā)現(xiàn)無活力的精子不具有受精能力，在人和其他物種中，精子活力下降也會導(dǎo)致生殖能力降低[7]。對于死精子癥，精子活力低，在導(dǎo)致雄性不育的精液異常中所占比例約15%，內(nèi)分泌異常、附睪功能受損以及精漿酸堿度異常、精子營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、生殖道感染等原因都會引起精漿質(zhì)量的下降[8]。正常精子的生存能力和受精能力的指標(biāo)之一就是具有足夠數(shù)目的前進運動的精子，另外其精子活力也與雌性受胎率密切相關(guān)，所以本試驗使用計算機輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)對豬精子活力進行了檢測并利用睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液對豬精子質(zhì)量進行提升。

支持細(xì)胞可以通過其強大的分泌功能發(fā)揮它的調(diào)節(jié)作用。譚琨等[9]指出成熟支持細(xì)胞的數(shù)量與精子總數(shù)呈正比，而且它們在形態(tài)和功能上相輔相成，這說明睪丸支持細(xì)胞分泌物濃度對精子的品質(zhì)有一定影響。這與本試驗中豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)1 h后獲取的培養(yǎng)液對精子活力的影響顯著高于對照組一致。Marh等[10]將小鼠精母細(xì)胞與支持細(xì)胞共培養(yǎng)，可以讓早期的生殖細(xì)胞產(chǎn)生具有受精能力的精子，間接證明支持細(xì)胞的分泌物可促進生殖細(xì)胞的增值與分化。

在豬的繁育方面我國的繁育人員一直在努力提高豬的生產(chǎn)能力及其所能產(chǎn)生的經(jīng)濟效益。對于豬的稀釋液來說，主要分為兩種：含緩沖鹽的稀釋液與不含緩沖鹽的稀釋液。含緩沖鹽的冷凍稀釋液主要包括以下類型：甘氨酸-磷酸和葡萄糖-磷酸、卵黃-葡萄糖-檸檬酸。Yesth[11]稱,精子在代謝過程中產(chǎn)生的某種物質(zhì)會使稀釋液中的pH值產(chǎn)生變化,這會對精子發(fā)生產(chǎn)生不利影響,而含緩沖鹽的冷凍稀釋液中的檸檬酸、甘氨酸-磷酸等緩沖物質(zhì)可將精液pH值調(diào)整為適宜的偏堿性環(huán)境,這種含有緩沖鹽的稀釋液對于精液有一定的保護作用。豬精液稀釋液的另一組成成分是冷凍保護劑。Zeng等[12]研究結(jié)果顯示,2%和3%的GLY具有最佳的抗細(xì)胞凋亡作用,且B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2及其同源蛋白的表達(dá)對精子凋亡來說影響較大。在本試驗中，向豬精子體外添加睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液可使精子活力提高，說明支持細(xì)胞的分泌物可促進精子的活力，這可能是支持細(xì)胞分泌的酶類或生長因子對精子活力起了關(guān)鍵作用，但具體的機理有待進一步探究。

4 結(jié)論

本試驗利用在體外添加豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液的方式提高了精子活力，探究出一種提升豬人工授精效率的新方法，利用這種新方法可充分發(fā)揮優(yōu)良種公豬的遺傳潛力,減少種公豬養(yǎng)殖成本,提高其品質(zhì)培育改良水平,降低傳播疾病的概率。本試驗中豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液能夠提高豬精子活力的機制雖有很多不同觀點，但具體機制有待繼續(xù)探究和探討。