陳瑤， 虞冰， 馬婧妤， 朱文剛， 劉莉*

(1.金華市婺城區(qū)農業(yè)農村局，浙江 金華 321017； 2.浙江省金華市農產品質量安全中心，浙江 金華 321017)

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，FQs)是一類全合成廣譜抗菌藥，廣泛用于人和動物的疾病治療[1-2]。FQs長期使用會在動物體內蓄積，影響到人類的健康，對人體的心血管系統(tǒng)及中樞神經系統(tǒng)造成不良影響，可導致呼吸肌無力，重癥肌無力，甚至危及生命[3]。動物性食品中低濃度的FQs殘留易產生耐藥性菌株，致使有效使用劑量增加[4-6]。文獻報道的FQs檢測方法主要集中在環(huán)境和食品方面，有微生物法、酶聯(lián)免疫吸附法、毛細管電泳法和高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯(lián)用等[7-11]。

本文借鑒標準規(guī)定和相關文獻的前處理方法，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)用于同時測定禽蛋中8種FQs殘留，針對禽蛋試樣的前處理、高效液相色譜和質譜的檢測條件進行優(yōu)化，為FQs殘留檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

鴨蛋采購于金華市各地市養(yǎng)殖企業(yè)。

依諾沙星(純度為97.51%)、氧氟沙星(純度為99.30%)、諾氟沙星(純度為99.10%)、培氟沙星(純度為99.00%)、環(huán)丙沙星(純度為99.30%)、沙拉沙星(純度為97.70%)、達氟沙星(純度為94.90%)、恩諾沙星(純度為99.90%)(標準品，北京振翔科技有限公司)。無水硫酸鈉、正己烷均為分析純；乙腈、甲酸為色譜純。實驗用水(一級水，電阻率為17.65 MΩ·cm)。

1.2 儀器

LC-MS/MS 8050超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀(日本島津公司)；CF6RN高速離心機(日本日立公司)；BSA2202S電子天平(德國賽多利斯公司)；BSA224S電子天平(德國賽多利斯公司)；T25渦旋振蕩器(德國IKA)；氮吹儀(Organomation)；HY-4調速多用振蕩器(金壇盛藍)；T6L-16G臺式離心機(上海安亭)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Shim-packGISS(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流動相：A相為0.2%甲酸水溶液，B相為乙腈/甲醇(6∶4)；流速為0.4 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量為1 μL；洗脫方式為梯度洗脫，B相初始濃度為10%。梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜流動相洗脫條件

1.3.2 質譜條件

離子化模式為ESI(+)；源溫度為300 ℃；DL溫度250 ℃；加熱氣為空氣，10.0 L·min-1；加熱模塊溫度400 ℃；霧化氣為氮氣，3.0 L·min-1；掃描模式為多反應監(jiān)測(MRM)；干燥氣為氮氣10.0 L·min-1；延遲時間為3 ms；碰撞氣為氬氣。FQs監(jiān)測離子對、碰撞能參數見表2。

表2 8種氟喹諾酮類獸藥定性定量離子參數

1.3.3 儲備液的配制

稱取諾氟沙星(純度為99.10%)、氧氟沙星(純度為99.30%)、環(huán)丙沙星(純度為99.30%)、恩諾沙星(純度為99.90%)、培氟沙星(純度為99.00%)各10.00 mg，稱取依諾沙星(純度為97.51%)10.225 mg，達氟沙星(純度為94.90%)10.537 mg，將所稱獸藥標準品分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容。各吸1 mL(1 mg·mL-1)至25 mL容量瓶中得40 μg·mL-1氟喹諾酮類獸藥混和標準溶液，逐級稀釋至100 ng·mL-1氟喹諾酮類混標溶液。

1.3.4 樣品前處理

稱取(已勻漿)2.00 g禽蛋樣品于50 mL離心管中，加入2 g無水硫酸鈉。加入4 mL酸化的乙腈(甲酸∶乙腈1∶99，體積比)溶液，渦旋混勻，超聲3 min，在4 ℃下，轉速4 000 r·min-1離心5 min。將上層液(乙腈)轉移至50 mL離心管中，下層液再用4 mL酸化乙腈重復提取一次，合并至離心管。提取液中加入10 mL乙腈飽和的正己烷溶液，振蕩凈化5 min，棄去上層正己烷。再重復凈化一次。乙腈層氮氣吹干。準確加入1 mL乙腈溶解，超聲，渦旋混勻，再加入1 mL純凈水超聲，渦旋混勻，轉移至5 mL離心管，10 000 r·min-1離心5 min，過0.22 μm濾膜，待測定。

1.3.5 結果計算

按公式(1)計算氟喹諾酮類獸藥殘留量。

X=cV/m。

(1)

式中：X為樣品中待測組分的含量(μg·kg-1)；c為測定液中待測組分的濃度(ng·mL-1)；V為定容體積(mL)；m為樣品稱樣量(g)。

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件

FQs結構含有羧基和哌嗪基，屬于兩性化合物，酸性的流動相有利于FQs形成較好的峰形[12]。本實驗中以0.2%的酸性乙腈有利于峰形的改善，出峰效果好，峰形的毛刺和拖尾現象明顯減少。FQs化學結構較為相似，采用0.2%的甲酸乙腈溶液使得各氟喹諾酮藥物的保留時間較為理想，與干擾峰之間的分離效果好，符合檢測要求。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

8種FQs目標化合物的準分子[M+H]+提取總離子色譜圖(圖1)。

a～i依次代表依諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、達氟沙星、恩諾沙星8種氟喹諾酮的總離子色譜圖。

2.3 提取與凈化條件的優(yōu)化

參照文獻和標準，針對FQs結構的兩性特征，加酸和加堿都能提升FQs的溶解度。對于禽蛋而言，單純使用乙腈提取，容易造成蛋白質沉淀，影響提取效果。當使用1%甲酸酸化的乙腈溶液對禽蛋進行提取時，禽蛋中蛋白質不易沉淀，同時氟喹諾酮類藥物在酸化的乙腈中溶解度提高，提取液中的水分降低，提高檢測的回收率。

按照《農業(yè)部781號公告6—2006雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的量的測定高效液相色譜法》中的方法，實驗結果回收率較低，很多文獻也有報道[12]。采用GB/T 21312—2007《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》中禽蛋的檢測方法進行檢測，也無法得到符合要求的結果。本實驗采用乙腈飽和的正己烷溶液萃取，有效降低了正己烷對氟喹諾酮的吸附。這與楊嘉偉等[13]實驗結果一致。C18固相萃取柱對氟喹諾酮也有一定的吸附，改為氮吹近干，可以有效提高氟喹諾酮類藥物的回收率。

2.4 標準曲線、線性范圍和檢出限

取適量的標注儲備液，用流動相初始溶液對8種氟喹諾酮類藥物標準儲備液進行稀釋，形成系列濃度為2、5、8、10、20、50 ng·mL-1的標準工作溶液。濃度從低到高依次進樣測定，每一濃度進樣3次，以離子色譜峰面積為縱坐標及其相應的溶液濃度為橫坐標作圖，得到相應氟喹諾酮類藥物的標準曲線。8種氟喹諾酮類在2～50 ng·mL-1的濃度范圍內，呈良好的線性關系。將適量的標準工作溶液加到空白禽蛋中，按照1.3的實驗方法處理以后，用UPLC-MS/MS檢測。通過計算得到本實驗方法檢出限(LOD，S/N>3)，定量限(LOQ，S/N>10)。線性回歸方程、相關系數、檢出限、定量限見表3。

表3 8種氟喹諾酮類藥物標準曲線及相關系數

2.5 方法的精密度和回收率實驗

量取1 mg·L-1對照標準溶液40、80、100 μL加到2 g樣品中，形成20、40、50 ng·kg-1低、中、高3個添加濃度，每個濃度3個平行，每份樣品測定3次，結果取平均值，計算8種氟喹諾酮類獸殘的回收率和相對標準偏差(RSD)(表4)。

由表4可知，禽蛋中8中氟喹諾酮類獸藥添加樣品的回收率在70.25%～113.67%，標準偏差在12.00%范圍內?；厥章首畹偷氖嵌髦Z沙星，回收率偏低的原因，可能是由于樣品基質干擾影響。

表4 禽蛋中8中氟喹諾酮類獸藥回收率和標準偏差

3 小結

本文建立禽蛋中8種氟喹諾酮類獸藥殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)測定方法。該方法與普通液相色譜法和液相色譜-質譜/質譜國標法相比較，定性定量更準確，檢測速度提升，分離時間縮短，方法的靈敏度和分離度以及重現性較好，穩(wěn)定性高，滿足禽蛋中氟喹諾酮類藥物殘留分析的檢測要求，同時溶劑用量大為減少，分析成本降低，檢測效率得到提升。該方法經系統(tǒng)方法驗證和禽蛋中氟喹諾酮殘留量例行監(jiān)測應用驗證，方法準確可靠，可以用來監(jiān)測禽蛋中8種氟喹諾酮類藥物的殘留量。