張 蒙，黃容琴

(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203)

1 前 言

納米顆粒已被廣泛用于提高藥物的治療效果，然而大量研究證明，納米顆粒對生物體具有毒性作用[1, 2]。此外，藥物遞送過程中的生物屏障阻止了納米藥物載體在病灶部位的累積，從而限制了藥物治療的效果。據(jù)報(bào)道[3]，到達(dá)腫瘤的納米藥物通常是靜脈注射劑量的1%，大多數(shù)納米藥物通過非特異性攝入而沉積在肝臟和脾臟中，從而引起副作用。因此，納米顆粒在臨床轉(zhuǎn)化中面臨許多挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)激發(fā)了研究者對新型藥物遞送載體的探索。

細(xì)胞具有感知、整合和響應(yīng)體內(nèi)動(dòng)態(tài)環(huán)境的自然能力，可以作為治療藥物的載體。最近的相關(guān)研究主要集中在利用天然細(xì)胞或細(xì)胞來源的衍生物作為藥物載體，包括整個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞外囊泡和外泌體等。在體內(nèi)注射游離蛋白質(zhì)和治療藥物之后通常會引起免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，從而使之在血液中被迅速清除[4]。而使用活細(xì)胞作為藥物載體，藥物被包裹在細(xì)胞內(nèi)或附著在細(xì)胞表面，隨后通過體液運(yùn)輸?shù)讲≡畈课?。?xì)胞的內(nèi)包封可以改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征，或顯著增加藥物對病理?xiàng)l件區(qū)域的靶向性[5]。同時(shí)，細(xì)胞及其衍生物能夠逃離機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，使其負(fù)載的藥物能夠在體內(nèi)持續(xù)存在，從而達(dá)到比天然或合成藥物更好的預(yù)期效果[6, 7]。綜上，由于活細(xì)胞及其衍生物具有較好的生物相容性、天然的靶向組織能力、固有的生物降解性、較高的載藥能力和天然的跨越生物屏障能力，利用活細(xì)胞及其衍生物進(jìn)行藥物遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)已經(jīng)成為藥物遞送領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究方向。

2 基于活細(xì)胞的藥物遞送系統(tǒng)

人體含有多種具有不同生理功能的細(xì)胞，在保留細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)藥物在體內(nèi)的高效遞送，是研究人員不斷探索的方向。近年來，細(xì)胞藥物載體如免疫細(xì)胞、無核細(xì)胞(紅細(xì)胞和血小板)、干細(xì)胞和細(xì)菌等已成為研究的熱點(diǎn)。本節(jié)總結(jié)了不同活細(xì)胞作為藥物分子和生物活性蛋白遞送載體的研究進(jìn)展，并討論了它們的優(yōu)缺點(diǎn)。

2.1 免疫細(xì)胞

免疫細(xì)胞作為參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞群，在人體免疫中擔(dān)任著重要的角色。免疫細(xì)胞在接收到來自損傷組織的信號后遷移到感染組織處，可以有效抵御病原體。此外，免疫細(xì)胞自身不會引起不良的免疫反應(yīng)，具有優(yōu)越的生物相容性，與正常細(xì)胞的相互作用小，可以主動(dòng)靶向特定細(xì)胞和位點(diǎn)[8, 9]。因此，免疫細(xì)胞是有潛力的藥物遞送載體。

2.1.1 巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞是人體吞噬細(xì)胞的一種，主要由白細(xì)胞產(chǎn)生，主要作用是清除損傷部位的外來碎片和細(xì)胞。由于巨噬細(xì)胞具有穿過血腦屏障和自然歸巢的能力[10]，因而在靶向和治療神經(jīng)退行性疾病、炎癥和癌癥等疾病方面具有顯著優(yōu)勢[11]。盡管如此，巨噬細(xì)胞作為遞藥載體仍然存在不足，比如巨噬細(xì)胞是活細(xì)胞，大量的藥物或納米顆粒中的藥物可能會干擾細(xì)胞的存活、遷移和功能，從而限制了藥物的負(fù)荷量。此外，巨噬細(xì)胞具有吞噬作用，該過程會釋放酶和酸來殺死和消化病原體[9]。在負(fù)載藥物之后，巨噬細(xì)胞會快速消化大多數(shù)藥物載體，降解藥物，從而降低藥物的釋放和療效。Dai等以巨噬細(xì)胞為模板，設(shè)計(jì)出功能化的“細(xì)胞機(jī)器人”，利用巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將磁性納米粒子、阿霉素(DOX)和吲哚菁綠等組成的顆粒富集到細(xì)胞內(nèi)部，組成細(xì)胞機(jī)器人，以提高載藥效率，并且可以被外界磁場驅(qū)動(dòng)。在外磁場和近紅外光(NIR)的作用下，該細(xì)胞機(jī)器人可以被精準(zhǔn)控制到達(dá)靶向位置，釋放DOX，并在靶向位置對腫瘤進(jìn)行殺傷[9]。

快速的精準(zhǔn)靶向和多手段輔助的精準(zhǔn)釋藥可以提高巨噬細(xì)胞載藥體系的治療效果。2021年，Nguyen等[12]開發(fā)了一種基于巨噬細(xì)胞的雙靶向的微型機(jī)器人，該微型機(jī)器人的構(gòu)建方法是將檸檬酸包被的超順磁性納米顆粒(CA-MNPs)和含DOX的熱敏納米脂質(zhì)體(DOX-TSLPs)共同負(fù)載到巨噬細(xì)胞中。將巨噬細(xì)胞本身的趨化性和外部磁場調(diào)節(jié)的磁靶向相結(jié)合，可以使之快速靶向到腫瘤部位。同時(shí)，磁性納米顆粒響應(yīng)NIR照射，觸發(fā)熱敏納米脂質(zhì)體釋放DOX，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了在腫瘤部位精確的時(shí)空控制藥物的釋放(圖1)。因此，以上基于巨噬細(xì)胞的多手段輔助的精準(zhǔn)遞藥系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)化成優(yōu)良的臨床藥物輸送平臺，并在腫瘤靶向治療中發(fā)揮巨大的作用。

圖1 基于巨噬細(xì)胞的微型機(jī)器人抗癌治療原理示意圖[12]：(a)由脾細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞負(fù)載到檸檬酸包被的超順磁性納米粒子(CA-MNP)和含DOX的熱敏納米脂質(zhì)體(DOX-TSLP)組成的微型機(jī)器人制備過程示意圖，(b)腫瘤細(xì)胞釋放的電磁場和化學(xué)梯度將微型機(jī)器人吸引到腫瘤部位，然后通過近紅外介導(dǎo)的藥物釋放破壞靶向的腫瘤細(xì)胞Fig.1 Schematic representation of the macrophages-based microrobot working principles as an antic ancer therapy[12]: (a) schematic diagrams of microrobots composed of splenocyte-derived macrophages loaded with superparamagnetic nanoparticles coated with citric acid (CA-MNPs) and DOX-containing thermosensitive nanoliposomes(DOX-TSLPs), (b) microrobots are attracted to the tumor site by an electromagnetic field and chemical gradients released by tumor cells, then the targeted tumor cells are destroyed by the NIR-mediated drug release

2.1.2 T細(xì)胞

T細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一部分，可以特異性識別抗原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答。同時(shí)，由于其較高的特異性，T細(xì)胞也是具有較高靶向性的一類細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞遇到其各自的抗原時(shí)，T細(xì)胞受體會使細(xì)胞表面還原電位增加，該信號使細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞凋亡[13]。與抗原特異性結(jié)合后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的這一過程，使T細(xì)胞在攜帶靶向藥物和消除腫瘤方面具有優(yōu)勢。例如，T細(xì)胞作為一種免疫細(xì)胞，具有直接殺傷靶細(xì)胞的生物學(xué)功能，因此T細(xì)胞能夠穿過血腦屏障并利用自身的細(xì)胞毒性殺死顱內(nèi)腫瘤[14]。此外，T細(xì)胞還能夠不受限制地接觸其他全身性疾病細(xì)胞，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)和癌癥(如黑色素瘤)，這使得T細(xì)胞作為生物載體具有獨(dú)特的優(yōu)勢[14-16]。

近年來，使用嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞(CAR-T)的過繼性細(xì)胞療法顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤免疫能力，首先將編碼這種CAR的基因?qū)攵拘訲細(xì)胞，然后經(jīng)過基因編輯的T細(xì)胞利用它們表達(dá)的CAR受體結(jié)合到靶細(xì)胞表面的分子，此種結(jié)合可觸發(fā)免疫系統(tǒng)的分子(如白細(xì)胞介素-15超激動(dòng)劑(IL-15Sa)、B細(xì)胞)激活，產(chǎn)生促進(jìn)組織損傷的抗體，從而實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞的快速摧毀。Tang等[17]

設(shè)計(jì)了“背包”納米凝膠，在腫瘤靶向T細(xì)胞膜上偶聯(lián)蛋白質(zhì)藥物，只有當(dāng)CAR-T細(xì)胞與癌細(xì)胞結(jié)合并啟動(dòng)T細(xì)胞表面氧化還原活性時(shí)，才會釋放蛋白質(zhì)藥物(圖2a)。研究發(fā)現(xiàn)，從納米凝膠中釋放的IL-15Sa蛋白質(zhì)藥物促進(jìn)了T細(xì)胞的擴(kuò)增(數(shù)量增加16倍)，從而加速腦膠質(zhì)瘤的抑制和清除。

作為臨床上的新型細(xì)胞療法，盡管CAR-T療法在癌癥的免疫治療中取得了成功，但一些挑戰(zhàn)仍然限制了CAR-T細(xì)胞治療癌癥的療效，包括脫靶毒性、抗原丟失和異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境免疫抑制、T細(xì)胞浸潤和滲透不足等[16]。CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷主要是通過誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)。以黑色素瘤為例，黑色素瘤細(xì)胞中具有高水平的抗凋亡蛋白，因此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是極其困難的。已經(jīng)有研究表明，黑色素瘤細(xì)胞的凋亡失敗(即凋亡失敗后存活的黑色素瘤細(xì)胞)會導(dǎo)致細(xì)胞粘附、趨化性增強(qiáng)，增加了黑色素瘤的遷移和侵襲[18]。因此，在遞藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)時(shí)，使用CAR-T細(xì)胞和靶向抗凋亡信號通路的藥物聯(lián)合治療也可能是一個(gè)有用的解決方案。

2.1.3 中性粒細(xì)胞

中性粒細(xì)胞是人體含量最豐富的白細(xì)胞(占外周血循環(huán)中總白細(xì)胞的50%～70%)，是感染和腫瘤發(fā)生期間炎癥部位招募的主要細(xì)胞類型，這也說明了中性粒細(xì)胞可能可以用于炎癥和癌癥的納米治療[19, 20]。以中性粒細(xì)胞為基礎(chǔ)的給藥系統(tǒng)有望克服納米治療諸如生物相容性低、循環(huán)時(shí)間短和納米材料的免疫原性等局限性，在癌癥治療方面顯示出巨大的潛力。

腫瘤的發(fā)生過程總是伴隨著炎癥，藥物搭載中性粒細(xì)胞的“便車”可以自然地實(shí)現(xiàn)在腫瘤處的蓄積。Chu等發(fā)現(xiàn)，白蛋白納米?？梢栽谥行粤＜?xì)胞原位(即血液循環(huán)期間)搭“便車”，將治療藥物帶到腫瘤病灶區(qū)[21]。黑色素瘤gp75抗原的單克隆抗體TA99可以啟動(dòng)腫瘤中性粒細(xì)胞的募集，因此中性粒細(xì)胞可以介導(dǎo)與TA99抗體共注射的白蛋白納米粒在腫瘤處的累積。他們進(jìn)一步制備了光敏劑(焦脫鎂葉綠酸-a)負(fù)載白蛋白納米粒和TA99(TA99/Ppa BSA NPs)，與使用白蛋白納米?；騎A99治療相比，同樣在660 nm激光照射下，TA99/Ppa BSA NPs顯著抑制了腫瘤的生長并提高了小鼠存活率。這項(xiàng)研究提出了一種治療癌癥的新途徑，即通過納米?！按钴嚒泵庖呦到y(tǒng)來增強(qiáng)治療藥物向腫瘤部位的輸送。

此外，中性粒細(xì)胞具有穿越血腦屏障并穿透膠質(zhì)瘤部位的天然能力[22]。Zhang等將攜帶含有紫杉醇(paclitaxel, PTX)的脂質(zhì)體(PTX-CL)裝載到中性粒細(xì)胞(neutrophils, NEs)中(PTX-CL/NEs)[23]，在小鼠腦膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)試驗(yàn)中，腫瘤切除后釋放的炎癥因子引導(dǎo)載藥的中性粒細(xì)胞進(jìn)入發(fā)炎的大腦(圖2b)。大腦中高度集中的炎癥信號觸發(fā)PTX-CL從中性粒細(xì)胞中釋放，從而將PTX輸送到侵襲細(xì)胞中。這種中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的藥物遞送有效減緩了腫瘤的復(fù)發(fā)生長，顯著提高了小鼠的生存率。在中性粒細(xì)胞中引入功能性納米藥物可能是改善復(fù)雜條件下納米治療的一種有前景的策略。

圖2 蛋白質(zhì)納米凝膠合成以及CAR-T細(xì)胞響應(yīng)局部微環(huán)境釋放蛋白質(zhì)的示意圖(a)[17]；中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的抗癌藥物遞送抑制膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的方案設(shè)計(jì)，PTX-CL/NEs制備示意圖和PTX-CL/NEs抑制小鼠術(shù)后膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的示意圖(b)[23]Fig.2 Scheme forprotein nanogels synthesis and for release of protein in response to reduce activity in the local microenvironment (a)[17]; schematic design of neutrophil-mediated anticancer drug delivery for the suppression of postoperative glioma recurrence， the preparation of PTX-CL/NEs and the schematic shows how PTX-CL/NEs suppress postoperative glioma recurrence in mice (b)[23]

2.2 無核細(xì)胞

紅細(xì)胞和血小板由造血干細(xì)胞產(chǎn)生，是血液循環(huán)系統(tǒng)的獨(dú)特組成部分，因?yàn)樗鼈儧]有細(xì)胞核和遺傳信息，因此沒有異常生長或致瘤轉(zhuǎn)化的固有風(fēng)險(xiǎn)。相較于向體內(nèi)注射游離蛋白質(zhì)會引起快速的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)從血液中被快速清除，紅細(xì)胞和血小板可以在血液中不受阻礙地循環(huán)幾天，在藥物遞送方面具有顯著優(yōu)勢?？梢酝ㄟ^將治療分子裝在細(xì)胞內(nèi)(細(xì)胞內(nèi)包裹)或附著到細(xì)胞表面(表面修飾)來實(shí)現(xiàn)藥物遞送。

2.2.1 紅細(xì)胞

紅細(xì)胞也被稱為紅血球，是人體內(nèi)數(shù)量最多的血細(xì)胞類型，具有良好的生物相容性、可調(diào)的負(fù)荷能力和較長的血液循環(huán)半衰期(人類紅細(xì)胞的半衰期約為120 d)。紅細(xì)胞具有完全的生物降解性，沒有任何毒性副產(chǎn)物，在使用紅細(xì)胞負(fù)載藥物時(shí)，在循環(huán)遞送過程中可以使生物體免受毒副作用。紅細(xì)胞除了具有雙凹形狀和較高的表面積之外，還不具有細(xì)胞核和許多細(xì)胞器，這些獨(dú)特的性質(zhì)為細(xì)胞的藥物裝載和表面改性提供了足夠的空間。一些納米顆粒在肝臟、脾臟的積蓄，可能會對機(jī)體產(chǎn)生長期毒性，這限制了其臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。近期有研究表明，將納米藥物顆粒負(fù)載在紅細(xì)胞中，可以減少許多單核吞噬系統(tǒng)器官(如肝和脾)對納米顆粒的攝取[24]。并且，表達(dá)于紅細(xì)胞表面的CD47蛋白質(zhì)可以向免疫系統(tǒng)發(fā)出信號，以避免紅細(xì)胞被巨噬細(xì)胞攝取[25]，便于藥物裝載到紅細(xì)胞表面或其內(nèi)部。此外，CD47還具有延長藥物在血液中循環(huán)時(shí)間的作用[26]。

細(xì)胞內(nèi)的藥物負(fù)載可以為藥物的封裝提供一個(gè)免疫特權(quán)環(huán)境，從而增加其循環(huán)時(shí)間。實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)包封的一種方法是將紅細(xì)胞置于低滲溶液中，誘導(dǎo)細(xì)胞膜上的孔洞(尺寸15～100 nm)暫時(shí)性地打開，這樣藥物分子就可以進(jìn)入細(xì)胞，當(dāng)切換到等滲環(huán)境，這些孔洞就會關(guān)閉，從而將藥物分子包裹在細(xì)胞內(nèi)[27]。利用該方法，Dumont等成功地將抗炎和免疫抑制的前藥分子(地塞米松的前藥地塞米松磷酸鈉)包裹在紅細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了炎癥性腸病囊性纖維化和共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥的臨床治療[27]。

此外，藥物也可以搭載紅細(xì)胞的“便車”到達(dá)靶部位，即在紅細(xì)胞外部連接大分子藥物。為了將“紅細(xì)胞便車”靶向特定的器官，Brenner等將納米載體(脂質(zhì)體或白蛋白)在體外吸附到紅細(xì)胞(red blood cell, RBC)上(RBC-NPs)[28]，向小鼠的動(dòng)脈(intra-arterially, IA)內(nèi)注射RBC-NPs，使藥物在下游器官中積累，以治療心臟病發(fā)作和中風(fēng)(圖3a)。通過IA注射，這種新型藥物運(yùn)輸方式使得藥物在大腦、腎臟和外周組織中有較高的累積。

2.2.2 血小板

血小板是一種體積較小的無核循環(huán)細(xì)胞，直徑約1～3 μm[29]，單個(gè)血小板的壽命約為8～10 d，因此，骨髓造血組織中的巨核細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生大量新的血小板以維持正常的血小板數(shù)目。血小板的快速補(bǔ)充特性和適當(dāng)?shù)难h(huán)時(shí)間，避免了體內(nèi)長時(shí)間的蓄積，因而成為可再生和高安全性的用于細(xì)胞治療的理想藥物載體。近年來相關(guān)研究表明，血小板的數(shù)量和活性增加與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān),其主要通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃避、黏附作用以及血管生成參與腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞分泌的前列腺素E2(PGE2)可激活血小板進(jìn)而釋放轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移[30]。此外，血小板進(jìn)入血液循環(huán)后的聚集還可以保護(hù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)免受自然殺傷細(xì)胞的免疫監(jiān)視，并通過增強(qiáng)與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，使CTCs滲出血管。因此，利用血小板靶向系統(tǒng)進(jìn)行抗腫瘤治療，可能具有更好的治療效果[31]。

近期，King等開發(fā)了一種血小板介導(dǎo)的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducedligand, TRAIL，一種選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的蛋白)的遞送系統(tǒng)[32]。他們將TRAIL和血管性血友病因子A1結(jié)構(gòu)域(vWF-A1)同時(shí)修飾到納米脂質(zhì)體表面，因?yàn)関WF-A1可以與血小板受體復(fù)合物GPIb-IX-V結(jié)合，從而使該藥物修飾的納米脂質(zhì)體搭載血小板的“便車”實(shí)現(xiàn)CTCs的靶向，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。在各種原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥臨床樣本中，血小板介導(dǎo)的TRAIL遞送系統(tǒng)殺死了血液中超過60%的CTCs。血小板-脂質(zhì)體治療是一種很有前景的方法，可與手術(shù)聯(lián)合使用來預(yù)防癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

血小板活化會引起自身劇烈的形態(tài)變化，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。新型藥物遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)主要是基于血小板粘附于腫瘤細(xì)胞和將藥物遞送到靶向的惡性細(xì)胞的能力。例如，Xu等[33]將DOX裝載進(jìn)入天然血小板中用于治療淋巴瘤。將DOX包載于血小板中，此過程并未顯著誘導(dǎo)血小板形態(tài)學(xué)和功能的改變。DOX-血小板通過“腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血小板聚集”促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)藥物積累，并以pH響應(yīng)的方式將DOX釋放到培養(yǎng)基中。同時(shí)，將DOX放入血小板中可以消除DOX游離在機(jī)體內(nèi)環(huán)境中所產(chǎn)生的有害影響(循環(huán)時(shí)間差和心臟毒性作用等)，并且增強(qiáng)對淋巴瘤細(xì)胞的生長抑制作用(圖3b)。DOX-血小板通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來提高DOX的抗腫瘤活性，因此血小板可以作為淋巴瘤臨床治療的潛在藥物載體。

圖3 納米載體在體外吸附到紅細(xì)胞上，血管內(nèi)導(dǎo)管注射后轉(zhuǎn)移到下游毛細(xì)血管(a)[28]；DOX-血小板在體外和體內(nèi)增強(qiáng)抗腫瘤活性的機(jī)制示意圖(b)[33]Fig.3 Nanocarriers are adsorbed onto the RBCs ex vivo, and then transfer to downstream capillaries after intravascular catheter injection (a)[28]; schematic illustration of the possible mechanism of enhanced anti-tumor activity of DOX-platelet in vitro and in vivo (b)[33]

2.3 干細(xì)胞

干細(xì)胞是一種未分化的細(xì)胞，具有產(chǎn)生不同類型細(xì)胞的潛力，由于具有在癌組織中生存和耐受的能力，將其作為化療藥物載體的相關(guān)研究受到研究人員的關(guān)注。因?yàn)槭腔罴?xì)胞，干細(xì)胞具有生物可降解性和生物相容性[34]，同時(shí)還具有再生、免疫調(diào)節(jié)和抗炎的特性[34,35]。此外，干細(xì)胞能夠基于趨化信號靶向特定的細(xì)胞，并浸潤特定的腫瘤類型。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種多能干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在特定的體外刺激下具有克隆性擴(kuò)增能力，能夠分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。常用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類型為骨髓來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。MSCs易于從各種組織中分離并且易于在體外擴(kuò)增，因而成為提供特異性并靶向癌癥治療的有競爭力的候選者。

MSCs具有腫瘤歸巢能力，在全身注射后可聚集在腫瘤病灶區(qū)內(nèi)，可以作為腫瘤靶向治療的藥物載體。近期，Takayama等利用親和素-生物素復(fù)合的方法[36]，將負(fù)載DOX的脂質(zhì)體(DOX-Lips)成功修飾到了MSCs的表面，此過程沒有改變MSCs的細(xì)胞特性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，尾靜脈注射DOX-Lips修飾的MSCs 1 h后，藥物在小鼠腫瘤處的蓄積明顯高于其他組織，同時(shí)，該遞藥系統(tǒng)可以顯著抑制皮下荷瘤小鼠和肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中的腫瘤生長。

影響細(xì)胞給藥有效性的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是有效載荷能力，除了采用細(xì)胞表面共價(jià)連接的方式進(jìn)行藥物的負(fù)載，MSCs同樣也可以進(jìn)行內(nèi)部載藥。但是，當(dāng)依賴于干細(xì)胞的非特異性內(nèi)吞作用時(shí)[37]，細(xì)胞的快速循環(huán)和胞吐作用會導(dǎo)致較低的納米顆粒負(fù)載能力。同樣，細(xì)胞不斷地內(nèi)化和循環(huán)其外膜，可能導(dǎo)致膜偶聯(lián)納米顆粒的溶酶體降解。Moku等在納米顆粒表面修飾穿膜肽，以增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的藥物有效載荷能力[38]。穿膜肽通常為5～30個(gè)氨基酸組成，其特征是賦予納米顆粒通過大胞吞[39]進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并繞過溶酶體的能力。在迄今為止發(fā)現(xiàn)的各種穿膜肽中，轉(zhuǎn)錄反激活因子(transactivator, TAT)肽已被廣泛研究，用以改善細(xì)胞內(nèi)各種裝載物的遞送。研究人員通過將TAT肽共價(jià)偶聯(lián)到封裝紫杉醇的納米顆粒表面，改善了MSCs對納米顆粒的內(nèi)化和保留，從而增強(qiáng)了有效載荷量。

2.4 細(xì)菌

細(xì)菌是由單個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的，細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)具有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等結(jié)構(gòu)，但都沒有成形的細(xì)胞核，屬于原核細(xì)胞。人體內(nèi)居住著許多不同的微生物群，這些微生物分布于人體各處，包括腸道、口腔、皮膚、呼吸道等部位。某些細(xì)菌棲息在身體特定部位的生態(tài)位中，可以優(yōu)先靶向該部位并在腫瘤微環(huán)境中生存。因此，以細(xì)菌為基礎(chǔ)的遞送系統(tǒng)是目前有吸引力的選擇。血液循環(huán)和其他正常組織中的細(xì)菌分別可以在數(shù)小時(shí)和數(shù)天內(nèi)被清除，而腫瘤中的細(xì)菌往往會持續(xù)增殖，數(shù)量往往遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過最初使用的集落形成單位[40]。這種選擇性的定植很可能是與實(shí)體腫瘤相關(guān)的病理改變引起的免疫抑制和腫瘤部位獨(dú)特的生化微環(huán)境共同作用的結(jié)果。

血管結(jié)構(gòu)的缺陷、間質(zhì)壓力的升高和腫瘤微環(huán)境中滲透距離的增加是將治療藥物引入腫瘤的主要障礙。近年來，以細(xì)菌為遞藥載體的研究不斷發(fā)展。將載藥脂質(zhì)體通過化學(xué)偶聯(lián)附著在海洋趨磁細(xì)菌(MC-1)表面，將修飾后的MC-1注射到小鼠腫瘤附近，通過使用外部磁場，利用改造過的細(xì)菌的趨磁性將載藥細(xì)菌引導(dǎo)到腫瘤部位，然后關(guān)閉磁場，修飾后的MC-1優(yōu)先遷移到腫瘤深處，隨后向低氧區(qū)域移動(dòng)。注射的MC-1(高達(dá)55%)能夠進(jìn)入腫瘤的缺氧區(qū)域，表明這些改造后的趨磁細(xì)菌具有穿透實(shí)體腫瘤的能力[41]。此外，細(xì)菌也被用于將功能性核酸遞送到人類的實(shí)體腫瘤中。2007年，Akin等研究發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白(green fluorescent protei, GFP)報(bào)告基因、螢火蟲熒光素酶和分泌堿性磷酸酶均可以通過附著在細(xì)菌表面的納米顆粒中進(jìn)行遞送[42]。腫瘤細(xì)胞吞噬細(xì)菌后，這些細(xì)菌將攜帶的DNA釋放到腫瘤細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。利用細(xì)菌作為非病毒載體將基因遞送到腫瘤細(xì)胞中，為重新編程腫瘤細(xì)胞提供了可行性方案。

此外，以細(xì)菌為載體，聯(lián)合其它多種策略進(jìn)行腫瘤治療的方案不斷被挖掘。聚多巴胺(pDA)是一種仿生光熱材料，具備良好的生物相容性與生物可降解性，光熱轉(zhuǎn)化效率較高。Chen等利用多巴胺在堿性溶液中的氧化自聚合反應(yīng)，使pDA成功地包裹于減毒沙門氏菌VNP20009(VNP)的表面(pDA-VNP)，構(gòu)建了細(xì)菌與光熱療法聯(lián)合的抗腫瘤治療方案[43]。如圖4所示，pDA-VNP經(jīng)尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)后，可以靶向?qū)嶓w腫瘤的缺氧區(qū)域，在近紅外激光照射下誘導(dǎo)腫瘤處的溫度升高。更重要的是，該研究發(fā)現(xiàn)VNP和pDA相互增強(qiáng)了治療能力，具有優(yōu)越的抗腫瘤效果。

圖4 pDA-VNP光熱療法產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞裂解進(jìn)一步改善了細(xì)菌介導(dǎo)的生物治療[43]Fig.4 Tumor cell lysis generated by pDA-VNP-based photothermal therapy further improves bacteria-mediated biotherapy[43]

3 基于囊泡的藥物遞送系統(tǒng)

除了前文描述的基于細(xì)胞的藥物遞送策略外，囊泡作為細(xì)胞衍生的膜顆粒，能繼承源細(xì)胞的功能，如免疫逃逸、長循環(huán)和識別能力等。本節(jié)總結(jié)了細(xì)胞外囊泡和細(xì)菌外膜囊泡作為藥物分子和生物活性蛋白遞送載體的進(jìn)展，并討論了其優(yōu)缺點(diǎn)。這種細(xì)胞衍生的囊泡被廣泛使用，有望成為新興的藥物遞送工具。

3.1 細(xì)胞外囊泡

細(xì)胞外囊泡是一種天然的納米載體，能攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和糖等生物活性分子，有助于細(xì)胞和組織之間信息的傳遞，從而在細(xì)胞通信中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞外囊泡根據(jù)大小和形態(tài)可大致分為3種類型：凋亡小體(1000～5000 nm)、大囊泡或微粒(100～1000 nm)和外泌體(50～100 nm)[44]。其中，外泌體是研究最全面的囊泡。細(xì)胞外囊泡已被證明可以攜帶包括蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA在內(nèi)的功能活性生物分子，可以通過血液和淋巴管將信號傳遞到周圍環(huán)境中的目標(biāo)細(xì)胞以及遠(yuǎn)處的器官。

外泌體來源于晚期核內(nèi)體，是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的膜性囊泡，是細(xì)胞外囊泡的最小形式。由于尺寸較小，單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)無法對其進(jìn)行清除[45]，因此，外泌體可以作為藥物的“隱形外衣”。使用外泌體載藥克服了2種主要的干細(xì)胞并發(fā)癥，即致瘤性和移植物抗宿主病，同時(shí)保留了所有的靶向性和親本細(xì)胞類型的優(yōu)勢[46]。大多數(shù)類型的細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、神經(jīng)元、B細(xì)胞、T細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和雪旺細(xì)胞等均能釋放外泌體。外泌體的成分很大程度上取決于細(xì)胞的來源，例如，來自B淋巴細(xì)胞的外泌體具有功能性的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)I、II和T細(xì)胞共刺激分子，可以刺激T細(xì)胞增殖；癌細(xì)胞來源的外泌體含有明膠溶解酶和其他與細(xì)胞粘附相關(guān)的分子，可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[47]。外泌體作為一種內(nèi)源性多功能載體，具有獨(dú)特的“歸巢”效應(yīng)，即靶向產(chǎn)生外泌體的源細(xì)胞的能力。因此，外泌體在各種治療藥物的遞送方面具有巨大潛力。其中，對MSCs來源的外泌體、腫瘤細(xì)胞來源的外泌體和免疫細(xì)胞來源的外泌體的研究較為廣泛。

藥物分子可以通過主動(dòng)或被動(dòng)的方式加載/封裝到外泌體中。被動(dòng)載藥法可以通過藥物與外泌體孵育或藥物與供體細(xì)胞孵育來實(shí)現(xiàn)，相對簡單和直接。主動(dòng)載藥法可以通過超聲處理、擠壓、電穿孔或藥物偶聯(lián)等技術(shù)實(shí)現(xiàn)，載藥效率高，有利于大分子藥物的負(fù)載。DOX是一種廣泛使用的抗癌藥物，但將細(xì)胞長期暴露于DOX中會導(dǎo)致顯著的細(xì)胞毒性，限制了DOX的持續(xù)使用。Schindler等在研究中發(fā)現(xiàn)，與游離DOX和市售DOX脂質(zhì)體(Myocet?和Doxil?)相比，將DOX負(fù)載到外泌體中更容易被細(xì)胞攝取，DOX可以從核內(nèi)體分布到細(xì)胞核[48]。此外，Li等開發(fā)了一種用于靶向給藥的抗體功能化的外泌體，并對其體內(nèi)療效進(jìn)行了評估。通過超離心法從A33陽性的結(jié)直腸癌(LIM1215)細(xì)胞中分離出外泌體，并進(jìn)行了DOX的裝載。帶有A33抗體的超磁性氧化鐵納米顆粒(US)與A33陽性外泌體結(jié)合，形成了外泌體復(fù)合物(A33Ab-US-Exo/Dox)。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，該復(fù)合物具有良好的腫瘤靶向能力和腫瘤抑制能力，可以延長小鼠存活時(shí)間和降低心臟毒性[49]。通過修飾抗體可提高外泌體復(fù)合物的腫瘤靶向能力，高密度抗體功能化的外泌體是一種有效的癌癥治療方法。

其他使用外泌體為遞送載體的藥物有用于治療胰腺癌的吉西他濱(Gem)和用于治療帕金森病的多巴胺。外泌體除了提高用藥效率外，還被用來攜帶小分子穿過血腦屏障。帕金森病是常見的神經(jīng)退行性疾病，受血腦屏障的阻礙，其治療具有挑戰(zhàn)性。有研究報(bào)道，負(fù)載有多巴胺的外泌體(0.2 mL, 相當(dāng)于左旋多巴4.95 mg/kg)通過血液傳遞時(shí)，小鼠大腦中的多巴胺濃度為(1.02±0.15) nmol/g，而接受游離多巴胺的小鼠大腦中未檢測到多巴胺(串聯(lián)質(zhì)譜檢測限為0.065 nmol/g)。該研究表明，通過將多巴胺裝入外泌體，可以使其在腦中的分布增加15倍以上，而游離多巴胺傾向于在肝臟、肺和腎臟中積累。體外和體內(nèi)研究顯示，與單獨(dú)使用游離多巴胺相比，外泌體對帕金森病小鼠模型具有更好的治療效果，并具有更低的全身毒性[50]。

盡管外泌體展示出可跨越血腦屏障的能力，但許多研究表明，靜脈注射的外泌體主要分布在肝臟或脾臟，只有很小一部分保留在大腦或腫瘤部位[51]。MicroRNA-21(miR-21)是包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的實(shí)體腫瘤中上調(diào)最高的miRNA之一，下調(diào)miR-21可作為一種干預(yù)腫瘤細(xì)胞增殖和增加凋亡的方法。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表面過表達(dá)，而轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向肽T7是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽，因此，可以通過T7肽靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。Kim等通過將T7作為T7和溶酶體相關(guān)膜蛋白2b(Lamp2b)的融合蛋白摻入到外泌體膜中，產(chǎn)生了裝飾有T7肽的外泌體(T7-exo)，并通過電穿孔將miR-21反義寡核苷酸裝載到外泌體中。研究表明，與未修飾的外泌體相比，通過尾靜脈注射，T7-exo可更有效地將miR-21反義寡核苷酸遞送至大腦，有效降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的miR-21水平[52]。因此，可以通過腫瘤靶向配體對外泌體進(jìn)行修飾，提高其靶向遞送到大腦的效率[51]。

3.2 細(xì)菌外膜囊泡

細(xì)菌外膜囊泡(outermembrane vesicles, OMVs)是由微生物細(xì)胞表面產(chǎn)生的球形膜性囊泡，直徑在20～500 nm之間。不同細(xì)菌產(chǎn)生的囊泡不僅在大小、形態(tài)、組成和形成方式上不同，名稱也有所不同。由于OMVs來源于細(xì)菌的外表面，其保留了細(xì)菌外膜的基本特征，并包含蛋白質(zhì)、DNA、RNA、代謝物和毒素等[53]。細(xì)菌OMVs具有較大的載藥空間，可以像傳統(tǒng)的納米顆粒一樣作為納米載體，主要成分是脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、甘油磷脂和包括周質(zhì)蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)。其中，LPS賦予細(xì)菌OMVs佐劑功能，可作為疫苗開發(fā)的抗原成分。例如，細(xì)菌OMVs可以通過電穿孔的方式裝載siRNA[54]，通過基因工程可實(shí)現(xiàn)卵清蛋白片段[55]和堿性成纖維細(xì)胞生長因子[56]在細(xì)菌OMVs表面的抗原呈遞。對于相對疏水和容易與親脂膜相互作用的小分子藥物，可以直接被動(dòng)擴(kuò)散到細(xì)菌OMVs內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)藥物的裝載[57]。另一種裝載方法是在親代細(xì)菌菌株生長過程中將藥物裝載進(jìn)OMVs。Allan等研究發(fā)現(xiàn)，在銅綠假單胞菌PAO1菌株的生長過程中摻入慶大霉素后，可以產(chǎn)生含有慶大霉素的OMVs，從而將藥物裝載到目標(biāo)細(xì)菌的OMVs中[57]。

作為一種藥物遞送工具，OMVs具有體積小、穩(wěn)定、耐受性良好和特異性高的優(yōu)點(diǎn)。與普通脂質(zhì)體容易循環(huán)降解導(dǎo)致藥物泄漏不同，OMVs具有熱力學(xué)穩(wěn)定性，在懸浮液中不會分解，可以在特定的生理?xiàng)l件下緩慢釋放藥物，減少藥物泄漏到機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)中引起的非特異性毒性。此外，這種慢釋放特性可以為siRNA在血供異常的區(qū)域提供足夠的時(shí)間到達(dá)靶細(xì)胞[54]。

4 結(jié) 語

基于活細(xì)胞及其衍生物的藥物遞送系統(tǒng)展示出了許多優(yōu)勢，特別是在生物相容性和靶向性等方面。目前，包括無機(jī)和聚合物納米顆粒在內(nèi)的大多數(shù)給藥系統(tǒng)，其本質(zhì)是外來材料，盡管其中一些已獲得臨床批準(zhǔn)，但仍可能具有潛在的毒性和免疫原性。相較于納米載體，細(xì)胞及其衍生物是內(nèi)源性的，生物相容性好。然而，這些載體從實(shí)驗(yàn)室向臨床應(yīng)用的過程，仍面臨一定的局限。

(1)細(xì)胞直接封裝游離藥物時(shí)，藥物毒性可能會影響細(xì)胞的活性，而且這些藥物較難以空間或時(shí)間上可控的方式釋放。

(2)有些細(xì)胞適合作為藥物載體，但存在數(shù)量少、壽命短等局限，不能滿足疾病治療對細(xì)胞的大量要求。細(xì)胞模擬物具有類似于細(xì)胞的人造結(jié)構(gòu)，它們能夠自主地?cái)z取、處理和排出物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的基本功能。目前還沒有非常有效的方法產(chǎn)生活細(xì)胞或其相關(guān)的細(xì)胞模擬物，限制了這些細(xì)胞載體在臨床上的大規(guī)模使用。

(3)除了研究引入的細(xì)胞對機(jī)體的影響外，還需要保證細(xì)胞免受機(jī)體環(huán)境的影響，特別是免受免疫活性分子和免疫細(xì)胞的影響。針對這一問題，目前一種很有前景的方法是細(xì)胞微封裝技術(shù)，將工程細(xì)胞封閉在半透膜膠囊中。膠囊可以防止免疫細(xì)胞以及大分子抗體通過半透膜，同時(shí)允許氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和一些具有生物活性的小分子物質(zhì)自由出入。除了保護(hù)工程細(xì)胞免受宿主的影響外，微膠囊化已經(jīng)成為一種很有前途的策略，可以實(shí)現(xiàn)數(shù)周或數(shù)月的長期給藥。

(4)活細(xì)胞在體內(nèi)的代謝、安全性、細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性、是否會誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生以及保證工程治療細(xì)胞不干擾機(jī)體其它基本過程等方面都有待進(jìn)一步探究。