李建梅，孫靜宜，馬英橋，趙 月

隨著分子生物學發(fā)展，從分子機制了解腫瘤的發(fā)生、分化、增殖、浸潤等成為目前腫瘤基礎研究的熱點[1]。miR-328可減少細胞黏附、遷移及聚集，可調控毛細血管結構形成[2]。以往有研究發(fā)現，miR-328在多種腫瘤包括乳腺癌中表達明顯下調，提示miR-328為乳腺癌抑制性微小RNA[3]。腫瘤細胞轉移是因宿主和腫瘤之間一系列特異作用所致。整合素在腫瘤細胞與細胞外基質間出現的一系列相互作用中發(fā)揮著重要作用，整合素細胞外基質分子的細胞黏附受體可與細胞外基質蛋白相互作用，從而介導腫瘤細胞轉移[4]。有生物信息學分析發(fā)現，蛋白整合素α5(ITGα5)是miR-328的靶點，而ITGα5水平升高對PI3K/AKT通路的激活也有重要作用[5]。因此我們推測，miR-328可能通過靶向ITGα5調節(jié)PI3K/AKT通路活性，對乳腺癌干細胞的分化、形成和轉移具有重要影響。本研究旨在探索miR-328、ITGα5在乳腺癌中的表達及與臨床病理特征、預后的關系，以期為乳腺癌的靶向治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年3月—2020年3月我院收治的乳腺癌317例，年齡≥60歲149例，<60歲168例；淋巴結轉移：有148例，無169例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期172例，Ⅲ～Ⅳ期145例；腫瘤直徑：≥2 cm 185例，<2 cm 132例；雌激素受體(ER)陽性160例，孕激素受體(PR)陽性174例。納入標準：均經病理檢查證實為乳腺癌患者；在術前均未進行放療或化療；患者及家屬均簽署知情同意書；臨床資料完整。排除標準：存在血液系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病者；合并心、肝、腎等嚴重原發(fā)性疾病者；合并其他部位腫瘤者。

1.2miR-328、ITGα5檢查方法 miR-328：入院后抽取患者靜脈血液2 ml，使用密度梯度離心法分離患者外周血單個核細胞，用于提取RNA，并使用特異引物對miRNA進行逆轉錄，隨后使用熒光定量PCR反應檢測。ITGα5檢查：取病理標本，使用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，行4 μm厚連續(xù)切片，用于免疫組織化學SP染色和HE染色。由美國Cymbus Biotechnology公司提供ITGα5檢測試劑盒。具體實驗步驟根據試劑盒說明書進行。切片染色均使用PBS代替一抗作為陰性對照，陽性對照為染色陽性切片。結果判定：由2名經驗豐富病理科醫(yī)生在雙盲情況下對結果進行判定，ITGα5陽性表達為細胞膜或胞質內有棕色顆粒。在高倍鏡(×400)下隨機選擇5個視野對切片進行觀察，每個視野200個細胞，一共計數1000個細胞。根據腫瘤細胞著色情況進行判定：Ⅰ為無反應或微弱反應、Ⅱ為棕色、Ⅲ為深棕色，計算染色情況為Ⅱ、Ⅲ的5個高倍鏡視野中陽性染色細胞的百分率，Ⅰ及陽性細胞數≤75%為低表達，>75%則為高表達[6]。

1.3觀察指標 對比癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤切緣≥0.5 cm)中miR-328、ITGα5表達水平。分析miR-328與乳腺癌臨床病理特征的關系。分析ITGα5與乳腺癌臨床病理特征的關系及miR-328、ITGα5與乳腺癌預后的關系。

2 結果

2.1患者1年后生存情況 317例1年后生存285例，死亡32例，病死率為10.09%。

2.2不同組織中miR-328、ITGα5表達水平比較 癌組織及癌旁正常組織miR-328表達水平分別為5.124±1.159和6.854±1.718。癌組織miR-328表達水平低于癌旁正常組織(P<0.01)。癌組織及癌旁正常組織ITGα5高表達分別為175例(55.21%)和83例(26.18%)。癌組織ITGα5高表達率高于癌旁正常組織(P<0.01)。

2.3miR-328與乳腺癌臨床病理特征的關系 miR-328在淋巴結轉移、腫瘤直徑方面比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在年齡、TNM分期及ER、PR表達方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 miR-328與乳腺癌臨床病理特征的關系

2.4ITGα5高表達與乳腺癌臨床病理特征的關系 ITGα5高表達在淋巴結轉移、TNM分期方面比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在年齡、腫瘤直徑及ER、PR表達方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 ITGα5高表達與乳腺癌臨床病理特征的關系(例)

2.5乳腺癌患者預后危險因素分析 經多因素Logistic回歸分析可知，淋巴結轉移、miR-328低表達、ITGα5高表達為乳腺癌患者預后的獨立危險因素(P<0.01)。見表3。

表3 乳腺癌患者預后危險因素分析

3 討論

腫瘤干細胞的功能受多種因素調控，如基因和表觀遺傳改變等。近年來，miRNAs作為一種非編碼短鏈RNA，在腫瘤干細胞中的作用日趨凸顯[7]。miRNAs也是乳腺癌的重要調節(jié)因子，miRNAs表達改變與乳腺癌的發(fā)生密切相關[8]。miR-328對肝細胞癌變和慢性髓系白血病有抑制作用，通過將miRNA進行列陣分析發(fā)現，miR-328對靶基因ABCG2和MMP-16具有直接的作用，可影響mRNA水平及SP細胞蛋白表達，從而達到抑制癌癥發(fā)生及進展的目的[9]。以往研究發(fā)現，miR-328對膠質母細胞瘤內的U87增殖有抑制作用，可延長患者生存期，也是膠質母細胞瘤預后評估的有效指標[10]。本研究發(fā)現，miR-328在乳腺癌組織中表達水平低于癌旁正常組織，且腫瘤直徑越大、有淋巴結轉移的乳腺癌患者miR-328表達水平越低，且是乳腺癌患者預后的獨立危險因素，提示miR-328是乳腺癌的保護基因，其表達水平越低，患者預后情況越差，與既往文獻結果相符[11]。

ITGα5是整合素家族的重要成員，可與整合素β1(ITGβ1)結合形成二聚體，是基質重要成分纖連蛋白的受體。腫瘤細胞表達的亞基經過與宿主間質細胞纖連蛋白結合后可影響腫瘤細胞的轉移和侵襲狀態(tài)[12]。有研究顯示，ITGα5高表達為肺癌患者預后的危險因素，在淋巴結轉移、TNM分期越高、預后不良患者中表達明顯上調，提示腫瘤細胞經整合素介導，通過改變細胞外基質黏附能力從而間接或直接調控腫瘤細胞的侵襲能力，從側面證明ITGα5與腫瘤細胞增殖和轉移密切相關[13]。ZHU等[14]從DNA、蛋白水平證明ITGα5有促進腫瘤細胞轉移和增殖的作用。本研究發(fā)現，ITGα5在乳腺癌組織中高表達，在癌旁正常組織中低表達，可能是因為基因調節(jié)機制[15]；且進一步分析ITGα5表達情況與乳腺癌患者臨床病理特征間的關系發(fā)現，ITGα5表達情況與乳腺癌患者淋巴結轉移、TNM分期有關，淋巴結轉移者、TNM分期越高者ITGα5表達水平越高，提示通過調節(jié)ITGα5表達可影響腫瘤細胞轉移。

生物信息學分析發(fā)現ITGα5是miR-328的靶點，而ITGα5水平升高對PI3K/AKT通路激活也有重要作用[16]。我們推測，miR-328-5p可能通過靶向ITGα5調節(jié)PI3K/AKT通路活性，對乳腺癌干細胞的分化、形成和轉移具有重要影響[17]。通過預后危險因素分析可知，淋巴結轉移、miR-328低表達、ITGα5高表達為乳腺癌患者預后的獨立危險因素，提示miR-328、ITGα5可作為乳腺癌惡性程度、預后評估的重要參考指標[18]。

綜上所述，miR-328為乳腺癌保護基因，在乳腺癌中表達下調，ITGα5表達上調，二者與患者臨床病理特征及預后密切相關。術后關注乳腺癌患者miR-328、ITGα5表達情況可有助于評估腫瘤生物學行為，對患者術后復發(fā)、預后評估及治療方案選擇有重要的參考價值。