武菲菲，徐臣年，金 屏，翟蒙恩，喬 銳，郭 紅

心肌纖維化(MF)是常見的心血管病理生理表現(xiàn)，具體機制尚不明確，研究認(rèn)為MF可能成為多種疾病治療的有效靶點[1-4]。研究表明，Notch信號通路是機體生長發(fā)育的關(guān)鍵分子，其介導(dǎo)的相關(guān)凋亡及自噬與MF、心肌損傷關(guān)系密切[5-7]。目前MF治療尚缺乏有效策略，中藥提取物熊果苷(AR)具有較強的抗氧化應(yīng)激、抗炎作用，可通過不同機制修復(fù)組織損傷[8-11]。本研究采用異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)MF小鼠模型，探討AR對MF的改善作用及對Notch1/NRG1信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 實驗動物選擇6周齡健康雄性C57/BL小鼠80只，體質(zhì)量(20.12±1.45)g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK(陜)2019-001。Fas、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Notch1、NRG1、GAPDH抗體、AR購于美國Sigma公司；ISO購于天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)試劑盒購于美國R&D Systems公司。

1.2研究方法

1.2.1分組及模型建立：80只小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組(Sham組)、心肌纖維化組(MF組)、AR處理組(AR+MF組)和AR聯(lián)合Notch1抑制劑(DAPT)處理MF組(AR+DAPT+MF組)，每組20只。MF組、AR+MF組、AR+DAPT+MF組于小鼠肩胛間皮下注射ISO(7 mg/kg、3/d)，重復(fù)給藥持續(xù)15 d，Sham組于同一部位注射相同體積生理鹽水。AR+MF組腹腔注射AR 10 mg/(kg·d)，AR+DAPT+MF組腹腔注射AR 10 mg/(kg·d)及DAPT 10 mg/(kg·d)，重復(fù)給藥持續(xù)15 d。

1.2.2ELISA法檢測小鼠血清TNF-α、CTGF水平：各組小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后，固定，剪開并剝離小鼠頸部皮膚、皮下組織，暴露頸動脈，以組織剪剪開快速取血2 ml至EP管中，3000 r/min離心15 min，取上層血清。按照TNF-α、CTGF檢測試劑盒說明書檢測。

1.2.3心臟超聲檢測小鼠心功能：各組小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后四肢固定超聲儀電極，探頭在乳頭肌水平位置用M型取樣線檢測，測量并計算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室舒張末期前壁厚度(LVAWd)。

1.2.4天狼猩紅、Masson染色檢測小鼠心肌組織纖維化程度：達實驗終點后，各組小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后迅速剪下心臟，冷PBS液沖洗3遍，以多聚甲醛(40 g/L)固定72 h，石蠟包埋、切片，行天狼猩紅、Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下拍攝天狼猩紅、Masson染色后圖像并保存。

1.2.5qPCR檢測小鼠心肌組織Fas、Caspase-3 mRNA表達量：用Trizol試劑從組織中分離總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用BIO-RAD分光光度法測定RNA和cDNA濃度和純度，Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物并合成。在iQTM5 RT-PCR系統(tǒng)中行PCR擴增，采用2-ΔΔCt法測定Fas、Caspase-3 mRNA表達量。

1.2.6TUNEL染色檢測小鼠心肌凋亡水平：按TUNEL試劑盒說明書將各組小鼠心肌組織石蠟切片染色，熒光顯微鏡下拍照，每張切片隨機選取10個高倍視野觀察。染色每個陽性點作為一個細(xì)胞計數(shù)，與之重疊的綠點計數(shù)為凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)得出凋亡指數(shù)。

1.2.7Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達：各組小鼠取相同質(zhì)量心肌組織放入離心管中，加入預(yù)冷PBS液，剪碎心肌組織，4 ℃ 3000×g離心10 min，棄上清，沉淀中加入含蛋白酶抑制劑的RIPA強裂解液，冰上充分研磨并裂解30 min，4 ℃ 12 000×g離心30 min，取上清。電泳并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，裁剪目的條帶，放入對應(yīng)Notch1(1∶1000)、NRG1(1∶1000)、Fas(1∶1000)、Bcl-2(1︰1000)、Bax(1︰1000)、Caspase-3(1︰1000)和GAPDH抗體(1︰5000)中，4 ℃搖床孵育過夜；TBST洗脫3次，每次5 min，將目的條帶放入山羊抗兔或抗鼠二抗(1︰5000)中室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗脫3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光液避光檢測統(tǒng)計灰度值。

2 結(jié)果

2.1DAPT能阻斷AR改善MF所致心功能障礙及心肌損傷 與Sham組比較，MF組心功能明顯降低，LVEF、LVFS顯著減小，LVAWd明顯增大(P<0.05)；與MF組比較，AR+MF組LVAWd明顯減小，LVEF、LVFS明顯增加(P<0.05)；與AR+MF組比較，AR+DAPT+MF組LVEF、LVFS及LVAWd明顯降低或減小(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠心功能心臟超聲檢測結(jié)果比較

與Sham組比較，MF組血清TNF-α、CTGF水平及心肌組織Fas、Caspase-3 mRNA表達明顯增加(P<0.05)；與MF組比較，AR+MF組血清TNF-α、CTGF水平及心肌組織Fas、Caspase-3 mRNA表達明顯降低或減少(P<0.05)；與AR+MF組比較，AR+DAPT+MF組血清TNF-α、CTGF水平及心肌組織Fas、Caspase-3 mRNA表達明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、CTGF及心肌組織Fas、Caspase-3 mRNA相對表達量比較

2.2DAPT可阻斷AR改善MF心肌結(jié)構(gòu)和纖維化 Sham組小鼠心肌組織纖維排列整齊，無纖維化，膠原含量低；MF組可見細(xì)胞核多逸出，心肌結(jié)構(gòu)排列紊亂，肌纖維斷裂明顯，膠原含量高；與MF組相比，AR+MF組肌纖維排列整齊，纖維化程度改善，膠原含量降低；與AR+MF組相比，AR+DAPT+MF組心肌纖維化程度明顯增加，排列紊亂，膠原含量增高。見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織纖維化程度天狼猩紅、Masson染色結(jié)果(×400)

2.3AR能抑制MF所致心肌細(xì)胞凋亡及DAPT阻斷AR的作用 心肌組織TUNEL染色結(jié)果表明，與Sham組比較，MF組心肌組織TUNEL陽性染色數(shù)量明顯增加；與MF組比較，AR+MF組TUNEL陽性染色數(shù)量明顯減少；與AR+MF組比較，AR+DAPT+MF組TUNEL陽性染色數(shù)量顯著增加。見圖2。

圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

Western blot法檢測結(jié)果顯示，與Sham組比較，MF組心肌組織中Notch1、NRG1、Bcl-2表達量明顯降低，F(xiàn)as、Caspase-3、Bax表達量增加(P<0.05)；與MF組比較，AR+MF組心肌組織Notch1、NRG1、Bcl-2表達量明顯升高，F(xiàn)as、Caspase-3、Bax表達量降低(P<0.05)；與AR+MF組比較，AR+DAPT+MF組心肌組織Notch1、NRG1、Bcl-2表達量降低，F(xiàn)as、Caspase-3、Bax表達量增加(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達量比較

3 討論

MF是由多種因素引起的，這些因素可導(dǎo)致膠原纖維過度沉積，膠原濃度顯著增強，心肌膠原類型和結(jié)構(gòu)排列紊亂[12-14]。研究表明，MF、心血管疾病及環(huán)境之間存在著密切而復(fù)雜的關(guān)系[15-17]。MF是心肌重構(gòu)的主要病理基礎(chǔ)，也是心律失常、心力衰竭等心血管事件的潛在危險因素[18-20]。研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、趨化因子、內(nèi)皮素-1和血小板衍生生長因子與MF密切相關(guān)[21]。然而近年研究表明凋亡、自噬在MF中起著重要作用[22-23]。然而凋亡、自噬與MF的作用機制尚不十分清楚，凋亡與自噬的調(diào)節(jié)可能成為治療MF的潛在目標(biāo)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MF與Notch1/NRG1通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，同時AR可激活Notch1/NRG1通路抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)果一定程度闡明了MF的作用機制，并可能輔助探尋預(yù)防和治療MF的靶點。Notch信號與血管發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和炎癥反應(yīng)相關(guān)[24]。Notch通路在細(xì)胞凋亡過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞自我更新、組織生長發(fā)育[25-26]。Notch1信號傳導(dǎo)的下游基因包括NRG1和HRT，Notch1激活抑制心肌細(xì)胞凋亡，Notch1/NRG1通路在心血管系統(tǒng)細(xì)胞增殖、修復(fù)中起關(guān)鍵作用。Notch1和NRG1已證明能通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞存活以保護心臟結(jié)構(gòu)和功能[24]。Notch1直接靶向NRG1，AR可能通過激活NRG1在MF模型中發(fā)揮保護作用。AR本身具有抗氧化、抗凋亡等作用，然而AR對ISO所致心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用有待進一步研究。本實驗結(jié)果表明，在MF模型中，Notch1和NRG1表達均下調(diào)，而AR組Notch1和NRG1表達恢復(fù)。DAPT是Notch1抑制劑，可通過阻斷Notch1減弱AR對MF的改善作用。故通過抑制Notch1/NRG1通路，部分消除AR對ISO所致MF心肌組織的保護作用。DAPT還可部分消除AR通過Notch1/NRG1通路對心肌細(xì)胞凋亡的影響?？偟膩碚f，AR可通過激活Notch1/NRG1通路發(fā)揮心肌保護作用。

盡管如此，凋亡在MF及不同疾病不同發(fā)病階段的具體作用機制尚不清楚，凋亡、MF及二者間的關(guān)系仍需深入研究與探索。本研究闡明了AR對ISO所致MF心肌細(xì)胞凋亡的保護機制，發(fā)現(xiàn)MF與Notch1/NRG1通路介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，同時AR激活Notch1/NRG1通路可抑制細(xì)胞凋亡。