陳嘯 王媛媛 崔云飛 黃賢明

(青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院血管外科，山東 青島 266000)

創(chuàng)面愈合不良是糖尿病(DM)的常見(jiàn)并發(fā)癥，創(chuàng)面愈合受損和反復(fù)感染可大大增加下肢截肢風(fēng)險(xiǎn)，甚至導(dǎo)致死亡。研究報(bào)道DM和高糖暴露可能導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMECs)活力和遷移能力降低，血管生成減少，凋亡增加，從而導(dǎo)致創(chuàng)面愈合緩慢，誘導(dǎo)HMECs增殖和遷移可能是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的潛在方法〔1,2〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)通過(guò)靶向微小RNA(miRNA)調(diào)節(jié)下游靶mRNA表達(dá)在許多疾病病理過(guò)程中發(fā)揮作用〔3〕。研究表明LncRNA DLX6-AS1介導(dǎo)糖尿病腎病(DN)腎功能的下降，下調(diào)LncRNA DLX6-AS1能夠抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)〔4,5〕。miRNA表達(dá)失調(diào)與創(chuàng)面愈合不良等多種DM并發(fā)癥進(jìn)展有關(guān)〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-374a-3p低表達(dá)介導(dǎo)DN的發(fā)生發(fā)展〔7〕。骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者軟骨中miR-374a-3p表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-374a-3p顯著減輕脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷〔8〕。靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-374a-3p是LncRNA DLX6-AS1的潛在靶點(diǎn)，然而，LncRNA DLX6-AS1是否靶向miR-374a-3p影響創(chuàng)面愈合尚未可知。本研究通過(guò)分析糖尿病患者創(chuàng)面組織中LncRNA DLX6-AS1、miR-374a-3p的表達(dá)情況，探討LncRNA DLX6-AS1對(duì)高糖暴露下人HMECs增殖、遷移和侵襲的影響，并通過(guò)miR-374a-3p探討其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1組織來(lái)源 選取青島市海慈醫(yī)院DM患者足部潰瘍組織27例標(biāo)本為DM組，排除下肢動(dòng)脈疾病、心腦血管疾病或其他并發(fā)癥，年齡36～73歲。27例正常人足部組織標(biāo)本為對(duì)照組。兩組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)，參與者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2細(xì)胞和試劑 HMECs購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技公司；CCK-8試劑盒、Trizol試劑購(gòu)自南京凱基生物公司；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自大連takara生物公司；miRNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司；si-RNA、miRNA模擬物、miRNA抑制物、pcDNA-RNA、熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自江蘇百奧邁科生物技術(shù)有限公司；Cyclin D1兔多克隆抗體(ab226977)、MMP2兔多克隆抗體(ab97779)、MMP9兔多克隆抗體(ab73734)、山羊抗兔二抗(ab205718)、β-actin兔單克隆抗體(ab115777)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Transwell培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和高糖損傷模型細(xì)胞的建立 HMECs接種于含5%胎牛血清、1%內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮培養(yǎng)基(ECM)置于37℃、含5%二氧化碳、95%空氣、濕度為70%～80%的培養(yǎng)箱中孵育，在細(xì)胞密度達(dá)80%～90%即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液孵育HMECs 48 h建立高糖損傷細(xì)胞模型〔9〕，記為高糖(HG)組。

1.2.2RT-qPCR檢測(cè)LncRNA DLX6-AS1和miR-374a-3p表達(dá) 通過(guò)Trizol試劑提取受試者創(chuàng)面組織、的總RNA。用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行RT-qPCR以檢測(cè)LncRNA DLX6-AS1表達(dá)。用miRNA檢測(cè)試劑盒對(duì)miR-374a-3p進(jìn)行定量檢測(cè)。2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA DLX6-AS1和miR-374a-3p表達(dá)量。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 將HMECs接種24孔板，在細(xì)胞密度達(dá)50%按照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)分別將pcDNA、pcDNA-LncRNA DLX6-AS1、si-NC、si-LncRNA DLX6-AS1、miR-NC、miR-374a-3p模擬物、anti-miR-374a-3p+si-LncRNA DLX6-AS1、anti-miR-NC +si-LncRNA DLX6-AS1轉(zhuǎn)染HMECs中，轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞備用。正常培養(yǎng)的HMECs為對(duì)照(NC)組；高糖損傷細(xì)胞模型為HG組；HMECs分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-LncRNA DLX6-AS1、miR-NC、miR-374a-3p模擬物、anti-miR-374a-3p+ si-LncRNA DLX6-AS1、anti-miR-NC +si-LncRNA DLX6-AS1后進(jìn)行高糖處理，分別為si-NC+HG組、si-LncRNA DLX6-AS1+HG組、miR-NC+HG組、miR-374a-3p+HG組、anti-miR-374a-3p+si-LncRNA DLX6-AS1+HG組、anti-miR-NC+si-LncRNA DLX6-AS1+HG組。僅轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-LncRNA DLX6-AS1、si-NC、si-LncRNA DLX6-AS1的HMECs分別為pcDNA組、pcDNA-LncRNA DLX6-AS1組、si-NC組、si-LncRNA DLX6-AS1組。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組HMECs以5×103個(gè)/孔接種96孔板，培養(yǎng)48 h后替換為含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基，孵育2 h后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度(OD)值。細(xì)胞增殖率(%)=實(shí)驗(yàn)OD/對(duì)照OD×100%

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 將各組HMECs重懸在不含胎牛血清ECM中，取200 μl密度為1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液接種到上室，將600 μl含20%胎牛血清ECM加入下室。培養(yǎng)箱孵育24 h后，用5%戊二醛固定穿膜細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色。以顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野細(xì)胞數(shù)均值表示HMECs遷移數(shù)量。侵襲檢測(cè)采用包被基質(zhì)膠的上室，其他步驟參考遷移檢測(cè)。

1.2.6Western印跡檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白水平 向各組HMECs中加入細(xì)胞裂解緩沖液4℃孵育15 min，離心收集上清即為蛋白樣品。通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，封閉膜后，在4℃下用一抗孵育10 h。隨后與二抗在室溫下孵育1 h，滴加顯影液顯影，以Image J軟件測(cè)得的靶蛋白和內(nèi)參β-actin灰度值比值表示靶蛋白表達(dá)量。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) starBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示LncRNA DLX6-AS1和miR-374a-3p序列之間存在特異性結(jié)合區(qū)。構(gòu)建野生型(WT)報(bào)告載體LncRNA DLX6-AS1-WT和突變型(MUT)報(bào)告載體LncRNA DLX6-AS1-MUT。將報(bào)告載體分別與miR-374a-3p模擬物、miR-NC共轉(zhuǎn)染到HMECs中，轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細(xì)胞、裂解細(xì)胞，離心收集上清，測(cè)量相對(duì)熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1DM組和對(duì)照組創(chuàng)面組織中LncRNA DLX6-AS1和miR-374a-3p和表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，DM組創(chuàng)面組織中LncRNA DLX6-AS1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-374a-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2高糖處理HMECs細(xì)胞模型中miR-374a-3p和LncRNA DLX6-AS1表達(dá)情況 與NC組比較，HG組HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-374a-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 兩組創(chuàng)面組織中miR-374a-3p和 LncRNA DLX6-AS1表達(dá)情況

表2 高糖處理HMECs的細(xì)胞模型中miR-374a-3p和 LncRNA DLX6-AS1表達(dá)情況

2.3下調(diào)LncRNA DLX6-AS1對(duì)高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響 與NC組比較，HG組HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與si-NC+HG組比較，si-LncRNA DLX6-AS1+HG組HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1和表3。

1～4：NC組，HG組，si-NC+HG組，si-LncRNA DLX6-AS1+HG組圖1 Western印跡檢測(cè)CyclinD1、MMP-2和 MMP-9的蛋白表達(dá)

表3 下調(diào)LncRNA DLX6-AS1對(duì)高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響

2.4上調(diào)miR-374a-3p對(duì)高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC+HG組比較，miR-374a-3p+HG組HMECs中miR-374a-3p表達(dá)水平、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表4和圖2。

表4 上調(diào)miR-374a-3p對(duì)高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響

1，2：miR-NC+HG組，miR-374a-3p+HG組圖2 Western印跡檢測(cè)CyclinD1、MMP-2和 MMP-9蛋白的表達(dá)

2.5LncRNA DLX6-AS1靶向調(diào)控miR-374a-3p的表達(dá) starbase預(yù)測(cè)到miR-374a-3p和LncRNA DLX6-AS1存在特異性結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。同與LncRNA DLX6-AS1-WT共轉(zhuǎn)染時(shí)，與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-374a-3p模擬物可降低HMECs相對(duì)熒光素酶活性(P<0.05)，見(jiàn)表5。與pcDNA組比較，pcDNA-LncRNA DLX6-AS1組HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-374a-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-LncRNA DLX6-AS1組HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-374a-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表6。

圖3 starbase對(duì)miR-374a-3p和LncRNA DLX6-AS1結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖

2.6下調(diào)miR-374a-3p可以逆轉(zhuǎn)LncRNA DLX6-AS1低表達(dá)對(duì)高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響 與anti-miR-NC+si-LncRNA DLX6-AS1+HG組比較，anti-miR-374a-3p+ si-LncRNA DLX6-AS1+HG組HMECs中miR-374a-3p表達(dá)水平、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4和表7。

表5 相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè)

表6 RT-qPCR檢測(cè)LncRNA DLX6-AS1和 miR-374a-3p的表達(dá)

1，2：anti-miR-NC+si-LncRNA DLX6-AS1+HG組，anti-miR-374a-3p+si-LncRNA DLX6-AS1+HG組圖4 Western印跡檢測(cè)CyclinD1、 MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

表7 下調(diào)miR-374a-3p可以逆轉(zhuǎn)LncRNA DLX6-AS1低表達(dá)對(duì)高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

盡管已有抗生素治療、清創(chuàng)、高壓氧治療、控制血糖等促進(jìn)創(chuàng)面愈合方法，但在臨床上仍有多數(shù)DM患者因創(chuàng)面愈合不良最終不得不選擇截肢。研究發(fā)現(xiàn)DM創(chuàng)面中存在大量差異表達(dá)的非編碼RNA(ncRNA)。LncRNA GAS5在DM足部潰瘍患者皮膚組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)LncRNA GAS5促進(jìn)高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和管形成，加速創(chuàng)面愈合〔10〕。LncRNA MALAT1通過(guò)激活HIF-1α信號(hào)通路促進(jìn)DM小鼠成纖維細(xì)胞的活化和創(chuàng)面膠原表達(dá)〔11〕。miR-296-5p可提高DM創(chuàng)面的愈合率〔12〕。因此，ncRNA可能是促進(jìn)DM創(chuàng)面愈合的有效分子工具。本研究檢測(cè)到DM患者創(chuàng)面組織、高糖處理的HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達(dá)顯著升高，miR-374a-3p表達(dá)顯著降低，提示LncRNA DLX6-AS1和miR-374a-3p異常表達(dá)可能是DM患者創(chuàng)面愈合不良的原因之一。功能實(shí)驗(yàn)表明，高糖處理可抑制HMECs增殖、遷移和侵襲，下調(diào)CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平，表明高糖通過(guò)抑制HMECs生物活性來(lái)阻止創(chuàng)面愈合。研究表明LncRNA DLX6-AS1通過(guò)多種機(jī)制參與細(xì)胞生物活性的調(diào)控。例如，在急性腎損傷中敲低LncRNA DLX6-AS1可抑制脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞毒性和細(xì)胞焦亡〔13〕。LncRNA DLX6-AS1通過(guò)靶向參與缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡〔14〕。此外，下調(diào)lncRNA SNHG5可通過(guò)調(diào)控miR-374a-3p來(lái)緩解膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)LncRNA DLX6-AS1或上調(diào)miR-374a-3p表達(dá)均能夠促進(jìn)HMECs增殖、遷移和侵襲，表明下調(diào)LncRNA DLX6-AS1或上調(diào)miR-374a-3p可能通過(guò)增加HMECs增殖、遷移和侵襲能力來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

LncRNA可作為miRNA的分子海綿參與DM創(chuàng)面愈合進(jìn)展〔16,17〕。本研究證實(shí)miR-374a-3p是LncRNA DLX6-AS1的直接靶基因，且miR-374a-3p表達(dá)受到LncRNA DLX6-AS1負(fù)性調(diào)控。下調(diào)LncRNA DLX6-AS1與上調(diào)miR-374a-3p對(duì)CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)及HMECs增殖、遷移、侵襲的影響相吻合，且下調(diào)miR-374a-3p顯著減弱LncRNA DLX6-AS1低表達(dá)對(duì)HMECs生物學(xué)功能和CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響，表明靶向miR-374a-3p是LncRNA DLX6-AS1調(diào)控HMECs增殖、遷移和侵襲的重要機(jī)制。

綜上，DM患者創(chuàng)面組織中LncRNA DLX6-AS1表達(dá)增加，miR-374a-3p表達(dá)減少。下調(diào)LncRNA DLX6-AS1通過(guò)促進(jìn)miR-374a-3p表達(dá)可誘導(dǎo)HMECs增殖、遷移和侵襲。因此，靶向抑制LncRNA DLX6-AS1/miR-374a-3p途徑可能是促進(jìn)DM患者創(chuàng)面愈合的重要策略。