胡澤斌 曲守方 黃傳峰 黃杰

肌萎縮蛋白基因（dystrophin）位于染色體Xp21.2，包括79 個外顯子，其編碼的蛋白稱為抗肌萎縮蛋白，分布于骨骼肌和心肌的細(xì)胞膜上［1］。肌萎縮蛋白基因的變異約70%～80%為一個或多個外顯子缺失突變，重復(fù)突變約占5%～10%，其余20%～30%為點突變［2］。杜氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是由于肌萎縮蛋白基因變異引起的X 連鎖隱性遺傳性肌肉疾病，患者大多癥狀嚴(yán)重，伴心肌損害，一般于12 歲前即失去行走能力，多為男性發(fā)病，女性大多為DMD 攜帶者無癥狀［3］。

國內(nèi)有多家公司開展不同檢測方法的人肌營養(yǎng)不良蛋白基因檢測試劑盒的研發(fā)，尚未獲得國家藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)上市。中國食品藥品檢定研究院研制了杜氏肌營養(yǎng)不良基因突變檢測國家參考品，包括DMD 基因外顯子缺失、重復(fù)及點突變等變異類型［4］。本研究使用國家參考品，對人肌營養(yǎng)不良蛋白基因（DMD）檢測試劑盒（熒光PCR-毛細(xì)管電泳法）的準(zhǔn)確性和特異性進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 樣本

杜氏肌營養(yǎng)不良基因突變檢測國家參考品，由中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）提供。

1.2 試劑

人肌營養(yǎng)不良蛋白基因（DMD）檢測試劑盒（熒光PCR-毛細(xì)管電泳法）由廈門百歐迅生物科技有限公司提供；GeneScan 500 LIZ Size Standard 和Hi-Di Formamide，購自美國Applied Biosystems 公司。

1.3 儀器

PCR 擴(kuò)增儀，型號：T100，購自美國BIO RAD公司；基因分析儀，型號：3500Dx，購自美國Life Technologies 公司。

1.4 檢測

按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，將國家參考品基因組DNA 分別加入到DMD 引物混合液1 和DMD 引物混合液2 等兩個PCR 反應(yīng)體系中，PCR擴(kuò)增程序：95℃5 min；（95℃30 S，57℃45 S，72℃90 S），25 個循環(huán)；72℃45 min；4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，取1 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物1、1 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物2 和10 μL 1% GeneScan 500 LIZ Size Standard（以10 μL GeneScan 500 LIZ Size Standard 加990 μL Hi-Di Formamide 配制），95℃變性3 min，立即放冰上2 min，在3500Dx 基因分析儀進(jìn)行檢測。反應(yīng)程序結(jié)束后，使用GeneMapper 軟件對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.5 結(jié)果判讀

根據(jù)各外顯子位點理論擴(kuò)增片段長度位置，選擇單一檢測峰。分別計算試劑盒檢測范圍內(nèi)的DMD 基因79 個外顯子的檢測峰與內(nèi)控峰（HBB和ACTB）的比值（R），根據(jù)檢測峰比值（R）范圍（REX1～REX79）進(jìn)行外顯子基因拷貝數(shù)判讀，判斷樣本是否為重復(fù)或者缺失突變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

以所有樣本相鄰拷貝數(shù)的檢測結(jié)果對應(yīng)R 值繪制ROC 曲線，以約登指數(shù)最大時的R 值確定為區(qū)分相鄰拷貝數(shù)的最佳檢測峰判斷R 值。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確性

對試劑盒范圍內(nèi)的性染色正常的DMD 基因缺失或者重復(fù)的國家參考品樣本，試劑盒均能準(zhǔn)確檢出標(biāo)示的相應(yīng)外顯子的缺失或者重復(fù)，試劑盒的準(zhǔn)確性很好。見表1、圖1。

圖1 外顯子缺失樣本CNGB030321-4 的準(zhǔn)確性結(jié)果Figure 1 The accuracy result of exon deletion mutation sample for CNGB030321-4

表1 試劑盒的準(zhǔn)確性結(jié)果Table 1 The accuracy result of kit

試劑盒對X0 單體的國家參考品37 號樣本的基因拷貝數(shù)的檢測結(jié)果為性別決定基因SRY 無檢測峰、1～4 號外顯子1 拷貝、5～7 號外顯子2 拷貝和8～79 號外顯子1 拷貝，按照試劑盒常規(guī)基因型判讀規(guī)則進(jìn)行判定的結(jié)果為1～4 號外顯子及8～79 號外顯子雜合缺失，與標(biāo)示的結(jié)果（5～7 號外顯子重復(fù)）并不符合。見圖2。

圖2 外顯子重復(fù)樣本CNGB030428-37 的準(zhǔn)確性結(jié)果Figure 2 The accuracy result of exon duplication mutation sample for CNGB030428-37

2.2 特異性

對試劑盒范圍外的DMD 基因點突變、微缺失以及未檢出致病突變的國家參考品樣本，試劑盒均未檢出試劑盒范圍內(nèi)1～79 號外顯子的缺失或者重復(fù)，判定結(jié)果為正常型，試劑盒的特異性很好。見表2、圖3。

圖3 外顯子點突變樣本CNGB030318-1 的特異性結(jié)果Figure 3 The specificity result of exon point mutation sample for CNGB030318-1

表2 試劑盒的特異性結(jié)果Table 2 The specificity result of kit

3 討論

針對DMD 基因變異的分子診斷技術(shù)，主要包括Sanger 測序法、多重連接探針擴(kuò)增（Multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA）、微陣列比較基因組雜交技術(shù)（array based comparative genomic hybridization，array-CGH）和二代測序技術(shù)（Next generation sequencing，NGS）等［5-8］。MLPA技術(shù)可以有效檢測DMD 基因外顯子的缺失和重復(fù)突變，但無法在所有外顯子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)點突變；熒光PCR-毛細(xì)管電泳法可以檢測DMD 基因在第1～79 號外顯子拷貝數(shù)（0、1、2、3）的缺失或重復(fù)突變，也不能檢測點突變或微缺失引起的DMD 基因異常。杜氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良是X 連鎖隱形遺傳病，患者多為男性，男性患者的雙親一般表型正常，母親為攜帶者。目前臨床上尚無有效的治療方法，采用對癥的綜合治療，因此遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷至關(guān)重要［9-11］。對于DMD 基因治療，美國食品藥品監(jiān)督管理局于2020年批準(zhǔn)日本新藥株式會社子公司NS Pharma 公司的藥物Viltepso，用于經(jīng)基因檢測證實存在突變、適合使用跳過第53 號外顯子（exon 53 skipping）治療的杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者［12-13］。DMD 基因變異檢測對遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和DMD 精確治療具有積極的臨床指導(dǎo)意義。

杜氏肌營養(yǎng)不良基因突變檢測國家參考品包括17 個外顯子缺失、3 個外顯子重復(fù)及10 個點突變的DMD 變異類型樣本，使用NGS 和MLPA 方法驗證?；跓晒釶CR-毛細(xì)管電泳法的檢測DMD 外顯子缺失或重復(fù)的試劑盒，DMD 基因拷貝數(shù)的判讀基于以下規(guī)則：正常女性性染色體為XX，兩條X 染色體上正常的DMD 基因1～79 號外顯子分別為1 拷貝，女性正常型為2 拷貝，當(dāng)其中一條X 染色體上的DMD 部分外顯子缺失或重復(fù)，其相應(yīng)外顯子的拷貝數(shù)即為1（雜合缺失）或3（雜合重復(fù)）；正常人類男性性染色體為XY，一條X 染色體上正常的DMD 基因1～79 號外顯子均為1 拷貝，DMD 部分外顯子的缺失或重復(fù)均導(dǎo)致其編碼的抗肌萎縮蛋白異常而發(fā)病，其相應(yīng)外顯子的拷貝數(shù)即為0（半合缺失）和2（半合重復(fù)）。研究結(jié)果顯示試劑盒對國家參考品37 號樣本的基因拷貝數(shù)檢測結(jié)果為1～4 號外顯子及8～79 號外顯子雜合缺失，與標(biāo)示為5～7 號外顯子重復(fù)的結(jié)果并不符合。查閱國家參考品的研究資料顯示37 號樣本為XX/X0 嵌合，并且XO 細(xì)胞所占比例偏高，XX部分為外顯子5～7 號雜合重復(fù)，X0 部分為外顯子5～7 號半合重復(fù)［4］。但當(dāng)X 性染色體數(shù)目異常時，如女性X0、XXX 和男性XXY 的X 染色體數(shù)目與正常人不同，因此其DMD 基因拷貝數(shù)的正常和異常判斷并不適用性染色體正常的規(guī)則。胚胎組織在發(fā)育過程中發(fā)生基因突變，可導(dǎo)致嵌合體發(fā)生，即一個個體具有2 個或2 個以上的細(xì)胞系。研究報道DMD 生殖細(xì)胞嵌合體遺傳家系，父母為生殖腺嵌合體，自身不發(fā)病，但可導(dǎo)致子代發(fā)生DMD 基因新發(fā)突變［14-15］。另有研究報道DMD 體細(xì)胞嵌合體遺傳家系，需考慮父源/母源均存在嵌合體突變的可能［16］。國家參考品37 號樣本是體細(xì)胞嵌合的樣本，試劑盒只檢測到XO細(xì)胞的外顯子5～7 號重復(fù)，結(jié)果表明試劑盒不適用檢測DMD 嵌合體樣本。因此試劑盒對樣本的DMD 基因拷貝數(shù)的分析應(yīng)結(jié)合其性染色體進(jìn)行綜合判斷，同時對嵌合樣本給出相應(yīng)的補(bǔ)充說明，才能避免檢測錯誤。

本研究結(jié)果顯示試劑盒對國家參考品中性染色體正常的DMD 基因缺失或者重復(fù)的樣本，均能準(zhǔn)確檢出標(biāo)示的相應(yīng)外顯子的缺失或者重復(fù)；對國家參考品中DMD 基因點突變、微缺失以及未檢出致病突變的樣本，均未檢出試劑盒范圍內(nèi)的1～79 號外顯子的缺失或者重復(fù)，具有很好的準(zhǔn)確性和特異性。國家參考品可以用于評價熒光PCR-毛細(xì)管電泳法的人肌營養(yǎng)不良蛋白基因檢測試劑盒的準(zhǔn)確性和特異性，拓寬了檢測方法的適用性。