劉振亞，張 萍，訾麗麗，朱天生*

（1.塔里木大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300; 2.塔里木大學(xué) 園藝與林學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

新疆光熱資源豐富，適合于棗樹的生長(zhǎng)，同時(shí)棗樹對(duì)氣候、土壤的適應(yīng)能力很強(qiáng)，耐土壤干旱、鹽堿和貧瘠，因此，近年來(lái)?xiàng)棙涞姆N植面積增長(zhǎng)很快，截止2019年底，紅棗的種植面積達(dá)到4.670×105hm2，產(chǎn)量達(dá)到3.728×106t［1］，但自2010年以來(lái)，駿棗縮果病的發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重，給農(nóng)戶造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。棗縮果病菌可在花期侵入和幼果期從果洼處侵入［2］，發(fā)病棗果從外向內(nèi)逐漸出現(xiàn)褐色壞死現(xiàn)象，病組織呈海綿狀，在成熟之前脫落［3］，造成減產(chǎn)。目前，對(duì)造成南疆地區(qū)縮果病的病原還存在爭(zhēng)議，報(bào)道的病原有細(xì)交鏈孢菌（Alternaria alternata）、實(shí)腐莖點(diǎn)霉［Phoma desturctiva Plowr］ Fusicoccum sp.、Coniothyrium sp.、細(xì)極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）、青霉菌（Penicillium expansum）、芽枝孢菌（Cladosporium tenuissimum）、聚生小穴殼菌（Dothiorella gregaria Sacc）［4-12］。由于不同學(xué)者對(duì)棗縮果病的病原看法不一，這導(dǎo)致了棗縮果病的防治困難。因此，本研究對(duì)引起新疆南疆駿棗縮果病的鏈格孢屬真菌進(jìn)行形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀等形態(tài)學(xué)研究，并結(jié)合18 S rDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin、ATPase基 因 進(jìn) 行測(cè)序和序列分析，對(duì)其病原菌進(jìn)行鑒定，以期明確新疆南疆駿棗縮果病的病原種類，為縮果病的防治奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從和田、喀什、阿克蘇采集具有典型癥狀的縮果病的病樣，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與培養(yǎng) 病原菌的分離與純化采用常規(guī)組織分離法［13］。將分離物置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在菌落邊緣挑取形態(tài)比較單一的菌絲塊轉(zhuǎn)接到新的PDA上培養(yǎng)，進(jìn)行2～3次純化后，最后的單孢純化保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測(cè)定 將單孢分離所得到的純菌株接種在PDA培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)5 d后，用無(wú)菌水制成孢子懸浮液，置于10×40倍顯微鏡下鏡檢，每個(gè)視野的懸浮液中孢子量為20～40個(gè)分生孢子，將采集的健康無(wú)傷的棗果實(shí)用75%酒精進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水將棗果實(shí)清洗干凈，用無(wú)菌牙簽刺孔，在超凈工作臺(tái)中將孢子懸浮液噴霧接種到有傷的棗果實(shí)上，無(wú)菌水作為對(duì)照，然后放入事先鋪有濕潤(rùn)濾紙的搪瓷盆中，每個(gè)代表菌株接種3個(gè)果實(shí)，28 ℃條件下，12 h光照與12 h黑暗交替培養(yǎng)，每日觀察病斑生長(zhǎng)情況，5 d后測(cè)量病斑直徑，并對(duì)發(fā)病果實(shí)進(jìn)行再分離［4］。

1.2.3 病原菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將病原菌接種到PCA培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中按12 h光照和12 h黑暗交替培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，制成玻片在顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)［14］。

產(chǎn)孢表型觀察的具體方法：將比載玻片略小的濾紙中心裁剪出1 cm×3 cm的長(zhǎng)方形小孔，用透明膠帶將其緊貼在載玻片上并放在有2層濾紙的培養(yǎng)皿中一起滅菌，滅菌后，挑取在PCA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌落邊緣并涂抹在載玻片上的濾紙一側(cè)，然后放在有近紫外燈和日光燈的培養(yǎng)箱中，25 ℃、12 h光照與12 h黑暗交替培養(yǎng)5 d后，在徠卡熒光數(shù)碼顯微鏡下觀察代表該菌株總體特征的產(chǎn)孢表型［15］。根據(jù)分生孢子、分生孢子梗和產(chǎn)孢表型等特征，參考張?zhí)煊睿?6］的研究，初步確定其屬種。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 將菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，用打孔器打取菌餅轉(zhuǎn)接到含有100 mL PDA的錐形瓶中，放在28 ℃轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中，培養(yǎng)2～3 d后，用無(wú)菌水沖洗，再用4層滅菌的紗布進(jìn)行過(guò)濾［17］，40 ℃烘干后放入滅菌EP管中備用。采用CTAB的方法提取基因組DNA［18］。

病原菌rDNA-ITS的擴(kuò)增采用通用的引物ITS1和ITS4，EF-1α基因的擴(kuò)增采用引物EF1-728F和EF1-986R，β-tubulin基因的擴(kuò)增采用Beta-F和Beta-R，ATPase基因的擴(kuò)增采用引物ATPDF1和ATPDR1［19-20］。

表1 PCR所需引物及其序列

通 用 引 物ITS1與ITS4、EF-1α、β-tubulin，以及ATPase基因擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件分別參考唐淬［21］和臧睿［22］的實(shí)驗(yàn)方法。將引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得序列后，登陸GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，下載鏈格孢屬真菌序列，應(yīng)用MEGA 6.06軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建聚類分析樹狀圖［23］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

采用常規(guī)組織分離法，共分離純化獲得15個(gè)分離物，根據(jù)分離物、菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子基本形態(tài)的相似性進(jìn)行合并，并分類編號(hào)，初步確定為4種真菌分離物，編號(hào)分別為NJZZ-1、NJZZ-2、NJAA-3、NJZZ-4。

2.2 致病性測(cè)定結(jié)果

將NJZZ-1、NJZZ-2、NJAA-3、NJZZ-4接種到棗果實(shí)上，其中NJZZ-2刺傷接種后的棗果，6 d后可觀察到接種部位出現(xiàn)紅褐色的橢圓形病斑，在6～10 d病斑逐漸擴(kuò)大，并且接種部位呈黑褐色，后期凹陷和軟爛。而NJZZ-1、NJAA-3和NJZZ-4刺傷接種后，沒(méi)有出現(xiàn)縮果病的癥狀，說(shuō)明NJZZ-1、NJAA-3和NJZZ-4不是棗縮果病的病原。將NJZZ-2接種到健康的棗果實(shí)上，將發(fā)病的棗果再分離接種到其純培養(yǎng)基上，性狀與NJZZ-2相同，根據(jù)柯赫氏法則，確定NJZZ-2為菌株的病原菌。對(duì)照處理不發(fā)病。

2.3 病原菌的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 將NJZZ-2接種在PCA平板上，在25 ℃近紫外燈和日光燈下12 h光照與12 h黑暗交替培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，菌落直徑5.5 cm，菌落為致密絨毛狀，生長(zhǎng)初期為白色，菌落邊緣較整齊，菌落背面青綠色，中心深褐色；在PCA+濾紙上，培養(yǎng)5 d后，形成較短且多分枝的分生孢子梗，分生孢子梗上長(zhǎng)3～7個(gè)分生孢子，分生孢子呈倒梨形或棒形，淡褐色，表面光滑，具有橫縱隔膜1～6個(gè)，分隔處不縊縮，孢身（15.6～40.43） μm×（6.8～13.27） μm，喙 有長(zhǎng)、有短，呈淡褐色，大小為（0～20.5） μm×（2.35～4.53） μm（圖2）；根據(jù)菌株的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，參照張?zhí)煊睢吨袊?guó)真菌志·鏈格孢屬》［16］一文研究的標(biāo)準(zhǔn)，將其初步鑒定為鏈格孢屬的鏈格孢菌［Alternaria alternata （Fr.） Keissler］。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 登陸NCBI網(wǎng)站將獲得的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，下載相似序列，用MEGA 6.06軟件中的Neighbour-joining方法構(gòu)建聚類分析樹狀圖。通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，樣品菌株ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中鏈格孢屬ITS序列的相似度均達(dá)到100%，選擇一些序列進(jìn)行下載，構(gòu)建發(fā)育樹（圖3）顯示，NJZZ-2與下載的序列聚在一個(gè)大的分枝下，因此，僅通過(guò)ITS基因序列無(wú)法鑒定出樣品菌株的具體種類。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

將樣品序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，樣品菌株EF-1α序列與鏈格孢屬的幾株真菌序列相似度在99%以上，通過(guò)下載這些序列與樣品菌株序列共同構(gòu)建EF-1α系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）顯示，NJZZ-2與不同登錄號(hào)的A. alternata、A. tenuissima、A. longipes聚為一分枝，這說(shuō)明不同登錄號(hào)鏈格孢屬菌株與NJZZ-2之間的同源性高，利用DANMAN軟件將NJZZ-2與鏈格孢屬17種真菌的核苷酸的一致性進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，NJZZ-2與A. alternata（MN473125、KY094928、KU145274、MK248718、MW848791）的一致性最高，與不同登錄號(hào)A. tenuissima的一致性大部分達(dá)到82%以上（表2），說(shuō)明采用EF-1α基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，無(wú)法有效區(qū)分A. alternata和A. tenuissima這2個(gè)種。

表2 NJZZ-2樣品菌株與鏈格孢屬17種EF-1α真菌序列一致性比較

圖4 基于EF-1α序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

下載與樣品β-tubulin序列相似度在96%以上的鏈格孢屬真菌序列，構(gòu)建β-tubulin系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）顯示，NJZZ-2與A. alternata、A. tenuissima、A. arborescens的同源性最高，聚為一個(gè)分支，利用DANMAN軟件將NJZZ-2與鏈格孢屬15種真菌的核苷酸的一致性進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，NJZZ-2與A.alternata （MG558003、MG925327）的一致性最高，達(dá)到95%以上（表3），因此，將NJZZ-2鑒定為A.alternata。

表3 NJZZ-2樣品菌株與鏈格孢屬15種β-tubulin真菌序列一致性比較

圖5 基于β-tubulin序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

下載與樣品ATPase序列相似度在98%以上的鏈格孢屬真菌序列，通過(guò)構(gòu)建ATPase序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）顯示，NJZZ-2與A. alternata （MH492 683、MF741789、MH492682、MN175530）和A. interrupta（MH092840）聚為一個(gè)分支。利用DANMAN軟件將NJZZ-2與鏈格孢屬12種真菌的核苷酸的一致性進(jìn)行比對(duì)（表4）發(fā)現(xiàn)，NJZZ-2與A. alternata和A.tenuissima的一致性無(wú)差異，說(shuō)明ATPase序列無(wú)法有效區(qū)分鏈格孢屬的不同種。

表4 NJZZ-2樣品菌株與鏈格孢屬12種ATPase真菌序列一致性比較

圖6 基于ATPase序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

鏈格孢屬病原菌的寄主范圍很廣泛，可引起多種植物和作物病害［24］。馬連杰［25-26］等研究結(jié)果表明，A. alternata是引起重慶地區(qū)蠶豆葉部病害和北京、山西葡萄葉斑病的病原之一；宜昌的核桃黑斑?。?7］、 河北省張北縣及內(nèi)蒙古烏蘭察布市萵筍葉斑病［28］、貴州省貴陽(yáng)市樹莓葉斑病［29］、青海省青貯玉米葉枯?。?0］、湖南牡丹黑斑?。?1］等都是鏈格孢屬真菌引起的。而對(duì)鏈格孢屬的病原，特別是小孢子種的鑒定又很困難，原因在于鏈格孢屬的小孢子種的形態(tài)特征不一致，同一種分生孢子具有不同的形態(tài)特征，其變化幅度較大，不同的小孢子種在相同的人工培養(yǎng)條件下，分生孢子具有趨同現(xiàn)象，這給從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定小孢子種帶來(lái)了很大困難［14］，因此，需要結(jié)合分子生物學(xué)手段確定其分類。研究發(fā)現(xiàn)，僅通過(guò)ITS序列無(wú)法區(qū)分鏈格孢屬的不同種，這與段麗君等［32］的研究結(jié)論一致。準(zhǔn)確鑒定鏈格孢屬的不同種，還需要結(jié)合其他基因序列，如王志霞等［19］通過(guò)培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和18 S rDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，將新疆矮化密植棗園紅棗葉斑病的病原菌鑒定為A. alternata。許陽(yáng)［33］利用鏈格孢菌的特異性引物對(duì)河北和河南地區(qū)的棗縮果病鑒定為A.alternata。祖艷青［34］利用ITS、Gpd、RPB2、OPA2-1、ACT基因區(qū)段將新的未知種與其他種區(qū)分開。但本研究結(jié)果顯示，采用ITS、EF-1α序列和ATPase基因序列無(wú)法將棗縮果病鑒定到具體種類，由此可以看出，鑒定鏈格孢屬小孢子種的困難程度。

本研究采用β-tubulin基因序列及DANMAN軟件分析了病原核苷酸的一致性，并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，將新疆南疆駿棗縮果病的病原鑒定為A.alternata （Fr.） Keissler。