肖同杰，陳廿虹，張翠俠，展學(xué)孔，宋彥廷

(1 海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué)藥學(xué)院，海南 海口 570228；2 海南椰島酒業(yè)發(fā)展有限公司，海南 ?？?570311)

南海是我國最大的海域，具有豐富的動物資源，包括十幾種棘皮動物，以海參、海星、海膽等居多。其中，海參因營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值可媲美人參而得名，位列“八珍”之一[1-2]。海參具有多種養(yǎng)生滋補(bǔ)成分，除了常見的維生素和氨基酸等成分，還含有多種活性物質(zhì)，譬如海參多糖、皂苷等。有研究表明，海參具有抗真菌、抗腫瘤、降血脂、提高免疫力、抗疲勞等生理活性[3-9]。這些活性成分對于人體大有裨益，也使海參成為深受人們歡迎的滋補(bǔ)圣品。

玉足海參(Holothurialeucospilota)屬棘皮動物門，海參綱，楯手目，是海參科，海參屬的一種海參，主要分布于我國海南島等島嶼以及部分沿海城市[10]。2012年海南省成功繁育出玉足海參苗種，2013年玉足海參池塘養(yǎng)殖取得成功并建立規(guī)?；酿B(yǎng)殖基地[11]。在現(xiàn)有的研究中，大部分學(xué)者在對海參的生物活性成分進(jìn)行提取和檢測時(shí)，一般直接選用市售的鮮海參，干海參或海參加工品，很少針對某一品種海參所含物質(zhì)進(jìn)行分析[12]。本文選用玉足海參，對其水分、灰分、鹽分、蛋白質(zhì)、水溶性總糖、含砂量以及復(fù)水后干重率等重要指標(biāo)和活性成分(海參多糖、海參皂苷、海參腦苷脂和神經(jīng)酰胺等)進(jìn)行檢測分析和含量測定，以期為南海玉足海參的開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

玉足海參采集于海南省瓊海市海域，經(jīng)煮熟后曬干而成。乙二胺四乙酸，德國BioFRoxx公司；半胱氨酸鹽酸鹽，德國BioFRoxx公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，以上試劑均為分析純。巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度：99%)，上海麥克林生化科技有限公司；乳糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，CATO廣州佳途科技股份有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；神經(jīng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，上海準(zhǔn)甄生物科技有限公司；葡萄糖腦苷脂標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100，上海愛朗儀器有限公司；高效液相色譜儀LC-100，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；紫外檢測器LC-UV100，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；蒸發(fā)光散射檢測器LC-ELSD100，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；渦旋混合器XW-80A，上海唐馳電子有限公司；紫外可見分光光度計(jì)UV-2600，SHIMADZU島津公司；馬弗爐SX2-NP，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；真空干燥箱DZF-6020，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床OLB-100C，山東博科科學(xué)儀器有限公司。

1.2 分析方法

水分含量依據(jù)GB 5009.3-2016采用直接干燥法進(jìn)行測定[13]；灰分含量依據(jù)GB 5009.4-2016采用高溫灼燒法進(jìn)行測定[14]；鹽分含量依據(jù)GB 5009.44-2016采用銀量法進(jìn)行測定[15]；含砂量及復(fù)水后干重率依據(jù)GB 31602-2015進(jìn)行測定[16]；蛋白質(zhì)含量依據(jù)GB 5009.5-2016采用分光光度法進(jìn)行測定[17]。

1.2.1 水溶性總糖含量測定

取整只干海參，稱重，置于1000 mL燒杯中，浸泡24 h，剖開參體，清洗泥沙。過濾洗液，取濾液100 mL置于250 mL圓底燒瓶中，加入30 mL濃鹽酸。回流提取3 h，過濾，清洗濾渣，將濾液和洗液合并轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(100 mg/L)并轉(zhuǎn)移至10 mL試管，加水至1 mL。依次加入1 mL 5%苯酚溶液、濃硫酸，靜置10 min。渦旋混合，30 ℃水浴20 min。于490 nm處測吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：吸取試樣溶液1 mL，按上述方法測定。

1.2.2 海參多糖含量測定

稱取海參干粉1 g置于50 mL三角瓶中，加入25 mL 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液、37 mg乙二胺四乙酸、22 mg半胱氨酸鹽酸鹽以及100 mg木瓜蛋白酶，渦旋混勻，60 ℃氣浴振蕩酶解24 h，9000 r/min離心10 min。取上清液，加入6.13 g乙酸鉀，4 ℃靜置12 h后，離心收集沉淀，5 mL水溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中。

取1 mL試液于5 mL安瓿瓶中，加入1 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液，充氮封管，110 ℃水解8 h，氮?dú)獯蹈?，? mL水溶解，用0.3 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.5～7.5后轉(zhuǎn)移入5 mL容量瓶。

圖1 玉足海參多糖色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別移取濃度為0.1、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol/L的巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)液400 μL于10 mL具塞試管中，加入50 μL 2 mmol/L乳糖溶液、450 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和450 μL 0.3 mol/L氫氧化鈉溶液，渦旋混合，70 ℃水浴30 min，冷卻后，加450 μL 0.3 mol/L鹽酸溶液，渦旋混合，加1 mL氯仿，取上層溶液，重復(fù)三次，上層水相過0.45 μm濾膜，供液相色譜分析，樣品測定同上。

(1)色譜條件

色譜柱：XDB-C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；柱溫：25 ℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量20 μL；流速1.0 mL/min；流動相A：磷酸鹽-乙腈溶液(17:3)流動相B：磷酸鹽-乙腈溶液(3:2)。梯度洗脫程序：0～10 min，100%～90% A；10～40 min，92%～63% A；40～45 min，63%～100% A。

1.2.3 海參神經(jīng)酰胺與腦苷脂含量測定

稱取0.1 g海參干粉，加入6 mL氯仿-甲醇溶液(2:1)超聲提取15 min，過濾，重復(fù)提取3次。將濾液用氮?dú)獯蹈桑? mL水溶解后，加入2 mL正己烷萃取，重復(fù)3次，將有機(jī)相合并后用氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 4 mol/L氫氧化鉀溶液和1 mL甲醇，37 ℃水浴60 min，加入0.8 mL水，2 mL氯仿萃取，萃取3次，氮?dú)獯蹈伞Ｊ褂眉状既芙庥?0 mL容量瓶中。樣品溶液過0.22 μm濾膜，供液相色譜分析[18]。

圖2 玉足海參海參中神經(jīng)酰胺、腦苷脂色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別稱取葡萄糖腦苷脂和神經(jīng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，甲醇溶解于10 mL容量瓶中。制備2.5、5、25、50、100、150、250 μg/mL系列混合對照品溶液，供液相色譜分析。

(1)色譜條件

色譜柱：TSK(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min； 進(jìn)樣量：20 μL。流動相A：正己烷-異丙醇溶液(99:1)，流動相B：二氯甲烷-甲醇溶液(60:40)；蒸發(fā)光散射檢測器：霧化氣為氮?dú)猓魉?.4 L/min，漂移管溫度50 ℃。梯度洗脫程序：0～12 min，100%～60% A；12～15 min，60%～40% A；15～17 min，40%～40% A；17～18 min，40%～100% A。

1.2.4 海參皂苷含量測定

稱取海參干粉2 g，40 mL 60%乙醇溶液，冷凝回流1 h，重復(fù)3次，收集提取液，旋蒸至干燥，20 mL水溶解，用正丁醇萃取，重復(fù)三次，收集萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入60%甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品10 mg用甲醇溶液溶解于50 mL容量瓶中，取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL比色管，水浴鍋中蒸干溶劑。在蒸干后的比色管中依次加入5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴加熱15 min后，冰水冷卻5 min。然后分別加入5 mL冰醋酸，搖勻后，靜置10 min，于560 nm波長下測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：取0.1 mL試液同上述方法測定。

2 結(jié)果與討論

本文選用南海產(chǎn)玉足海參對其各營養(yǎng)成分進(jìn)行檢測分析和含量測定。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所選用的南海玉足干海參鹽分、水溶性總糖、水分含量、含砂量、復(fù)水后干重率分別為0.35%、2.4 mg/g、10%、2.2%、44.5%均符合國家標(biāo)準(zhǔn)?；曳趾繛?.73%，這與王遠(yuǎn)紅等所測得四種海參灰分含量范圍8.48%～18.33%較為接近。然而，不同品種海參之間的差異依然明顯[19]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出南海玉足海參中蛋白質(zhì)含量最高為32.9%；神經(jīng)酰胺含量最低僅有16.39 mg/kg。由此我們可以判斷蛋白質(zhì)為南海玉足海參的主要營養(yǎng)成分。然而相比于其他品種海參，南海玉足海參蛋白質(zhì)含量較低。韋丁和陳健對糙海參營養(yǎng)成分進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示其蛋白質(zhì)含量為70.75%[20]。井君等對7種海參的營養(yǎng)成分進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示不同品種的海參蛋白質(zhì)含量存在著差異，其測得含量范圍為38.09%～68.45%[21]。其他成分海參多糖、海參皂苷含量分別為49.7 mg/g、4.59 mg/g，其中海參多糖含量與王遠(yuǎn)紅等所測得的糙參多糖含量較為接近，海參皂苷含量與井君等所測得的黑玉參皂苷含量較為接近，但與其他品種海參相比存在一定差異[19-21]。海參神經(jīng)酰胺與腦苷脂含量分別為16.39 mg/kg、43.57 mg/kg，含量較低且與其他品種海參差異明顯[18]。這種差異的存在與海參的品種，生長環(huán)境，保存及處理?xiàng)l件等條件息息相關(guān)。

表1 玉足海參各營養(yǎng)成分含量(水分含量以濕基計(jì)，其余項(xiàng)以干基計(jì))

3 結(jié) 論

海參的品種多達(dá)一千多種，不同品種的海參其所含各種物質(zhì)的成分也不盡相同。本文選用南海產(chǎn)玉足海參對其各營養(yǎng)成分進(jìn)行檢測分析和含量測定。雖與其他品種海參營養(yǎng)成分含量比較，存在一定差異，但是均富含多糖和蛋白質(zhì)等生物活性成分，證明了玉足海參具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，為進(jìn)一步開發(fā)研究南海玉足海參提供參考依據(jù)。