王嶼森，范曉丹，張道虹，龔 毅，裴潤(rùn)竹，劉 爽，周王旭，張博琳

(天津城建大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，天津市水質(zhì)科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300384)

近年，我國(guó)染料的年產(chǎn)量可以占到70%，位居世界首位[1-2]。染料廢水是難處理工業(yè)廢水之一，染料及其降解產(chǎn)物能夠產(chǎn)生具有誘變和致癌性質(zhì)的劇毒芳香化合物[3-5]。而蒽醌染料是第二大類染料，在合成染料中占有重要的地位。蒽醌染料不僅結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難降解，還存在潛在的毒性，嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境[6]。染料廢水的常規(guī)處理方法包括吸附、膜分離、好氧法厭氧法、化學(xué)氧化和高級(jí)氧化等。國(guó)內(nèi)外以生物法為主，與物理、化學(xué)法相比，傳統(tǒng)生物法具有運(yùn)行成本低、操作簡(jiǎn)單、不會(huì)造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。近年來(lái)，人們致力于研發(fā)各種高效脫色菌株，利用其生物降解染料廢水中的污染物。已發(fā)現(xiàn)對(duì)染料廢水有降解作用的微生物，如細(xì)菌和真菌藻類等[9-10]，菌可通過自身的新陳代謝將染料降解中有毒物質(zhì)[11]分解成小分子物質(zhì)，大大降低了印染廢水的危害。

本研究從活性污泥中篩選對(duì)蒽醌分散藍(lán)2BLN染料廢水具有高效脫色能力的功能菌，研究影響其高效脫色的因素，探究其對(duì)蒽醌分散藍(lán)2BLN染料廢水的降解途徑。旨在為高效功能菌應(yīng)用于處理分散藍(lán)2BLN染料廢水提供理論研究成果。

1 材料與方法

1.1 染料廢水

分散藍(lán)2BLN染料廢水：實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 污泥馴化與菌種篩選

取天津市某污水處理廠的活性污泥，接種于含5 mg·L-1分散藍(lán)2BLN培養(yǎng)基中，30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的條件下振蕩，梯度馴化。將馴化后的活性污泥經(jīng)不同倍數(shù)(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8)稀釋后，取2 μL均勻的涂布于LB固體培養(yǎng)基上(含10 mg·L-1分散藍(lán)2BLN)，30 ℃條下靜置培養(yǎng)2 d，經(jīng)過3～4分離純化后，得到一株對(duì)可降解蒽醌分散藍(lán)2BLN染料的高效功能菌，命名為GN-1。

1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂粉、氯化鈉、pH為7.0。

富集培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母浸膏、氯化鈉、pH為7.0。

脫色培養(yǎng)基：蒽醌分散藍(lán)2BLN染料、葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉、三氯化鐵、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、無(wú)水氯化鈣、pH為7.0。

1.4 菌種鑒定

提取菌株基因組DNA作為模板，使用上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和下游引物1492R：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增、凝膠電泳和純化回收等步驟，將獲得的16rDNA序列通過BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)比對(duì)分析進(jìn)行菌種鑒定。

1.5 菌種的脫色試驗(yàn)

將菌株GN-1接種到200 mL液體培養(yǎng)基中，在30 ℃和轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的條件下富集得到菌液，將20 mL菌液加入到180 mL脫色培養(yǎng)基中進(jìn)行脫色試驗(yàn)。30 ℃、pH=7、葡萄糖、蛋白胨為碳氮源條件下靜置培養(yǎng)，每隔2 h取上清液進(jìn)行離心15 min，在538 nm處測(cè)離心后上清液吸光度，并依據(jù)下列公式計(jì)算脫色率。

(1)

式中：T為脫色率，%;A為復(fù)雜染料廢水初始吸光度;At為染料廢水反應(yīng)后吸光度。

1.6 菌株GN-1對(duì)分散藍(lán)2BLN染料廢水脫色影響因素的研究

將20 mL富集后的菌株GN-1種子液接種到180 mL脫色養(yǎng)基中，研究不同碳氮源、溫度、pH值、分散藍(lán)2BLN染料廢水初始濃度、NaCl濃度以及菌種的接種量等因素，見表1所示，對(duì)菌株GN-1脫色能力的影響。

表1 脫色的影響因素

1.7 分析方法

1.7.1 紫外-可見光譜分析

將種子液按接種量為10%(V/V)接種于含60 mg·L-1分散藍(lán)2BLN的選擇培養(yǎng)基中，在30 ℃，150 r·min-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔一段時(shí)間從中取出4 mL，取離心后的上清液，用紫外—分光光度計(jì)在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分析分散藍(lán)2BLN染料廢水的降解產(chǎn)物。

1.7.2 GC-MS分析

將處理后水樣和原水水樣固相萃取后按照一定條件進(jìn)行GC-MS分析，分析分散藍(lán)2BLN染料廢水的降解產(chǎn)物。

2 結(jié)果的分析與討論

2.1 脫色菌株的鑒定

經(jīng)分離、純化后得到菌株GN-1經(jīng)染色后呈紅色，為革蘭式陰性菌，菌株GN-1的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表2所示。

表2 菌株GN-1的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)菌株GN-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序，測(cè)得序列長(zhǎng)13966bp，該序列與嗜水氣單胞菌屬(Aeromonashydrophila)的序列同源性較高,其登錄的序列號(hào)為MK007301.1，判斷該菌為嗜水氣單胞菌。

2.2 菌株GN-1脫色的影響因素

圖1 溫度對(duì)菌株GN -1脫色效果的影響

圖1是溫度對(duì)菌株GN-1脫色效果的影響，由圖1可得，在20～40 ℃對(duì)分散藍(lán)2BLN染料廢水的脫色率隨溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。在20 ℃時(shí)，脫色率僅為40.9%，溫度在30～35 ℃時(shí)脫色效果顯著，脫色率都可達(dá)到80%以上，30 ℃時(shí)其脫色率高達(dá)85.29%，這是因?yàn)槲⑸锏纳锝到饣钚允軠囟鹊挠绊慬12]，溫度過低，抑制微生物的生長(zhǎng)，使酶的活性降低，代謝效率下降，不利于菌株GN -1降解染料。當(dāng)溫度40 ℃時(shí)脫色率明顯下降僅為30.19%，這是因?yàn)闇囟鹊纳唠m然可以增大酶的活性，但會(huì)加速菌株的老化和代謝衰退，因此菌株GN-1最適溫度為35 ℃，表明屬于嗜中溫菌。Bouraie等[13]在研究嗜水性氣單胞菌降解染料活性黑5時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本研究一致。

圖2 接種量對(duì)菌株GN -1脫色效果的影響

圖2是接種量對(duì)菌株GN -1脫色效果的影響。 由圖2可知，分散藍(lán)2BLN的脫色率與接種量呈正相關(guān)，當(dāng)接種量為10%時(shí)，6 d脫色率為92%，接種量為20%時(shí)，僅4 d脫色率就高達(dá)96.27%，說(shuō)明加大接種量可以縮短反應(yīng)周期；當(dāng)接種量大于10%時(shí)，4 d的接種量均達(dá)到80%以上，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色率并無(wú)明顯的增大，這是因?yàn)榫N濃度過大時(shí)，菌體之間相互競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致菌株處于貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，在一定程度上限制了菌株生長(zhǎng)代謝，使得降解緩慢，由此可見當(dāng)投加量大于10%時(shí)，脫色率增強(qiáng)的不明顯，所以從經(jīng)濟(jì)效益角度考慮菌株GN-1的最佳接種量為10%。

圖3 鹽度值對(duì)菌株GN -1脫色效果的影響

圖3是鹽度對(duì)菌株GN-1脫色效果的影響，由圖3可見，當(dāng)鹽度為1%時(shí)，脫色率達(dá)到最大值84.57%，當(dāng)鹽度從3%～10%逐漸增大，分散藍(lán)2BLN的脫色率逐漸減小。這是由于鹽分過高，導(dǎo)致溶液中基質(zhì)的傳輸速率下降，造成降解染料的關(guān)鍵性作用酶失活，能夠改變滲透壓，造成菌株脫水死亡，進(jìn)而影響微生物對(duì)染料的降解。由此可以得出，菌株GN-1的鹽耐受性不是很好。

圖4是pH對(duì)菌株GN-1脫色效果的影響，由圖4可知，pH在2～10范圍時(shí)脫色率呈先增后減的趨勢(shì)，pH=2 時(shí)，脫色率僅為26.35%，菌株GN-1在pH=6～8時(shí)對(duì)分散藍(lán)2BLN染料廢水的脫色效果較好，可達(dá)70%以上。在pH為7時(shí)脫色率可達(dá)到83.83%，當(dāng)pH值從7增加到10時(shí)脫色率快速下降，可知菌株GN-1最適pH為7。由此可知，菌株GN-1適合在弱酸、中性、弱堿性環(huán)境下降解分散藍(lán)2BLN染料廢水。據(jù)報(bào)道，克雷伯氏桿催產(chǎn)菌對(duì)活性黑5的脫色[15]以及StaphylococcusHominisSubsp.hominis DSM 20328對(duì)活性藍(lán)4的脫色[16]都表明菌株在中性條件能夠達(dá)到對(duì)染料更好的脫色率。

圖4 pH值對(duì)菌株GN -1脫色效果的影響

圖5和圖6是碳氮源對(duì)菌株GN-1脫色效果的影響，由圖5和圖6可見，以蛋白胨、葡萄糖為碳源時(shí)脫色率較高，均達(dá)到80%以上，而未投加碳源的脫色率僅為30.12%左右，此時(shí)分散藍(lán)2BLN對(duì)菌株GN-1的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的抑制作用，可知外加碳源可以明顯提高菌株GN-1的脫色能力，這表明菌株GN-1對(duì)分散藍(lán)2BLN通過共代謝的作用實(shí)現(xiàn)脫色。以亞硝酸鈉、蛋白胨作為氮源時(shí)脫色率都可達(dá)到80%以上，脫色效果明顯， 而以尿素為氮源時(shí)，脫色率最差，僅為61%。氮源對(duì)分散藍(lán)2BLN的脫色效果影響差別不是很大。

圖5 氮源對(duì)菌株N1脫色效果的影響

圖6 碳源對(duì)菌株N1脫色效果的影響

圖7是染料初始濃度對(duì)菌株 GN-1脫色效果的影響，從圖7中可知，染料初始濃度與脫色率呈負(fù)相關(guān)，染料濃度在20～60 mg/L時(shí)，脫色率均達(dá)到80%以上，而隨著染料濃度的遞增，脫色效果急速下降，當(dāng)染料濃度為100 mg/L時(shí)，脫色率僅為27.08%，因?yàn)榉稚⑺{(lán)2BLN具有生物毒性，毒性隨濃度的增高而增大，且其代謝過程產(chǎn)生并積累的高濃度中間產(chǎn)物對(duì)微生物細(xì)胞也有一定的毒性，能過抑制微生物生長(zhǎng)繁殖，降低了微生物生物量以及識(shí)別底物的相關(guān)性酶濃度的能力。

圖7 染料初始濃度對(duì)菌株GN-1脫色效果的影響

2.3 分散藍(lán)2BLN染料廢水的降解過程

本研究將高壓滅菌和未滅菌的種子液對(duì)分散藍(lán)2BLN的脫色效果進(jìn)行比對(duì)，如圖8所示。高壓滅菌的種子液對(duì)分散藍(lán)2BLN的去除率呈現(xiàn)出現(xiàn)增加后減少的趨勢(shì)，且在2 d時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，其去除率主要由于吸附作用。而另一組未滅菌的實(shí)驗(yàn)中，分散藍(lán)2BLN的去除率隨著反應(yīng)時(shí)間的增加持續(xù)遞增，在反應(yīng)10 d時(shí)，達(dá)到了100%的去除率。由此說(shuō)明菌株GN-1對(duì)分散藍(lán)2BLN的降解主要以生物降解為主，也伴隨了前期的吸附作用，但是吸附的作用很小。

圖8 滅菌與未滅菌對(duì)分散藍(lán)去除率的影響

2.4 紫外-可見光譜分析

圖9是菌株GN-1降解分散藍(lán)2BLN染料廢水過程中的紫外-可見吸收光譜圖，由圖9可知，分散藍(lán)2BLN在最大波長(zhǎng)625 nm處出現(xiàn)的吸收峰，隨著反應(yīng)的進(jìn)行逐漸降低，在10 d時(shí)基本消失，此現(xiàn)象是因?yàn)榉稚⑺{(lán)2BLN蒽醌鍵的斷裂，發(fā)色基團(tuán)消失所導(dǎo)致。分散藍(lán)2BLN在238 nm(峰3)和280 nm(峰2)處的吸收峰也隨著反應(yīng)時(shí)間的增加明顯降低，且在628 nm處發(fā)生了吸收峰的紫移，可能是因?yàn)?OH、-NH2等助色集團(tuán)的脫落，導(dǎo)致發(fā)色基團(tuán)上電子云密度下降所致；因此菌株GN-1對(duì)蒽醌分散藍(lán)的脫色主要是由于生物降解的作用。

圖9 紫外-可見吸收光譜圖

2.5 GC-MS分析

為進(jìn)一步分析菌株GN-1降解分散藍(lán)2BLN的途徑，本研究采用了GC-MS對(duì)其不同時(shí)間段的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，如表3所示，蒽醌分散藍(lán)2BLN的中間降解產(chǎn)物有N-(4-叔丁基苯基)(A)、鄰苯二甲酸二異丁酯(B)、N-2-(3,4-二羥苯基)-乙基甲胺(C)、2,3-二氫-1,3-二氧-1H-異吲哚-5-羧酸(D)、乙苯(E)、鄰二甲苯(F)、甲氧基乙酸甲酯(G)、3-amino-2,2,5,5-tetramethyl-1(H)。因而，推測(cè)菌株GN-1降解分散藍(lán)2BLN的途徑為共軛分散藍(lán)2BLN結(jié)構(gòu)受到氧化酶的攻擊，導(dǎo)致了染料顯色基團(tuán)斷裂，產(chǎn)生中間體A、B和C，化合物B通過氧化聚合轉(zhuǎn)化為D，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為G和H，化合物A和C分別轉(zhuǎn)化為E和F，最后化合物E、F、G和H發(fā)生環(huán)裂變和一系列的反應(yīng)。

表3 分散藍(lán)2BLN降解中間產(chǎn)物(1)

續(xù)表3

3 結(jié) 論

(1)從活性污泥中馴化分離出分散藍(lán)2BLN染料廢水高效脫色菌GN-1，鑒定為嗜水氣單胞菌屬(Aeromonashydrophila)，將其命名為GN-1。

(2)菌株GN-1對(duì)分散藍(lán)2BLN的脫色存在共代謝作用，以葡萄糖和蛋白胨作為碳氮源時(shí)，可以顯著提高其脫色率；而鹽度與脫色率呈負(fù)相關(guān)，隨著鹽度增加直至10%時(shí)，脫色率僅為16.91%；pH和溫度的增加對(duì)菌株GN-1降解分散藍(lán)2BLN染料廢水呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)；加大接種量不僅可以增大脫色率，同時(shí)減短了反應(yīng)周期；本研究最佳降解條件為：溫度為35 ℃；pH=7；鹽度1%；最佳接種量為10%。

(3)菌株GN-1對(duì)蒽醌分散藍(lán)2BLN的脫色以生物降解為主。共軛分散藍(lán)2BLN結(jié)構(gòu)受到氧化酶的攻擊，導(dǎo)致了染料顯色基團(tuán)斷裂，產(chǎn)生中間體氧化聚合轉(zhuǎn)化、環(huán)裂變反應(yīng)。