尹辛大 張華

白細(xì)胞介素-25(interleukin-25，IL-25)是IL-17家族的成員，在氣道中主要由支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，其他來(lái)源包括嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞[1]。IL-25通過(guò)產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13促進(jìn)和增強(qiáng)Th2型過(guò)敏性炎癥，導(dǎo)致血清IgE濃度升高、氣道嗜酸性粒細(xì)胞增多和氣道高反應(yīng)，因此被認(rèn)為是過(guò)敏反應(yīng)的重要標(biāo)志物[2-3]。目前關(guān)于IL-25在哮喘中作用的研究顯示，哮喘性支氣管炎患者血清IL-25表達(dá)增加[4]，過(guò)敏原誘導(dǎo)的IL-25在過(guò)敏性哮喘患者中的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[5]。本研究旨在評(píng)估誘導(dǎo)痰(inducedsputum，IS)中IL-25mRNA和蛋白質(zhì)在不同哮喘表型和疾病嚴(yán)重程度患者中的表達(dá)，分析其與哮喘臨床特征和相關(guān)指標(biāo)間的關(guān)系。

資料與方法

一、一般資料

選取2020年3月～2021年3月我院診治的哮喘患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲，②符合《支氣管哮喘防治指南(2020年版)》對(duì)支氣管哮喘的診斷[6]；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)有癥狀的呼吸道感染；②接受全身糖皮質(zhì)激素治療后哮喘加重；③合并其他重要臟器損傷、腫瘤及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病。哮喘嚴(yán)重程度的評(píng)估，根據(jù)指南進(jìn)行，咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)定義為以咳嗽為唯一癥狀，持續(xù)至少8周，肺功能正常，無(wú)氣道阻塞，支氣管激發(fā)試驗(yàn)陽(yáng)性。所有哮喘患者均接受以下評(píng)估：病史、體格檢查、最大呼氣流量-容積曲線及肺活量測(cè)定、支氣管激發(fā)試驗(yàn)、皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)和誘導(dǎo)痰試驗(yàn)。對(duì)照組由無(wú)阻塞性肺疾病或過(guò)敏史的健康非吸煙受試者組成。本研究方案得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(ZBZXYY-018)。參與研究的所有患者均簽署了知情同意書。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 誘導(dǎo)痰試驗(yàn) 誘導(dǎo)痰前吸入400μg沙丁胺醇，隨后進(jìn)行肺功能測(cè)試。在支氣管擴(kuò)張后測(cè)定肺活量，患者在室溫下通過(guò)超聲霧化器吸入無(wú)菌高滲鹽水(NaCl)，并增加濃度(3%、4%和5%溶液)。每次吸入的持續(xù)時(shí)間為7 min。每次吸入后重復(fù)肺活量測(cè)定。在FEV1比基線(吸入沙丁胺醇后)FEV1值降低至少20%后，停止誘導(dǎo)。

2 誘導(dǎo)痰樣本處理 在收到誘導(dǎo)痰后立即進(jìn)行處理，測(cè)量痰容積，分離并稱重。將新制備的0.1%二硫蘇糖醇(DTT，江蘇普樂(lè)司生物科技)溶液加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，體積等于樣本量的1/4，搖勻15 min。隨后加雙倍體積的無(wú)菌PBS并短暫攪拌。通過(guò)70μm細(xì)胞過(guò)濾器(上海晶安生物科技有限公司)過(guò)濾后，將樣本在1800 g下離心10 min。在改進(jìn)Neubauer型細(xì)胞計(jì)數(shù)板(北京世聯(lián)博研科技)中計(jì)數(shù)細(xì)胞，評(píng)估死亡細(xì)胞和上皮細(xì)胞(鱗狀上皮細(xì)胞和纖毛上皮細(xì)胞)的百分比。計(jì)算總細(xì)胞計(jì)數(shù)(106細(xì)胞/g痰)。將細(xì)胞顆粒懸浮在RNAlater溶液(賽默飛世爾科技)中，并儲(chǔ)存在-80 ℃下進(jìn)行進(jìn)一步研究。涂片用MayGrünwald-Giemsa染色。合適的IS質(zhì)量為：一張玻片上，上皮細(xì)胞<50%，非上皮細(xì)胞>300個(gè)。

3 RNA的提取與cDNA的合成 使用RNA柱式提取試劑盒(賽默飛世爾科技)從IS細(xì)胞中分離總RNA。在分光光度計(jì)上測(cè)量分離RNA的濃度和純度。使用SuperScriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)14 μL總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物用于實(shí)時(shí)定量PCR。

4 實(shí)時(shí)定量PCR 使用ABIPrism7500序列檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)福斯特市應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR評(píng)估：在16 μL的PCR體積中擴(kuò)增0.8 μL的cDNA，其中包含帶有150 nm特異性引物的SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液(賽默飛世爾科技)。為使基因表達(dá)水平正常化，對(duì)每個(gè)樣本應(yīng)用18srRNA作為內(nèi)部對(duì)照。應(yīng)用的引物序列如下：IL-25：正向5′-TGGTCCCTTTGGGAACC-3′，反向5′-TGTGCAGAGTGCAGGCTTT-3′(153bp)，18srRNA：正向5′-GGATGAGGGGAACGTGTGT-3′，反向5′-AGGTTCTCTCCAGGAGCTTG-3′(148bp)。每個(gè)樣品測(cè)量?jī)纱?，結(jié)果以相對(duì)定量單位(差異倍數(shù))表示。相對(duì)定量值使用2-ΔΔCT法，內(nèi)源性對(duì)照采用18SrRNA。在計(jì)算中，觀察組和對(duì)照組痰細(xì)胞cDNA的周期閾值(CTs)用健康志愿者痰細(xì)胞的平均CTs進(jìn)行校準(zhǔn)。

5 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用ELISAminiVidas生物梅里埃全自動(dòng)熒光免疫分析儀(法國(guó)Marcy-léoile)評(píng)估總IgE濃度，使用ELISA試劑盒(武漢伊艾博)測(cè)量IS上清液中的IL-25濃度。試驗(yàn)的平均最低檢測(cè)水平為10 pg/mL。觀察兩組IS上清液中IL-25蛋白質(zhì)的濃度。

三、統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)分析，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(QR)]表示，使用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較；計(jì)數(shù)資料采用n(%)描述，使用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行比較。相關(guān)性采用Spearman秩檢驗(yàn)分析。建立受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線，并計(jì)算IS中IL-25mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的臨界值、曲線下面積(area under curve，AUC)、敏感性和特異性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般特征

觀察組共納入哮喘患者76例，其中男13例，女63例，輕中度哮喘22例，重度哮喘28例，CVA 26例，40例(53%)患者接受了吸入性糖皮質(zhì)激素(Inhaled corticosteroids，ICS)和長(zhǎng)效β2-激動(dòng)劑的聯(lián)合治療，36例(47%)患者僅根據(jù)需要接受短效β2-激動(dòng)劑治療。對(duì)照組FEV1%，上皮細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 兩組的人口學(xué)、臨床資料和誘導(dǎo)痰細(xì)胞組成

二、不同組別IL-25mRNA的表達(dá)及蛋白濃度

對(duì)照組和觀察組mRNA表達(dá)分別為[1.09(0.1，8.04)]差異倍數(shù)和[0.46(0.06，3.06)]差異倍數(shù)；對(duì)照組和哮喘組IL-25蛋白濃度分別為[314.9(237.6，418.5)] pg/mL和[399.2(320.6，585.9)] pg/mL，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過(guò)對(duì)哮喘各亞組的分析顯示，不同亞組IL-25mRNA表達(dá)和蛋白濃度的整體比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩兩比較，中重癥哮喘患者IL-25mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組[1.09(0.10，8.04)]差異倍數(shù)和CVA[0.85(0.22，18.70)]差異倍數(shù)。重癥哮喘患者IL-25蛋白濃度[571.20(451.00，633.80)] pg/mL顯著高于對(duì)照組[314.85(237.6，481.5)] pg/mL，CVA[(386.5(327.3，446.1)] pg/mL和輕中度哮喘組[340.6(267.1，407.5)] pg/mL(見(jiàn)圖1)。

圖1 不同組別IL-25mRNA表達(dá)(A)和蛋白濃度(B)比較

三、IL-25mRNA表達(dá)和蛋白濃度對(duì)哮喘診斷的ROC分析

IL-25mRNA表達(dá)和蛋白濃度對(duì)哮喘診斷的敏感性和特異性均較低。IL-25的臨界值為：mRNA表達(dá)0.76差異倍數(shù)(靈敏度66%，特異性50%，AUC=0.598)，蛋白質(zhì)濃度288 pg/mL(靈敏度81%，特異性50%，AUC=0.618)。根據(jù)臨界值的分析表明，IL-25 mRNA高表達(dá)患者，嗜酸性粒細(xì)胞百分比顯著降低，病程縮短，F(xiàn)EV1/FVC比率較高，IL-25蛋白高濃度患者中性粒細(xì)胞百分比增加(見(jiàn)表2)。

表2 痰IL-25mRNA和IL-25蛋白水平對(duì)哮喘鑒別價(jià)值分析[M(QR)]

四、嗜酸性粒細(xì)胞百分比分級(jí)的IL-25mRNA表達(dá)及蛋白濃度比較

在不同嗜酸性粒細(xì)胞百分比亞組的哮喘患者中，IS嗜酸性粒細(xì)胞百分比≥3%的患者IL-25mRNA表達(dá)明顯高于<3%者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 嗜酸性粒細(xì)胞百分比分級(jí)的IL-25mRNA表達(dá)及蛋白濃度[M(QR)]

五、過(guò)敏性哮喘患者IL-25 mRNA表達(dá)及蛋白濃度比較

臨床特征的分析顯示，所有哮喘患者中IL-25mRNA表達(dá)和IL-25蛋白濃度與疾病持續(xù)時(shí)間(mRNA：r=-0.31，P=0.09；蛋白濃度：r=0.18，P=0.31)，F(xiàn)EV1%預(yù)計(jì)值(mRNA：r=0.31、P=0.1；蛋白濃度：r=-0.22、P=0.22)，血清IgE水平(mRNA：r=-0.13、P=0.46；蛋白濃度：r=-0.08、P=0.63)和每日ICS劑量(mRNA：-0.312，P=0.08；蛋白濃度：r=0.305，P=0.07)無(wú)顯著相關(guān)。亞組比較顯示過(guò)敏性哮喘患者IL-25蛋白濃度顯著高于非過(guò)敏性哮喘患者(P=0.03)，IL-25mRNA表達(dá)與IS嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血清IgE濃度呈負(fù)相關(guān)，IL-25蛋白濃度與IS中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(見(jiàn)表4，5)。

表4 誘導(dǎo)痰細(xì)胞和IL-25表達(dá)及蛋白濃度比較[M(QR)]

討 論

本研究表明，重度哮喘患者是唯一一個(gè)與對(duì)照組相比IS IL-25蛋白濃度升高，IL-25mRNA表達(dá)降低的亞組，哮喘患者IS中IL-25與嗜酸性粒細(xì)胞減少和中性粒細(xì)胞百分比升高有關(guān)，ROC分析顯示IS IL-25在診斷哮喘方面效率低下，進(jìn)一步表明IL-25可能僅與某些哮喘表型或嚴(yán)重階段相關(guān)。與An等證實(shí)IL-25與嚴(yán)重哮喘的發(fā)病機(jī)制有關(guān)的研究結(jié)果一致[7]。本研究還證實(shí)了IL-25蛋白濃度與過(guò)敏性哮喘的關(guān)系，Zheng等研究表明過(guò)敏原誘導(dǎo)的IL-25在過(guò)敏性哮喘患者中的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[8]。根據(jù)以往IS細(xì)胞中mRNA表達(dá)的研究結(jié)果，IL-5、IL-17A、IL-25高的患者，痰嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增多，肺功能參數(shù)較差，哮喘病情控制較差[9-10]。在上述研究的背景下，本研究結(jié)果可以被視為新的數(shù)據(jù)，證實(shí)了IL-25與嚴(yán)重哮喘之間的關(guān)系。

IL-25的主要來(lái)源是表達(dá)IL-25的上皮細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在過(guò)敏、病毒或寄生蟲(chóng)刺激后，也能夠產(chǎn)生和分泌IL-25[11-12]。本研究顯示，IL-25 PCR和ELISA結(jié)果之間存在顯著差異，單個(gè)亞組患者的IL-25 mRNA表達(dá)和蛋白濃度均為反向，嚴(yán)重哮喘和過(guò)敏性哮喘患者IL-25 mRNA水平較低，蛋白濃度較高，這種現(xiàn)象的機(jī)制目前還尚未闡明，可能與在IS上清液中測(cè)量蛋白質(zhì)水平，而在從IS分離的細(xì)胞中評(píng)估m(xù)RNA表達(dá)有關(guān)。此外，本研究認(rèn)為嚴(yán)重哮喘患者IL-25 mRNA表達(dá)幾乎被完全抑制可能與這些患者接受ICS治療有關(guān)。納入的所有重度哮喘患者均接受了ICS治療，而糖皮質(zhì)激素治療可減少嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量，降低哮喘氣道中炎癥介質(zhì)的水平。此外，有研究顯示，嚴(yán)重哮喘患者糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)降低和p65基因啟動(dòng)子募集減弱，可導(dǎo)致氣道平滑肌細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素不敏感[13]，因此，PCR和ELISA結(jié)果之間的差異也可能與存在其他糖皮質(zhì)激素不敏感的IL-25來(lái)源有關(guān)，例如某些結(jié)構(gòu)性氣道細(xì)胞。

本研究中，過(guò)敏性哮喘患者的IL-25水平升高，但與以血清IgE水平或IS嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加的Th2型炎癥反應(yīng)無(wú)關(guān)。此外，較高的IL-25蛋白濃度與較高的中性粒細(xì)胞百分比相關(guān)，說(shuō)明IL-25可能具有多效性，與其他研究結(jié)果相似。一項(xiàng)研究表明，IL-25誘導(dǎo)了IL-17A依賴性哮喘小鼠氣道中性粒細(xì)胞模型，在不同的哮喘小鼠模型中，IL-25激活NF-κB并產(chǎn)生CXCL8，CXCL8是一種強(qiáng)中性粒細(xì)胞趨化因子[14]。王若珺等證明IL-17RA和IL-17RB人中性粒細(xì)胞表面的表達(dá)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)IS IL-25水平和增加的中性粒細(xì)胞百分比之間的關(guān)系與IL-25的趨化活性相關(guān)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞重新進(jìn)入氣道。接下來(lái)的研究還需要對(duì)IS中IL-25來(lái)源進(jìn)行更詳細(xì)的分析，以正確解釋本研究的發(fā)現(xiàn)。綜上所述，哮喘患者和健康受試者的IS中IL-25無(wú)顯著差異，但I(xiàn)L-25與嚴(yán)重哮喘相關(guān)。IL-25與粒細(xì)胞氣道炎癥之間的關(guān)系表明，IL-25在該疾病的免疫反應(yīng)中具有多效性作用。