張偉，李志鋼，王晶心，馮雪

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院1.耳鼻喉科，2.門診部，3.護(hù)理部，4.檢驗(yàn)科，新疆烏魯木齊 830000）

慢性鼻-鼻竇炎（chronic rhinosinusitis, CRS）可導(dǎo)致過敏性鼻炎的發(fā)病頻率增加。CRS 是一個(gè)廣義的總稱，涵蓋多種疾病實(shí)體，包括急性鼻竇炎、伴有鼻息肉的CRS 和無鼻息肉的CRS。最近全球過敏和哮喘歐洲網(wǎng)絡(luò)項(xiàng)目的多中心研究中，歐洲12個(gè)國家的19 個(gè)中心的問卷結(jié)果顯示，CRS 的總體患病率為10.9%（6.9%～27.1%）[1]，并且CRS 與哮喘有關(guān)，特別是遲發(fā)性哮喘[2]。CRS 作為一種常見的呼吸道疾病，我國患病率為8%左右[3]。有研究表明，雖然功能性內(nèi)窺鏡鼻竇手術(shù)在減少與CRS 相關(guān)的癥狀方面安全、有效，但是術(shù)后5年以上復(fù)發(fā)率高達(dá)19.1%[4-5]。有相當(dāng)一部分難治性CRS 患者盡管進(jìn)行了適當(dāng)?shù)闹委煟ㄍ扑]的藥物治療和手術(shù)），但仍出現(xiàn)令人煩惱的上呼吸道疾病，目前相關(guān)機(jī)制尚不清楚，是當(dāng)前治療上面臨的新挑戰(zhàn)[6]。鼻腔沖洗治療是CRS 的一種外治法，有效性尚在探索中[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物72 只1 級日本大耳雄性白兔由新疆醫(yī)科大學(xué)SPF動物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重2.0～2.5 kg，級別：清潔級。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2018-0002。動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003。飼養(yǎng)條件：室溫保持在（40±2）℃，相對濕度（60±5）%，自由飲水，單籠單只飼養(yǎng)，保持室內(nèi)安靜。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始正式的實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物與試劑金芪灌洗液組成：金銀花9 g、黃芪15 g、黃芩9 g、白芷6 g。上述中藥購自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥房，由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院煎藥室制備成中劑量溶液。慶大霉素（批號：Y06011，宜昌人福藥業(yè)有限公司），SYBR Green PCR 試劑盒（貨號：AQ601-01，北京全式金生物技術(shù)有限公司），miRNA 提取試劑盒（貨號：DP501，北京天根生化科技有限公司），miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號：KR211-01，北京天根生化科技有限公司），miRNA 熒光定量檢測試劑盒（貨號：FP411-01，北京天根生化科技有限公司）。

1.1.3 儀器T100 梯度PCR 儀（美國伯樂公司），WD-9413B 型凝膠成像分析系統(tǒng)、DYPC-31DC 型瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司），Q2000B 型熒光定量PCR 儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司），K5800 型超微量分光光度計(jì)（北京凱奧科技發(fā)展有限公司），5235 型組織包埋機(jī)（日本ASKURA株式會社），DM4000 型光學(xué)顯微鏡、RM2016 型病理切片機(jī)（德國Leica 公司）。

1.2 菌株制備與模型復(fù)制

1.2.1 金黃色葡萄球菌菌株制備從CRS 患者的鼻腔分泌物中單獨(dú)分離篩選出金黃色葡萄球菌菌株，接種于血平板上，置于37.5℃、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從血平板上收集菌落，連續(xù)稀釋，制成1.0×1011cfu/L 混懸液備用。

1.2.2 模型復(fù)制模型復(fù)制前1 天剔除白兔鼻梁區(qū)域毛發(fā)。模型復(fù)制前用200 g/L 烏拉坦5 mL/kg 局部注射麻醉，30 min 后白兔行自主呼吸。常規(guī)消毒、鋪巾，沿白兔鼻梁正中線做一縱長切口，剝離皮下組織及骨膜，用骨鉆于上頜骨鼻竇投影部位鉆一4 mm×4 mm 孔。為預(yù)防鼻竇干燥，鉆孔后用生理鹽水沖洗竇內(nèi)黏膜。在耳內(nèi)鏡下，通過上頜竇竇腔上壁，暴露上頜竇竇腔內(nèi)黏膜和竇口裂隙，用棉絨阻塞上頜竇竇口，并在竇腔內(nèi)留置棉絨，固定棉絨后縫皮。整個(gè)手術(shù)過程遵守?zé)o菌原則。次日，嚴(yán)格消毒，從上頜竇造口處用注射器向竇腔內(nèi)注入1.0×1011cfu/L 金黃色葡萄球菌4 mL，保留2 周后取出棉絨。右側(cè)竇腔置入硅膠管并吊皮固定，便于竇腔內(nèi)進(jìn)行藥物灌洗[8]。

1.3 分組與干預(yù)

模型復(fù)制成功率在70%左右，取存活的24 只白兔分為模型組、慶大霉素組、金芪灌洗液組、空白組，每組6 只。除空白組外，其余3 組均為右側(cè)鼻腔模型復(fù)制?？瞻捉M：從右側(cè)鼻竇置管內(nèi)注入0.9%氯化鈉溶液沖洗治療，2 次/d，5 mL/次；模型組：不進(jìn)行沖洗治療；慶大霉素組：從右側(cè)鼻竇置管內(nèi)注入0.4%慶大霉素灌洗液（慶大霉素+ 0.9%氯化鈉溶液），2 次/d，5 mL/次；金芪灌洗液組：從右鼻竇置管內(nèi)注入中劑量金芪灌洗液，2 次/d，5 mL/次。各組均沖洗治療2 周。灌洗前后均用稀釋絡(luò)合碘及生理鹽水對鼻竇置管進(jìn)行消毒，對動物房用84 消毒液進(jìn)行消毒。灌洗持續(xù)2 周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測miRNA-155-3p 的表達(dá)取兔鼻黏膜組織約10 mg置于研缽中，加入500 μL TRIzol 試劑及100 μL氯仿提取總RNA，應(yīng)用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，以末端加尾法檢測各組兔鼻黏膜組織中miRNA-155-3p的表達(dá)水平。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，循環(huán)1 次；94℃變性5 s，60℃退火30 s，共45 次循環(huán)。各組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。以2-ΔΔCt法表示各目的基因的相對表達(dá)量。擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.2 鼻腔黏膜蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色將兔鼻黏膜組織用10%甲醛浸泡7 d 后進(jìn)行石蠟包埋、切片（厚4～8 μm）并放置于載玻片上展片，經(jīng)過二甲苯脫蠟、乙醇脫水，用HE 染色，乙醇脫水，最后用中性樹膠封片，正置于顯微鏡下選取合適視野拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用Bonferroni post hoc test 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miRNA-155-3p相對表達(dá)量比較

空白組、模型組、慶大霉素組、金芪灌洗液組miRNA-155-3p相對表達(dá)量分別為（1.099±0.089）、（1.929±0.419）、（2.654±0.777）、（0.233±0.047），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.330，P=0.000），模型組、慶大霉素組較空白組升高（P＜0.05），金芪灌洗液組較空白組降低（P＜0.05），金芪灌洗液組較模型組降低（P＜0.05），慶大霉素組較模型組升高（P＜0.05），金芪灌洗液組較慶大霉素組降低（P＜0.05）。

2.2 各組大白兔鼻腔黏膜形態(tài)變化

HE 染色結(jié)果顯示，空白組鼻黏膜結(jié)構(gòu)正常，纖毛柱狀上皮完整，黏膜下有疏松結(jié)締組織，血管橫斷面、腺體結(jié)構(gòu)完整。模型組鼻黏膜纖毛層溶解呈空泡狀，黏膜層增厚，腺體增多，結(jié)構(gòu)模糊，部分腺體擴(kuò)張，腺體間炎癥細(xì)胞增多，中性粒細(xì)胞在纖毛柱狀上皮、黏膜、腺體內(nèi)都有分布，有明顯的炎癥細(xì)胞帶。慶大霉素組纖毛層缺損，中性粒細(xì)胞大量存在，黏膜下也有少量中性粒細(xì)胞，黏膜下層增寬，部分腺體擴(kuò)張、融合、界限不清。金芪灌洗液組纖毛層基本完整、排列整齊，局部有溶解空泡、少量中性粒細(xì)胞存在，黏膜下結(jié)締組織正常，腺體正常結(jié)構(gòu)清晰，少量腺體模糊溶解。見圖1。

圖1 各組白兔鼻腔黏膜病理切片 （HE染色×100）

3 討論

CRS 是鼻竇黏膜的炎癥性疾病，是一種持續(xù)性和異質(zhì)性炎癥性疾病[4,9]。中醫(yī)文獻(xiàn)中無慢性鼻竇炎病名，根據(jù)其癥狀表現(xiàn)，可歸屬中醫(yī)“鼻淵”“腦漏”范疇。中醫(yī)對慢性鼻竇炎病機(jī)認(rèn)識為多因臟腑功能失調(diào)導(dǎo)致清陽不升，外邪乘虛而入遏阻鼻竅所致。

MicroRNA 是一類小的非編碼RNA，通過影響mRNA 穩(wěn)定性和翻譯來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。miRNAs可通過介導(dǎo)RNA 裂解、抑制mRNA 翻譯或引起mRNA 不穩(wěn)定來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

miRNA-155-3p位于人類21 號染色體上，其表達(dá)水平受B 細(xì)胞整合簇基因轉(zhuǎn)錄水平和miRNA 加工等調(diào)控。脂多糖刺激單核細(xì)胞導(dǎo)致miRNA-155-3p表達(dá)增加，而miRNA-155-3p抑制劑可通過細(xì)胞信號傳導(dǎo)的抑制因子1/NF-kB 信號通路下調(diào)脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。miRNA-155-3p干擾免疫系統(tǒng)的B 細(xì)胞、T 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能，并在多種疾病中具有不同的表達(dá)模式[10]。

miRNA 通過參與免疫系統(tǒng)和組織細(xì)胞中的協(xié)調(diào)，控制基因表達(dá)來確保炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。miRNA參與細(xì)胞間通信，因此是炎癥調(diào)節(jié)的重要參與者[11-13]。miRNA-155-3p作為一種多功能的RNA，主要參與免疫系統(tǒng)的構(gòu)建。目前證實(shí)免疫系統(tǒng)紊亂及其炎癥反應(yīng)是CRS 病發(fā)生的主要病因。故miRNA-155-3p的含量對研究CRS 的發(fā)生、發(fā)展具有重要臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，模型組miRNA-155-3p的含量高于空白組，慶大霉素組的miRNA-155-3p表達(dá)高于模型組，說明慶大霉素對miRNA-155-3p的調(diào)控?zé)o效；金芪灌洗液組的miRNA-155-3p含量低于模型組，說明金芪灌洗液對調(diào)控miRNA-155-3p的表達(dá)是有效的，這與筆者前期的臨床研究結(jié)果相一致[14]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)慶大霉素組對CRS 鼻黏膜炎癥的干預(yù)不佳，與2020年歐洲鼻竇炎和鼻息肉意見書（EPOS2020）反駁抗生素在CRS 中的抗炎療效的觀點(diǎn)一致[15]。本研究證明miRNA-155-3p在CRS 動物的鼻黏膜中均過表達(dá)，表明CRS 可能對microRNA 調(diào)節(jié)特別敏感[11,16]，但潛在機(jī)制尚不清楚。光鏡下HE 染色結(jié)果顯示，金芪灌洗液組纖毛層基本完整、排列整齊，黏膜下結(jié)締組織正常，腺體正常結(jié)構(gòu)清晰，少量腺體模糊溶解。說明金芪灌洗液對鼻竇黏膜組織的修復(fù)是有效的。

中藥金芪灌洗液源于《外科正宗》中的托里消毒散化裁而成，具有清熱解毒、消腫止痛、化瘀通絡(luò)和通竅的功效，主要用于CRS 和鼻息肉等患者的術(shù)后沖洗。金芪灌洗液中金銀花主含綠原酸類化合物，其綠原酸、咖啡酸等有升高白細(xì)胞作用，可促進(jìn)外周白細(xì)胞對異物的吞噬功能，提高機(jī)體抗病能力。

金銀花有廣諧抗菌作用，對各種致病菌，如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、百日咳桿菌、肺炎雙球菌等革蘭陽性菌，及疾桿菌，大腸桿菌、霍亂弧菌、傷寒桿菌、翻傷寒桿菌、綠膿桿菌、腦膜炎雙球菌等革蘭陰性菌均有抑制作用。金銀花中總皂甙既能明顯抑制角又萊膠引起的大鼠足腫脹和巴豆油引起的小鼠耳殼腫脹程度，又能降低醋酸、組胺、五羥色胺、前列腺素等引起的毛細(xì)血管通透性。金銀花能促進(jìn)白細(xì)胞的吞噬功能，對細(xì)胞免疫具有一定的抑制作用。有研究表明金銀花發(fā)揮抗炎作用的主要成分是槲皮素、毛地黃黃酮等[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)金銀花的提取物可通過抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3 等蛋白水平減少過敏性鼻炎小鼠的鼻摩擦和打噴嚏癥狀，減輕鼻黏膜損傷[18]。

黃芪多糖可以通過增強(qiáng)細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的再循環(huán)，發(fā)揮免疫增強(qiáng)的作用。此外，黃芪能提高機(jī)體誘生干擾素的能力，從而抑制病毒的繁殖，因此具有廣譜的抗病毒作用，對流感病毒、柯薩奇病毒均有明顯的對抗作用[19-20]。黃芩具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)作用。黃芩所含黃芩甙具有廣譜抗菌作用，對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、腦膜炎雙球菌以及痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、霍亂弧菌、白喉?xiàng)U菌、百日咳桿菌均有抑制作用；其中對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抑制作用最強(qiáng)。

白芷水煎劑在體外對大腸桿菌、痢疾（宋氏）桿菌、傷寒和副傷寒桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌及霍亂弧菌均有一定的抑制作用。本研究的結(jié)果顯示金芪灌洗液具有調(diào)控miRNA-155-3p表達(dá)的作用，從而抗炎并修復(fù)損傷的鼻黏膜及其功能。

綜上所述，本研究結(jié)果初步證實(shí)金芪灌洗液對miRNA-155-3p起抑制作用，對鼻黏膜的損傷具有修復(fù)作用，提示金芪灌洗液可能通過干預(yù)miRNA 達(dá)到抗炎、修復(fù)鼻黏膜損傷的目的，但金芪灌洗液的具體作用機(jī)制及調(diào)控靶點(diǎn)還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。CRS 作為臨床的常見病，其治療仍在探索之中，生物制劑和中藥有著廣闊的前景。