曾 光，胡曉暉，楊 超，杜 然

腎癌是一種起自腎小管上皮細胞的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)腫瘤相關死亡的主要原因之一[1]。誘發(fā)腎癌的因素眾多，如吸煙、肥胖、高血壓等，腎癌的發(fā)病率近年來逐年上升[2]。絕大多數(shù)腎癌患者對化療和放療都不敏感，手術是腎癌的主要治療方式[3]。積極探索新的分子靶向治療藥物是改善腎癌患者預后的重要手段。隨著非編碼RNA研究的進展，微小RNA(miRNA)被證實對各種腫瘤細胞的惡性生物學行為都能產(chǎn)生抑制作用[4]。其中，miR-4701-5p是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，由miR-4701剪切生成[5]。研究表明，miR-4701-5p在肺腺癌組織和細胞株中低表達，恢復miR-4701-5p表達能夠抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，改善肺腺癌細胞的順鉑耐藥性，發(fā)揮明顯的腫瘤抑制作用[6]。miR-4701-5p在腎癌中的表達及對腎癌惡性表型的影響報道較少。本研究旨在探討腎癌組織和細胞株中miR-4701-5p的表達水平，觀察恢復miR-4701-5p表達對腎癌細胞增殖和遷移的影響，并初步研究其機制，為臨床針對腎癌的靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞株及試劑 人腎癌細胞株OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20及正常腎小管上皮細胞株HK-2購自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心。LipofectamineTM2000試劑和TRIzol試劑盒均購自美國Invitrogen公司。miR-4701-5p mimic、mimic NC購自北京索萊寶公司。胎牛血清和高糖培養(yǎng)基均購自美國Thermo Scientific HyClone公司。趨化因子受體4(CXCR4) mRNA野生型載體(psi-CHECK-2-CXCR4-WT)質粒、CXCR4 mRNA突變型載體(psi-CHECK-2-CXCR4-MUT)質粒購自美國Promega公司。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。一抗YAP、CTGF、ANKRD1、β-Tubulin、CXCR4購自美國BD公司。

1.2細胞培養(yǎng)和分組處理 OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20細胞復蘇后在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HK-2細胞復蘇后在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃ 5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。傳代4～5次，取對數(shù)生長期SK-RC-20細胞培養(yǎng)于6孔板，將SK-RC-20細胞分為miR-4701-5p mimic組和mimic NC組，分別加入miR-4701-5p mimic、mimic NC，操作按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書執(zhí)行，常規(guī)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)檢測。

1.3miR-4701-5p表達分析和靶基因預測 通過TCGA數(shù)據(jù)庫在線分析miR-4701-5p在腎癌組織和癌旁組織中的表達水平差異。應用生物信息學軟件miRGator對miR-4701-5p與CXCR4 mRNA的靶向關系進行預測。

1.4qPCR檢測細胞中miR-4701-5p和CXCR4 mRNA的表達 所有細胞均采用Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)超微量核酸檢測儀檢測RNA濃度和純度，通過逆轉錄試劑盒合成cDNA。建立qPCR循環(huán)體系，qPCR引物序列：GAPDH上游：CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，下游：GCGCCCAATACGACCAAATC；rRNA18S上游：ATTCCGATAACGAACGAGAC，下游：TCACAGACCTGTTATTGCTC；miR-4701-5p上游：ATGAGTTGGCCACCACACCTA，下游：TTGGCCACCACACCTACCCCTT；CXCR4上游：ACTACACCGAGGAAATGGGCT，下游：CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA。miR-4701-5p和CXCR4 mRNA表達水平采用2-ΔΔCt方法計算。

1.5雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-4701-5p與CXCR4的靶向關系 將SK-RC-20細胞分為CXCR4-WT組和CXCR4-MUT組，分別將miR-4701-5p mimic、mimic NC與構建的CXCR4-WT和CXCR4-MUT熒光質粒共轉染，每組4個復孔。孵育48 h后采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測各組SK-RC-20細胞螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。

1.6集落形成實驗法檢測SK-RC-20細胞的增殖能力 采用胰酶消化各轉染組SK-RC-20細胞，以2 ml細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2×103個細胞，培養(yǎng)10 d后棄上清，采用2%多聚甲醛進行固定，采用結晶紫染液進行染色。流水充分清洗后，室溫下風干，計數(shù)統(tǒng)計每孔的集落形成數(shù)。

1.7Transwell實驗檢測SK-RC-20細胞的遷移能力 采用胰酶消化各轉染組SK-RC-20細胞，以500 μl細胞懸液接種于Transwell小室上室，加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于下室。培養(yǎng)箱孵育24 h，采用2%多聚甲醛進行固定，采用Giemsa染液進行染色，采用棉簽擦掉未穿過底膜的細胞。在40倍光學顯微鏡下選擇6個視野拍照并統(tǒng)計遷移細胞數(shù)。

1.8Western blotting檢測SK-RC-20細胞中CXCR4蛋白和YAP信號通路蛋白的表達 采用胰酶消化各轉染組SK-RC-20細胞，采用PBS清洗5次，用RIPA裂解液裂解并提取細胞總蛋白，分別取60 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳以及硝酸纖維素膜轉膜。于10%脫脂牛奶中封閉150 min，分別孵育一抗YAP、CTGF、ANKRD1、β-Tubulin、CXCR4(濃度均為1∶1000)，加入1∶4000的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗，均勻孵育，化學發(fā)光顯色液，在暗室中曝光、顯影，β-Tubulin為內參蛋白。

2 結果

2.1miR-4701-5p在腎癌組織和腎癌細胞株中的表達 TCGA數(shù)據(jù)庫顯示，腎癌組織中miR-4701-5p的表達水平低于癌旁組織(P<0.01)，見圖1。qPCR檢測結果顯示，miR-4701-5p在腎癌OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20細胞株中的表達水平低于HK-2細胞，SK-RC-20細胞株中miR-4701-5p表達低于OS-RC-2、A498、ACHN細胞(P<0.05，P<0.01)，見圖2。故選擇SK-RC-20細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 miR-4701-5p在腎癌組織及癌旁組織中的表達情況

圖2 miR-4701-5p在腎癌細胞株中的表達情況

2.2miR-4701-5p過表達效率 轉染后，mimic NC組和miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞中miR-4701-5p表達水平分別為1.03±0.47和11.02±1.72。miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞中miR-4701-5p表達率高于mimic NC組(P<0.01)。

2.3miR-4701-5p過表達可抑制SK-RC-20細胞的增殖 集落形成實驗結果顯示，miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞集落形成數(shù)少于mimic NC組(P<0.01)。見圖3。

圖3 miR-4701-5p過表達對SK-RC-20細胞增殖的影響

2.4miR-4701-5p過表達可抑制SK-RC-20細胞的遷移 Transwell實驗結果顯示，miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞遷移細胞數(shù)少于mimic NC組(P<0.05)，見圖4。

2.5miR-4701-5p靶向結合CXCR4 mRNA 通過生物信息學軟件miRGator預測顯示，CXCR4 mRNA序列上存在與miR-4701-5p互補結合的位點，見圖5。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，共轉染CXCR4 mRNA野生型載體/miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞株中相對熒光素酶活性低于mimic NC組(P<0.01);共轉染CXCR4 mRNA突變型載體/miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞株中相對熒光素酶活性與mimic NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖6。

圖5 miR-4701-5p與CXCR4 mRNA的靶向關系CXCR4為趨化因子受體4

圖6 SK-RC-20細胞株中miR-4701-5p相對熒光素酶活性

2.6miR-4701-5p靶向抑制CXCR4 mRNA表達 mimic NC組和miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞株中CXCR4 mRNA表達水平分別為6.91±1.48和1.05±0.46。miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞株中CXCR4 mRNA表達量低于mimic NC組(P<0.01)。

2.7CXCR4蛋白和YAP信號通路蛋白表達 與mimic NC組相比，miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞中CXCR4蛋白及YAP信號通路蛋白YAP、CTGF、ANKRD1表達水平均明顯降低。見圖7。

圖7 miR-4701-5p對SK-RC-20細胞中CXCR4蛋白及YAP信號通路蛋白表達的影響

3 討論

近年來研究顯示，miRNA在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要調控作用，已成為各種疾病治療研究的熱點[7-9]。miRNA在腎癌診斷、治療和預后監(jiān)測方面可能具有應用潛力[10-11]。HUANG等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在腎癌組織中表達上調，其在體外能夠促進腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲，敲除miR-140-5p可顯著抑制腎癌裸鼠模型的腫瘤生長和肺轉移。ZENG等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-92a-3p在腎癌組織和細胞株中表達顯著上調，miR-92a-3p過表達促進腎癌細胞增殖和集落形成，下調miR-92a-3p則抑制腎癌細胞增殖和集落形成。miR-4701-5p在多種疾病中起關鍵作用[6]。BI等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-4701-5p能夠顯著抑制類風濕性關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞增殖、遷移和侵襲。LI等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-4701-5p在體外可降低慢性粒細胞白血病細胞對多種化療藥物的耐藥性，并且在小鼠體內將腫瘤細胞從阿霉素耐藥轉化為易感細胞。本研究結果顯示，在腎癌組織和細胞株中miR-4701-5p表達水平分別低于癌旁組織和正常腎小管上皮細胞，提示miR-4701-5p可能發(fā)揮抑制腎癌進展的作用。

本研究體外實驗顯示，miR-4701-5p過表達能夠顯著降低SK-RC-20細胞的增殖水平和遷移能力。研究表明，miRNA通過靶向結合靶基因mRNA，下調靶基因的表達，影響腫瘤細胞的惡性表型[15]。本研究通過生物信息學軟件miRGator預測顯示，CXCR4 mRNA序列上存在與miR-4701-5p互補結合的位點。CXCR4蛋白屬于具有化學趨化作用的細胞因子超家族成員，其基因定位在染色體2q21，大小為352個氨基酸[16]。CXCR4參與介導腫瘤發(fā)生、免疫反應、血管生成等各種病理和生理進程[17]。CXCR4在胃癌、乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤中高表達，誘導腫瘤細胞的增殖和轉移，與患者的預后呈負相關[18]。CXCR4在腎癌組織和細胞株中高表達，能夠顯著增強腎癌786-O和769-P細胞的增殖和遷移[19]。本研究結果顯示，miR-4701-5p可以靶向結合并抑制CXCR4基因的表達，CXCR4是miR-4701-5p的靶基因。已有研究證實，CXCR4蛋白通過激活YAP信號通路，誘導腫瘤的進展[20]。本研究結果顯示，miR-4701-5p過表達顯著抑制YAP信號通路的激活，進一步證實miR-4701-5p通過調節(jié)CXCR4基因表達發(fā)揮作用。

綜上所述，miR-4701-5p在腎癌組織和細胞株中表達降低，miR-4701-5p過表達可以靶向抑制CXCR4基因表達，進而抑制YAP信號通路的激活，減弱腎癌SK-RC-20細胞增殖和遷移。miR-4701-5p可能成為腎癌基因治療研究的新靶點。