錢 波，馮 瑩，鄒卓群

創(chuàng)傷性腦損傷為神經(jīng)外科常見疾病之一，致傷因素主要包括暴力事件、交通事故[1]。該病具有高致殘率和高致死率，可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重者可喪失生活自理能力，影響其生存質(zhì)量[2]。創(chuàng)傷性腦損傷一旦發(fā)生便不可逆，現(xiàn)臨床尚缺乏有效治療方法[3]。氫能透過亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，清除氧自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善學(xué)習(xí)記憶能力，減輕炎癥損傷[4]。已有研究報(bào)道，氫氣在創(chuàng)傷性腦損傷中具有保護(hù)作用[5]，而關(guān)于氫氣在創(chuàng)傷性腦損傷中發(fā)揮效應(yīng)的機(jī)制研究尚少。B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(Bax)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)通路是一種與凋亡關(guān)系密切的重要通路，能夠參與創(chuàng)傷性腦損傷的病情進(jìn)展[6]。研究顯示，氫水注射降低了損傷后脊髓中Caspase3活性[7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，氫水能夠下調(diào)蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷大鼠腦組織中Bax、Caspase3表達(dá)水平，減輕其神經(jīng)細(xì)胞凋亡[8]。基于此，本研究探討氫氣是否通過Bax/Caspase3凋亡通路減輕大鼠創(chuàng)傷性腦損傷。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠56只，36～40月齡，280～320 g，SPF級(jí)，購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0012。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC-2021-047)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和處理遵循3R原則。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型制作及分組處理：將56只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、氫氣+通路激活組、氫氣組，每組14只。模型制作方法：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后以俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，沿大鼠顱骨正中線作一縱切口，暴露右側(cè)頂骨，于矢狀縫旁開2 mm位置應(yīng)用顱骨鉆制作一個(gè)孔(直徑約為5 mm)，使用小錘(致傷力度為20 g)自大鼠上方50 cm高度自由落下，制備創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型，止血并縫合，在此過程中保持其硬腦膜完整[9]。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后可見大鼠不同程度肢體抽搐，呼吸不規(guī)則，四肢平衡協(xié)調(diào)能力變差，瞳孔異?？s小或者擴(kuò)大、對(duì)光反射明顯減弱，睫毛反射及刺痛反應(yīng)消失，部分大鼠可見口腔或鼻腔出血甚至?xí)簳r(shí)性昏迷，但各行為異?？稍?0 min內(nèi)恢復(fù)。對(duì)照組大鼠除不進(jìn)行撞擊操作外，其余操作相同。造模結(jié)束后，氫氣組每天吸入1 h氫氣(42% H2-21% O2-37% N2)，共干預(yù)7 d；氫氣+通路激活組在氫氣組基礎(chǔ)上應(yīng)用Bax/Caspase3激活劑干預(yù)，將5 μg激活劑加入5 μl人工腦脊液中，通過滲壓性微量注射泵(蘇州訊飛科學(xué)儀器有限公司)腦內(nèi)注射，在10 min內(nèi)完成注射，共注射1次[10]。對(duì)照組和模型組大鼠以相同方式予等劑量生理鹽水。

1.2.2標(biāo)本制作:7 d后于尾尖采血3 ml，3000 r/min離心15 min，獲取血清標(biāo)本，于冰箱中保存待測(cè)。大鼠采血后斷頭取腦，將腦組織在5%多聚甲醛中固定48 h，取挫傷腦組織(挫傷灶為中心，半徑為2 cm，厚度為2 mm)分為2份，脫水，以液氮封存于冰箱中待測(cè)，一份用于腦含水率測(cè)定，另一份用于其他指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3HE染色觀察腦組織病理形態(tài):從冰箱中取出相應(yīng)腦組織標(biāo)本，制成5 μm厚切片，用HE染色試劑盒染色，脫水，透明，封片，在XSP-2CA光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓背角病理變化。

1.2.4ELISA檢測(cè)炎性和氧化應(yīng)激指標(biāo)水平：取相應(yīng)試劑盒在酶標(biāo)儀上應(yīng)用ELISA檢測(cè)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平。

1.2.5神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(NSS)和腦含水率：NSS包括運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)、反射實(shí)驗(yàn)、協(xié)調(diào)性實(shí)驗(yàn)、警覺性實(shí)驗(yàn)，最高分為18分，評(píng)分越高提示顱腦損傷越重[11]。干濕比重法檢測(cè)大鼠腦含水率，從冰箱中取出相應(yīng)腦組織標(biāo)本，去除凝血，洗去血跡，濾紙吸干表面水分，應(yīng)用電子天平(東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司)測(cè)量其濕重，于烘烤箱烘烤96 h后測(cè)量其干重，含水率=(濕重-干重)/濕重×100%[12]。

1.2.6Western blot法檢測(cè)Bax/Caspase3通路蛋白表達(dá)：從冰箱中取出相應(yīng)腦組織標(biāo)本，加入蛋白裂解液(預(yù)冷)，勻漿機(jī)制成勻漿液，然后以3000 r/min，4 ℃條件下離心20 min，取上清液(總蛋白)，將其轉(zhuǎn)移至Ep管中，BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳，用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，浸泡在5%脫脂奶粉內(nèi)封閉2 h(25 ℃)，加入相應(yīng)一抗，即兔抗Bax單克隆抗體(1∶500)、兔抗Caspase3單克隆抗體(1∶300)、兔抗β-actin單克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST漂洗3次后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2000)，室溫孵育2 h，經(jīng)TBST漂洗3次后用免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECLReagent)顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行拍攝，并使用Tanon軟件對(duì)各組蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1氫氣對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠NSS和腦含水率的影響 實(shí)驗(yàn)過程中模型組死亡3只，氫氣+通路激活組和氫氣組各死亡1只，對(duì)照組無大鼠死亡。模型組NSS和腦含水率高于對(duì)照組(P<0.05)；氫氣+通路激活組和氫氣組NSS和腦含水率低于模型組，且氫氣組低于氫氣+通路激活組(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠NSS和腦含水率比較

2.2氫氣對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織病理的影響 對(duì)照組腦組織結(jié)構(gòu)正常且清晰，細(xì)胞排列整齊，呈規(guī)則形狀，未見出血、腫脹及炎性浸潤(rùn)等。模型組腦組織水腫嚴(yán)重，細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞核明顯固縮，變性壞死、出血壞死及炎性浸潤(rùn)十分明顯。氫氣組腦組織病理變化較模型組明顯減輕，病灶區(qū)和水腫區(qū)縮小，變性壞死、出血壞死及炎性浸潤(rùn)減少。氫氣+通路激活組對(duì)腦組織病理的改善作用較氫氣組有所減弱。見圖1。

圖1 4組大鼠腦組織病理變化(HE×400，箭頭為病灶區(qū))1a.對(duì)照組；1b.模型組；1c.氫氣+通路激活組；1d.氫氣組；模型組為創(chuàng)傷性腦損傷大鼠

2.3氫氣對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠炎性指標(biāo)的影響 模型組TNF-α和IL-1β水平高于對(duì)照組(P<0.05)；氫氣+通路激活組和氫氣組TNF-α和IL-1β水平低于模型組，且氫氣組低于氫氣+通路激活組(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平變化

2.4氫氣對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響 模型組SOD水平低于對(duì)照組,MDA水平高于對(duì)照組(P<0.05)。氫氣+通路激活組和氫氣組SOD水平高于模型組,MDA水平低于模型組(P<0.05)；氫氣組SOD水平高于氫氣+通路激活組，MDA水平低于氫氣+通路激活組(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠血清SOD和MDA水平比較

2.5氫氣對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠Bax/Caspase3凋亡通路的影響 模型組腦組織Bax和Caspase3蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)。氫氣+通路激活組和氫氣組腦組織Bax和Caspase3蛋白表達(dá)量低于模型組，且氫氣組低于氫氣+通路激活組(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 4組大鼠腦組織Bax/Caspase3凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

圖2 4組大鼠腦組織Bax和Caspase3蛋白表達(dá)情況

3 討論

由于目前創(chuàng)傷性腦損傷治療技術(shù)和方法受限，其治療效果不太理想，致殘率和病死率居高不下。氫氣近年來逐漸應(yīng)用于多種臨床研究中[13]。氫氣具有極強(qiáng)的擴(kuò)散性，極易穿過細(xì)胞膜。研究顯示，高壓氫氣對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌有一定治療效果[14]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，吸入2%氫氣能夠有效清除自由基，減輕大腦缺血再灌注損傷[15]。有研究報(bào)道，氫氣具有抗氧化作用，氫水能顯著降低血腦屏障的通透性，明顯減輕腦水腫，顯著縮小腦損傷病灶面積，提高因外傷性腦損傷引發(fā)的神經(jīng)功能障礙，且這些正向效應(yīng)與腦組織中8異前列腺素F2a(8-iso-PGF2a)、MDA水平下調(diào)和SOD、過氧化氫酶(CAT)水平上調(diào)有關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，氫氣能夠減輕創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織病理損傷，即氫氣組腦組織病理變化較模型組明顯減輕，病灶區(qū)和水腫區(qū)縮小，變性壞死、出血壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且氫氣組NSS、腦含水率較模型組顯著降低，提示氫氣對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷具有一定改善作用。創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性因子大量釋放，引起鄰近組織的炎癥反應(yīng)，誘發(fā)創(chuàng)傷性腦損傷后繼發(fā)性腦損傷。此外，創(chuàng)傷性腦損傷后因紅細(xì)胞破裂，自由基釋放增多，創(chuàng)傷區(qū)出現(xiàn)水腫及細(xì)胞凋亡反應(yīng)，觸發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，引起MDA和SOD水平異常變化。本研究中，氫氣組TNF-α、IL-1β、MDA水平較模型組顯著降低，SOD水平較模型組顯著增高，提示氫氣能夠降低創(chuàng)傷性腦損傷大鼠炎癥和氧化應(yīng)激水平。

細(xì)胞凋亡主要通過細(xì)胞內(nèi)線粒體途徑和細(xì)胞外死亡受體途徑實(shí)現(xiàn)，2條途徑最終均是通過活化凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase而發(fā)揮凋亡效應(yīng)。Bax為Bcl-2家族中十分重要的促凋亡蛋白分子之一，由6個(gè)外顯子編碼，可在線粒體外膜處形成通道蛋白，促使細(xì)胞色素C(Cyt C)進(jìn)入胞漿內(nèi)，活化下游的凋亡蛋白Caspase。Caspase3為Caspase家族中的凋亡效應(yīng)因子之一，可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，亦可通過調(diào)節(jié)其他凋亡因子而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bax和Caspase3之間能夠相互影響，共同參與并調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程[17]。研究顯示，頭顱打擊傷后1 h，病灶皮層下海馬區(qū)Bax mRNA表達(dá)量、Caspase3陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯升高，24～48 h達(dá)高峰，隨后逐漸下調(diào)，恢復(fù)至正常[18]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Caspase3在創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡中具有關(guān)鍵性作用[19]。本研究結(jié)果提示，Bax、Caspase3蛋白在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后呈高表達(dá)趨勢(shì)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氫氣+Bax/Caspase3組腦組織Bax、Caspase3蛋白表達(dá)量較氫氣組明顯上調(diào)，減弱了氫氣對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠炎癥、氧化應(yīng)激、腦組織病理損傷的改善作用，提示氫氣可能通過抗Bax/Caspase3凋亡通路對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷起到改善作用。

綜上所述，氫氣對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷具有一定改善作用，能夠減輕炎癥反應(yīng),降低氧化應(yīng)激水平，減輕腦組織病理損傷，其機(jī)制可能與氫氣抗Bax/Caspase3凋亡通路有關(guān)，但是否還有其他機(jī)制有待進(jìn)一步研究。