黃千貽 江 莉 李柳銘 吳惠梅 李慕軍

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣西南寧市 530021)

近年來，考慮到體外受精技術(shù)的進步及每個周期移植胚胎數(shù)量的減少，越來越多的生殖學(xué)家建議將反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure，RIF)定義為不孕患者連續(xù)兩次體外受精周期(包括凍融胚胎移植周期)累積移植卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎個數(shù)≥4個或優(yōu)質(zhì)囊胚個數(shù)≥2個，而未獲得臨床妊娠[1-2]。胚胎植入及胎盤形成過程受一系列細胞因子、核轉(zhuǎn)錄因子和分泌蛋白的調(diào)控，這些因子或蛋白表達失衡或功能異常均可導(dǎo)致胚胎移植失敗。母胎界面的免疫調(diào)節(jié)對妊娠結(jié)局起重要作用。一直以來，學(xué)者們主要關(guān)注母胎界面Th1/Th2平衡的相關(guān)研究。近年來，越來越多研究表明，Th17和調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T lymphocyte,Treg)分別作為效應(yīng)性細胞和調(diào)節(jié)性細胞參與妊娠的建立和維持[3-4]。二者之間的免疫平衡是維持免疫環(huán)境穩(wěn)定的必需條件，一旦失衡可能導(dǎo)致妊娠失敗及某些不良妊娠疾病的發(fā)生，如不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)、早產(chǎn)、RIF等[5-7]。本研究擬通過檢測Treg、Th17及相關(guān)因子在RIF患者外周血中的表達情況，探討Th17及Treg與RIF發(fā)病的相關(guān)性，為尋找RIF的有效臨床治療靶點提供證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月1日至9月30日因“輸卵管因素(除輸卵管明顯積水外)”在我院生殖醫(yī)學(xué)研究中心行胚胎移植的26例RIF患者作為RIF組，年齡(30.88±2.64)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：既往2次及2次以上胚胎移植失敗，每次移植至少有1枚優(yōu)質(zhì)胚胎(優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)為卵裂期胚胎分級按數(shù)量和等級分類，優(yōu)質(zhì)胚胎為6個或6個以上細胞，碎裂率<10%，沒有多核)，宮腔鏡檢查無異常，內(nèi)分泌功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵巢儲備功能差，即年齡>38歲，或獲卵數(shù)≤3枚，或基礎(chǔ)卵泡刺激素≥20 IU/mL者；(2)有活動性疾病，包括自身免疫性疾病等；(3)宮腔形態(tài)異常者；(4)輸卵管明顯積水者；(5)胚胎移植前B超提示子宮內(nèi)膜厚度<7 mm者；(6)染色體異常者；(7)多囊卵巢綜合征者；(8)子宮內(nèi)膜異位癥者；(9)抗精子抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、抗心磷脂抗體、抗卵巢抗體陽性者，自然殺傷細胞數(shù)量異常者；(10)男方存在不孕因素者。納入27例非妊娠期且生育功能正常的女性作為對照組，年齡(30.43±3.58)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡<38歲，至少1次成功妊娠，月經(jīng)周期規(guī)則(21～35 d)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有不孕史或妊娠流產(chǎn)史者。所有研究對象均了解研究方案并簽署知情同意書。兩組患者的年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已通過廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審查。

1.2 主要試劑與設(shè)備 Ficoll-Paque PLUS淋巴細胞分離液(批號：17-1440-03)購自美國GE公司，多甲藻黃素-葉綠素-蛋白復(fù)合物 (peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP)-CyTM5.5小鼠抗人CD4單克隆抗體(批號：560650)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的小鼠抗人CD25單克隆抗體(批號：557138)、Alexa Fluor?647小鼠抗人叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3(forkhead/winged-helix transcription factor P3,FOXP3)單克隆抗體(批號：560045)、PE標(biāo)記的小鼠抗人白細胞介素(interleukin,IL)-17A單克隆抗體(批號：560436)、相匹配的同型對照抗體PE Mouse IgG1κ(批號：556650)、蛋白轉(zhuǎn)移抑制劑(含莫能霉素，批號：554724)均購自美國BD Pharmingen公司，離子霉素(批號：9995s)購自美國Cell Signaling Technology公司，佛波酯(批號：P8139)購自美國Sigma-Aldrich公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：PRR047A)購自大連寶生物工程有限公司、熒光定量PCR試劑盒(mix)(批號：4913914001)購自美國Roche公司， 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1；批號：CSB-E04725h)、IL-10(批號：CSB-E04593h)、 IL-6(批號：CSB-E04638h)、IL-17A(批號：CSB-E12819h)和IL-23(批號：CSB-E08461h) ELISA試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司，TAE緩沖液(批號：N10053)購自上海雙螺旋生物科技有限公司，TRIzol試劑(批號：15596-026)購自賽默飛世爾科技公司。Facscanto Ⅱ型流式細胞儀購自美國BD Pharmingen公司，MX3000型實時熒光定量PCR儀購自美國Stratagene公司，Model-450型酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血單核淋巴細胞的提?。翰杉瘍山M研究對象處于月經(jīng)周期增殖晚期時的外周血約3 mL，裝于抗凝管內(nèi)(含肝素0.1 mL)，根據(jù)試劑說明書的相關(guān)步驟，采用Ficoll-Hypaque不連續(xù)密度梯度離心法，分離出外周血單核淋巴細胞。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg比例：采用PBS重懸外周血單核淋巴細胞，在細胞懸液的樣本管和對照管中加入PerCP-CyTM5.5小鼠抗人CD4抗體2 μL，隨后在樣本管中加入PE標(biāo)記的小鼠抗人CD25抗體10 μL，同時在對照管中加入10 μL同型對照PE Mouse IgG1κ，室溫避光孵育30 min。經(jīng)PBS洗滌2次后棄上清，加入破膜液混勻，室溫避光孵育30 min。洗滌棄上清，將Alexa Fluor?647小鼠抗人FOXP3抗體及同型對照抗體PE Mouse IgG1κ各20 μL分別加入到樣本管和對照管中，室溫避光孵育30 min。經(jīng)PBS液洗滌2次后，加入2%多聚甲醛300 μL重懸，4 ℃冰箱避光保存，24 h內(nèi)上流式儀檢測，計算CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴細胞比值。

1.3.3 流式細胞術(shù)檢測人外周血CD4+IL-17A+Th17：用RPMI-1640重懸外周血單核淋巴細胞后，依次加入離子霉素、佛波酯、蛋白轉(zhuǎn)移抑制劑，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。收集細胞裝于干燥的流式管中， PBS洗滌2次。在100 μL的細胞懸液中加入PerCP-CyTM5.5小鼠抗人CD4抗體2.5 μL，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗滌后加入固定破膜劑250 μL，4 ℃避光孵育20 min。使用通透清洗緩沖液(1×)洗滌細胞2次，將PE標(biāo)記的小鼠抗人IL-17A及同型對照PE Mouse IgG1κ各12 μL分別加入到樣本管和對照管中，4 ℃避光孵育30 min。使用通透清洗緩沖液(1×)洗滌細胞2次后加入通透清洗緩沖液(1×)重懸，4 ℃冰箱避光保存，24 h內(nèi)上流式細胞儀檢測，計算CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴細胞比值。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測FOXP3及視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γt mRNA的表達：采用TRIzol試劑提取外周血單核淋巴細胞總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板行PCR擴增。FOXP3上游引物序列為TCCCAGAGTTCCTCCACAAC，下游引物為ATTGAGTGTCCGCTGCTTCT，退火溫度為60 ℃，PCR產(chǎn)物為122 bp；視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γt(retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma t,RORγt)上游引物序列為CTCTGCAAGACTCATCGCCA，下游引物序列為CCACAGGTGACTCGGTTTCA，退火溫度為60 ℃，PCR產(chǎn)物為184 bp。內(nèi)參α-actin的上游引物序列為CAGGCACCAGGGCGTGAT，下游引物序列為TAGCAACGTACATGGCTGGG，PCR產(chǎn)物為293 bp。PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，包括Mix 10 μL、上游引物0.6 μL(10 μM)、下游引物0.6 μL(10 μM)、cDNA 1 μL，雙蒸水7.8 μL。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)；60 ℃收集熒光信號。擴增結(jié)束后，按儀器默認條件收集熒光，分別測定待測樣本目的基因及內(nèi)參基因的Ct值。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.3.5 ELISA檢測血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平：采集外周血2 mL，裝入真空干燥管內(nèi)，室溫下靜置2 h，4 ℃、2 000 r/min離心15 min。按照ELISA試劑盒說明書的步驟，檢測血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。呈正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料采用[M(P25,P75)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴細胞比值及CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴細胞比值的比較 RIF組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴細胞比值低于對照組，而CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴細胞比值高于對照組(均P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 兩組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴細胞比值及CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴細胞比值的比較(x±s)

圖1 兩組外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg的檢測結(jié)果

圖2 兩組外周血CD4+IL-17A+Th17的檢測結(jié)果

2.2 兩組外周血FOXP3 mRNA及RORγt mRNA表達量的比較 RIF組FOXP3 mRNA表達量低于對照組，而RORγt mRNA表達量高于對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組外周血FOXP3 mRNA及RORγt mRNA相對表達量的比較(x±s)

2.3 兩組血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平的比較 與對照組比較，RIF組Treg相關(guān)的細胞因子TGF-β1和IL-10水平偏低，而與Th17相關(guān)的細胞因子IL-6、IL-17A和IL-23水平偏高(均P<0.05)。見表3。

表3 兩組血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平的比較

3 討 論

在胚胎移植過程中，具有移植潛能的優(yōu)質(zhì)胚胎及良好的子宮內(nèi)膜內(nèi)環(huán)境對于胚胎移植的成功有著至關(guān)重要的作用。但對于RIF患者，即使存在優(yōu)質(zhì)胚胎，仍然無法獲得成功妊娠。研究表明，免疫特別是免疫耐受的相關(guān)基因及細胞因子，在胚胎移植過程及妊娠維持中具有至關(guān)重要的作用[8-9]。最新研究顯示，約有81.7%的RIF患者存在子宮內(nèi)膜免疫失調(diào)[10]，RIF的發(fā)生可能與子宮內(nèi)膜免疫平衡遭到破壞致使免疫耐受下降有關(guān)。

近年來，越來越多證據(jù)表明，Th17和Treg參與妊娠的建立和維持[3，11]，其中Treg在胚胎植入時發(fā)揮重要作用[12]。Treg屬于抑制性CD4+T淋巴細胞亞群，在阻止同種異體移植排斥中發(fā)揮極其重要的作用[13]，其通過表達TGF-β、IL-10、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4等因子來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]。Treg能抑制由胎兒引起的免疫反應(yīng)，其數(shù)量的減少與生殖失敗相關(guān)[15-16]。此外，外周血和子宮內(nèi)膜Treg數(shù)量的增加在分泌中期的胚胎移植過程中發(fā)揮重要作用[17]。FOXP3是在Treg上特異性表達的標(biāo)志物，也是初始T淋巴細胞被誘導(dǎo)成Treg的主要基因[18]。因此，本研究將Treg定義為CD4+CD25+FOXP3+Treg，取代以往較多研究所采用的CD4+CD25+Treg，以便能更好、更真實地評估Treg的作用。Th17可分泌細胞因子IL-17，從而促進炎癥、自身免疫和移植排斥的發(fā)生[19]。RORγt是決定Th17分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，特異性表達于T淋巴細胞，其功能是調(diào)節(jié)胸腺和外周血中效應(yīng)T淋巴細胞的發(fā)育及分化，誘導(dǎo)和刺激效應(yīng)性T淋巴細胞Th17分泌促炎細胞因子[20]。因此，RORγt在某種程度上能反映Th17的功能活性及細胞數(shù)量水平。在沒有第二信號促炎細胞因子存在的免疫環(huán)境下，F(xiàn)OXP3能抑制RORγt同時朝向Treg分化[20]。

蛻膜組織的T淋巴細胞變化最能直接反映母胎界面的免疫環(huán)境，但在實際工作中卻很難采集胚胎植入后種植部位的蛻膜組織。有研究表明，蛻膜細胞的Treg可能是在胚胎移植后從外周血Treg池募集而來的[21]。人Treg能從外周血選擇性遷移到蛻膜組織上，妊娠早期蛻膜組織CD4+CD25+Treg的數(shù)量約為外周血的3倍[22]，而且蛻膜組織Treg水平的降低與外周血Treg水平降低有關(guān)[23]。有研究者認為，外周血Treg的比例可能是一個預(yù)測體外受精治療獲得良好結(jié)局的新指標(biāo)，胚胎移植成功的體外受精患者的外周血Treg比例高于失敗者，同時外周血單核淋巴細胞中FOXP3的mRNA表達量也顯著升高[24]。此外，有研究者認為，外周血和子宮內(nèi)膜FOXP3+Treg在排卵前就發(fā)生增殖，其也許是潛在性地準(zhǔn)備接受妊娠相關(guān)的抗原刺激，以便在分泌中期胚胎植入階段發(fā)揮免疫耐受作用[17，25-26]。效應(yīng)性T淋巴細胞與Treg的平衡可能從圍植入期就開始發(fā)生改變。因此，本研究通過檢測月經(jīng)周期的增殖晚期外周血的Th17/Treg平衡情況，間接反映種植窗期子宮內(nèi)膜免疫環(huán)境的變化。

有研究顯示，與正常健康妊娠婦女相比，URSA患者外周血CD4+CD25brightFOXP3+Treg減少，而Th17增加，Th17/Treg比值高于正常妊娠和未妊娠婦女[27]。此外，URSA患者外周血中Th17相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達升高[28]。有學(xué)者認為，RIF是URSA的早期表現(xiàn)，二者之間似存在相同的免疫調(diào)節(jié)機制[29]。因此，我們推測RIF同樣存在Th17/Treg失衡。本研究通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，RIF組外周血CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴細胞比值高于對照組，而CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴細胞比值低于對照組(均P<0.05)，與Ghaebi等[5]的研究結(jié)果相似，這提示RIF患者存在Th17/Treg的表達失衡。因此，對于RIF患者，在排除胚胎和內(nèi)膜因素異常后，可通過檢測外周血Th17和Treg比例以了解RIF患者機體是否存在二者的表達失衡，從而為RIF患者進行免疫治療提供依據(jù)。本研究通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，RIF組Treg相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的mRNA表達量低于對照組，而Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RORγt的mRNA表達量高于對照組(均P<0.05)，這提示RIF患者機體Th17/Treg失衡也表現(xiàn)在細胞功能活性上。

研究表明，URSA患者外周血和蛻膜組織的Th17數(shù)量及其分泌的細胞因子IL-17較正常妊娠婦女明顯升高，調(diào)控Th17增殖分化的相關(guān)分子如IL-6、IL-23、RORγt的水平也相應(yīng)增高[28，30]。本研究結(jié)果顯示，RIF組外周血中Treg分泌的細胞因子IL-10水平及與Treg分化相關(guān)的TGF-β1水平低于對照組，而與Th17分化相關(guān)的細胞因子IL-6、IL-23水平及Th17分泌的主要細胞因子IL-17A 水平則高于對照組(均P<0.05)，這提示在RIF患者體內(nèi)低濃度的TGF-β1與高濃度的IL-6協(xié)同作用促使Th17偏移，從而形成Th17/Treg失衡的免疫環(huán)境，這與URSA的相關(guān)研究結(jié)果[6]相似。這說明RIF的發(fā)生可能與Th17/Treg失衡有關(guān)，兩者的平衡向Th17偏移，Th17通過抑制機體的免疫調(diào)節(jié)功能以增強炎性免疫反應(yīng)是可能引起早期妊娠失敗的原因，因此維持Th17/Treg平衡對妊娠成功與否極其重要。

綜上所述，RIF的發(fā)生可能與Th17/Treg失衡有關(guān)，這或許可為RIF的治療提供新的依據(jù)及治療方向，以往成功治療URSA的手段也許同樣可用于RIF患者。