曹培東 張海民

(高密市中醫(yī)院介入科，山東省淮坊市 261500)

動(dòng)脈粥樣硬化是大中型動(dòng)脈血管壁的多灶性改變，其特征是局部和/或全身炎癥[1]、內(nèi)皮功能障礙[2]及活動(dòng)性脂質(zhì)堆積[3]。動(dòng)脈粥樣硬化性冠狀動(dòng)脈狹窄可能導(dǎo)致心肌梗死和心力衰竭。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)可提高心肌梗死患者的存活率，是臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化性血管狹窄的主要方法[4]。盡管PCI技術(shù)在不斷改進(jìn)，但是PCI相關(guān)損傷導(dǎo)致的血管重構(gòu)嚴(yán)重影響了血運(yùn)重建的遠(yuǎn)期療效。損傷后的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的過(guò)度增殖和炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展和PCI術(shù)后再狹窄的重要原因。Krüppel樣因子(Krüppel-like factor，KLF)5是KLF家族的成員之一，在心血管重構(gòu)的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。正常情況下KLF5在血管系統(tǒng)中的表達(dá)較低，但在損傷后的VSMC中明顯升高，是應(yīng)激反應(yīng)與心血管重構(gòu)的關(guān)鍵因素[6]。本研究探討PCI對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性冠狀動(dòng)脈狹窄患者KLF5水平的影響，并采用生物信息學(xué)方法分析與動(dòng)脈粥樣硬化、血運(yùn)重建相關(guān)的基因，運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀-高通量測(cè)序技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證上述相關(guān)基因與KLF5的關(guān)系，探討KLF5影響血運(yùn)重建的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣本細(xì)胞和試劑

1.1.1 臨床樣本來(lái)源：收集2019年5～8月于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟病研究所進(jìn)行PCI治療的14例動(dòng)脈粥樣硬化性冠狀動(dòng)脈狹窄(冠狀動(dòng)脈狹窄均≥90%)患者術(shù)前和術(shù)后的血液樣本，患者均無(wú)心肌梗死、卒中、糖尿病史，均無(wú)特殊藥物服用史，其中男性12例、女性2例，年齡43～72歲。

1.1.2 細(xì)胞和試劑：人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human coronary artery smooth muscle cell,HCASMC)由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。KLF5(過(guò)表達(dá))和KLF5-RNAi(沉默表達(dá))慢病毒購(gòu)買于上海吉?jiǎng)P基因。免疫共沉淀-測(cè)序的測(cè)序操作由生工生物工程有限公司完成。RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT 108 reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、KLF5 ChIP抗體均購(gòu)買于寶生物工程(大連)有限公司(批號(hào)：AJG2607A、AK71649A、AK81977A、2498900)。

1.2 檢測(cè)血清KLF5水平 采集患者手術(shù)前后清晨空腹靜脈血，室溫條件下待血液自然凝固15 min后，2 500 r/min離心20 min，收集上清液保存待測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)患者血清KLF5水平，試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào)：ml204971)。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 篩選目的基因：從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的GSE28829基因芯片數(shù)據(jù)集(該數(shù)據(jù)集資料包含13個(gè)早期和16個(gè)晚期頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣本)，再利用GEO2R在線分析工具分析芯片數(shù)據(jù)，選擇校正后P<0.05且|log2FC|≥1的基因。另外，在開放訪問(wèn)網(wǎng)站pubmed2ensembl(http://pubmed2ensembl.ls.manchester.ac.uk/)中輸入“revascularization”提取所有與血運(yùn)重建相關(guān)的非重復(fù)基因。將動(dòng)脈硬化相關(guān)基因和血運(yùn)重建相關(guān)基因取交集，即為目的基因。

1.3.2 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和篩選關(guān)鍵基因：使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)評(píng)估篩選得到的目的基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)信息，將得分>0.4定義為具有顯著意義[7]，并使用CytoScape 3.8.2軟件構(gòu)建PPI可視化網(wǎng)絡(luò)[8]。利用分子復(fù)合物檢測(cè)方法篩選重要模塊基因，篩選條件為等級(jí)截止(degree cutoff)=2，k-core=2，節(jié)點(diǎn)分?jǐn)?shù)截止(node score cutoff)=0.2，最大深度(max depth)=100。通過(guò)CytosHubba插件根據(jù)最大團(tuán)簇中心性原則篩選關(guān)鍵基因，選擇最短路徑中的前6個(gè)基因進(jìn)行富集分析。

1.3.3 富集分析：利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析，對(duì)涉及生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能的基因進(jìn)行注釋[9]，并進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)信號(hào)通路富集分析[10]。

1.4 KLF5蛋白的染色質(zhì)免疫共沉淀-高通量測(cè)序 使用甲醛把HCASMC細(xì)胞內(nèi)的DNA與KLF5蛋白交聯(lián)固定后裂解細(xì)胞。從細(xì)胞裂解液中分離出基因組DNA，通過(guò)超聲處理將DNA隨機(jī)打斷為一定長(zhǎng)度的小片段，添加KLF5蛋白特異性抗體(KLF5 ChIP抗體)，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與KLF5蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來(lái)，然后富集這些DNA 片段，并對(duì)其進(jìn)行純化、文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序(均由上海生工生物有限公司完成)。最后使用IGV 2.8.13軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將KLF5和KLF5-RNAi慢病毒分別轉(zhuǎn)染HCASMC 72 h后，利用RNAiso Plus提取總RNA。利用PrimeScriptTMRT 108 reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后利用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ通過(guò)嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)體系包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL、上下游引物各0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、cDNA模板2 μL、滅菌水6 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,共40個(gè)循環(huán)；融解曲線分析95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。內(nèi)參基因β-actin及4個(gè)關(guān)鍵基因血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM1)、整合素β2(integrin beta 2, ITGB2)、C-X-C基序趨化因子受體4(CXC motif chemokine receptor 4,CXCR4)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9) 的引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法分析各關(guān)鍵基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，每個(gè)樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行作圖。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)脈粥樣硬化性冠狀動(dòng)脈狹窄患者PCI前后血清KLF5水平的比較 14例患者PCI前血清KLF5水平為(8.33±1.52)μg/L，術(shù)后血清KLF5水平為(4.64±1.34)μg/L，術(shù)后血清KLF5水平低于術(shù)前(t=8.913，P<0.001)。

2.2 目的基因 共獲得217個(gè)與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的基因，以及581個(gè)與血運(yùn)重建相關(guān)的基因。取二者交集后共獲得23個(gè)重疊基因，即為目的基因，見圖1。

圖1 動(dòng)脈粥樣硬化和血運(yùn)重建相關(guān)基因的韋恩圖

2.3 關(guān)鍵基因與富集分析 通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)及CytoScape 3.8.2軟件構(gòu)建PPI可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖2。重要模塊基因由13個(gè)節(jié)點(diǎn)和45條邊組成，見圖3。根據(jù)最大團(tuán)簇中心性原則篩選出6個(gè)關(guān)鍵基因，包括MMP9、CXCR4、VCAM1、ITGB2、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C型(protein tyrosine phosphatase receptor type C，PTPRC)和整合素αM(integrin αM，ITGAM)，見圖4。對(duì)6個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析，各保留排名前兩位的分析結(jié)果，其中GO分析顯示目的基因主要參與炎癥反應(yīng)、防御反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞遷移等生物過(guò)程(見表2)，KEGG分析顯示目的基因主要通過(guò)白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路發(fā)揮作用(見表3)。

圖2 PPI可視化網(wǎng)絡(luò) 圖3 重要模塊基因 圖4 關(guān)鍵基因

表2 關(guān)鍵基因的GO功能富集分析結(jié)果

表3 關(guān)鍵基因的KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果

2.4 IGV可視化結(jié)合位點(diǎn) KLF5的染色質(zhì)免疫共沉淀-高通量測(cè)序結(jié)果顯示，ITGB2、MMP9、VCAM1和CXCR4均與KLF5存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖5。這說(shuō)明白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路中的4個(gè)關(guān)鍵基因均受到KLF5的調(diào)控。

圖5 IGV軟件對(duì)結(jié)合峰的可視化結(jié)果

2.5 KLF5可調(diào)控關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá) KLF5-RNAi組HCASMC中的ITGB2、MMP9和VCAM1的mRNA表達(dá)水平均低于KLF5組，而CXCR4的mRNA表達(dá)水平均高于KLF5組(均P<0.05) ，見表4。

表4 轉(zhuǎn)染后兩組HCASMC中關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

PCI是急性心肌梗死的重要治療手段，與傳統(tǒng)藥物治療相比，PCI能更有效地恢復(fù)心肌灌注，減小心肌缺血或梗死面積，改善患者的臨床預(yù)后。然而，在PCI治療過(guò)程中血管壁容易受到機(jī)械損傷而發(fā)生再狹窄，再狹窄常發(fā)生在動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)，這極大地限制了冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建的壽命和有效性[11-12]。PCI相關(guān)損傷誘導(dǎo)的血管重構(gòu)是一種復(fù)雜的病理生理反應(yīng)，包括VSMC的增殖和遷移、細(xì)胞外基質(zhì)的形成和新生內(nèi)膜的增生。為了預(yù)防PCI術(shù)后血管再狹窄，相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者們進(jìn)行了一些探索。環(huán)孢素因?qū)淋巴細(xì)胞具有免疫抑制作用并對(duì)VSMC增殖具有抑制作用，被證明可以預(yù)防球囊導(dǎo)管損傷大鼠的動(dòng)脈再狹窄[13]。隨后，雷帕霉素被發(fā)現(xiàn)與環(huán)孢素有相似作用，臨床上便以藥物洗脫支架作為PCI后再狹窄的預(yù)防手段[14]。然而到目前為止，除了藥物洗脫支架，解決PCI后再狹窄的方法有限，尤其是對(duì)于復(fù)發(fā)的支架再狹窄。

KLF5是多個(gè)細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控因子，可激活細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E進(jìn)而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄和抑制細(xì)胞周期負(fù)調(diào)節(jié)因子p21的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)VSMC增殖。KLF5也是調(diào)節(jié)VSMC表型的重要因子，其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)VSMC從收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋潮硇?，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄的發(fā)生[15-16]。研究表明，含有KLF5陽(yáng)性細(xì)胞的人類冠狀動(dòng)脈標(biāo)本比不含KLF5陽(yáng)性細(xì)胞的人類冠狀動(dòng)脈標(biāo)本具有更高的再狹窄風(fēng)險(xiǎn)[17]。本研究結(jié)果顯示，14例動(dòng)脈粥樣硬化患者PCI后血清KLF5水平低于術(shù)前(P<0.05)。說(shuō)明PCI后KLF5的降低可能與血運(yùn)恢復(fù)后解除了冠狀動(dòng)脈缺血缺氧的狀態(tài)有關(guān)。最新研究表明，缺氧會(huì)誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞KLF5的表達(dá)[18]，并可通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子1α介導(dǎo)缺氧性肺動(dòng)脈高壓的血管重構(gòu)[19]。這意味著PCI后的KLF5水平可能與血運(yùn)恢復(fù)的程度呈負(fù)相關(guān)。

本研究的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，與動(dòng)脈粥樣硬化、血運(yùn)重建相關(guān)的23個(gè)目的基因主要通過(guò)白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)、防御反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞遷移等免疫反應(yīng)相關(guān)生物過(guò)程。白細(xì)胞通過(guò)靜脈壁遷移是一種基本的免疫反應(yīng)，啟動(dòng)了白細(xì)胞在靜脈壁的極化運(yùn)動(dòng)，受刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞將出現(xiàn)一過(guò)性的屏障破壞[20]。因此，不受控制的白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移會(huì)加劇動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[21]。已有研究表明，降低KLF5表達(dá)可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)，減緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[22]。研究顯示，VSMC特異性KLF5基因敲除顯著降低了血管組織中炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素1β的表達(dá)[23]。本研究通過(guò)IGV軟件分析發(fā)現(xiàn)，與血運(yùn)重建相關(guān)的關(guān)鍵基因ITGB2、MMP9、VCAM1、CXCR4均受KLF5的直接調(diào)控；實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果表明，降低KLF5可以抑制HCASMC中ITGB2、MMP9、VCAM1的表達(dá)，促進(jìn)CXCR4的表達(dá)。已有研究表明，ITGB2、MMP9、VCAM1能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而加重動(dòng)脈粥樣硬化[24-26]，而CXCR4則通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)內(nèi)皮屏障功能、維持動(dòng)脈完整性和VSMC收縮表型來(lái)限制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[27-28]。因此，PCI術(shù)后，隨著KLF5的降低，受其調(diào)節(jié)的血運(yùn)重建相關(guān)性基因均發(fā)揮了抑制動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，KLF5的降低有利于抑制PCI后的血管異常重構(gòu)，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路的相關(guān)因子抑制動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)。PCI后血清KLF5水平或可反映血運(yùn)恢復(fù)程度，因此KLF5可能是判斷PCI預(yù)后的標(biāo)志因子，并有望成為預(yù)防和治療PCI后再狹窄的新靶點(diǎn)。