謝子奇， 李忠起， 那 震， 孔陳晨， 羅云敬*

(1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點實驗室，北京 100124；2.吉林國際旅行衛(wèi)生中心，吉林吉林 130062)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是全球污染范圍最廣的真菌毒素之一，廣泛存在于玉米、小麥和高粱等谷物飼料及其副產(chǎn)品中[1]。有研究表明玉米赤霉烯酮會引起肝功能損傷及消化道炎癥[2]，同時具有免疫毒性[3]、生殖毒性[4]及致癌毒性[5]等。因其對人體的損害，我國國家標準(GB 2761-2017)《食品中真菌毒素限量》規(guī)定小麥、玉米及其粉制品中玉米赤霉烯酮殘留限量應(yīng)小于60 μg/kg[6]。ZEN現(xiàn)有的檢測方法主要有液相色譜法[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8,9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]以及薄層色譜法[11]。近年來，食品中ZEN檢測樣品前處理方法包括固相萃取法[12]、液-液萃取法[13]、超臨界流體萃取法[14]等。但傳統(tǒng)的前處理方法無法對ZEN進行特異性吸附，限制了其應(yīng)用。分子印跡技術(shù)來源于生物學(xué)中的免疫學(xué)[15]，能夠制備出對目標分子具有特異性識別能力的分子印跡聚合物(MIPs)。磁性分子印跡聚合物(MMIPs)因其具有高比表面積、超順磁性等優(yōu)點而備受關(guān)注[16,17]，但ZEN毒性大，其分子印跡聚合物采用替代模板法合成，現(xiàn)已報道的替代模板包括華法林[18]、香豆素[19]等。姜黃素(Curcumin,CUR)具有抗炎[20]、抗氧化[21]等多種生物活性作用，且與ZEN結(jié)構(gòu)類似，故本研究以Fe3O4@SiO2-MPS為磁性載體，姜黃素為替代模板，合成了對ZEN具有特異性的ZEN-MMIPs，完成了復(fù)雜食品基質(zhì)中ZEN的痕量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

通過掃描電子顯微鏡(S-4800,Hitachi,Japan)和透射電子顯微鏡(Tecnai G2 F30,FEI,USA)對樣品形態(tài)進行了表征；使用傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 6700,Thermo Fisher,USA)對聚合物的表面基團進行分析；通過振動樣品磁強計(MPMS-3,Quantum Design,USA)測定了樣品的磁滯回線。

姜黃素(Curcumin,CUR)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、偶氮二異丁腈(AIBN)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)購自梯希愛化成工業(yè)發(fā)展(上海)有限公司。甲基丙烯酸、3-三甲氧基硅丙基酯(MPS)、原硅酸乙酯(TEOS)、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O購自阿拉丁科技(上海)有限公司。乙腈(色譜純)購自德國默克公司。所有其他試劑和化學(xué)品均為分析純或更高級別，水為超純水。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：SunFire RM C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積:10 μL；流動相：乙腈-1% H3PO4溶液(50∶50,V/V)。

1.3 ZEN-MMIPs的制備

1.3.1 Fe3O4納米粒子的制備準確稱取FeCl3·6H2O(4.7 g)和FeCl2·4H2O(1.72 g)，分別超聲分散于20 mL超純水的燒杯中，隨后分別轉(zhuǎn)移至含有160 mL超純水的雙口燒瓶中，在70 ℃攪拌反應(yīng)條件下加入10 mL 25%氨水，將溫度升至80 ℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30 min。隨后加入100 mg檸檬酸鈉并攪拌30 min。待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，使用磁鐵將Fe3O4與溶液分離，用超純水和乙醇反復(fù)洗滌至中性后，真空干燥保持。

1.3.2 Fe3O4@SiO2的制備準確稱取1.0 g制備的Fe3O4于雙口燒瓶中，隨后加入100 mL乙醇-水溶液(15∶4，V/V)，超聲分散30 min后，加入3 mL 25%氨水和4 mL TEOS，室溫條件下攪拌反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后將磁性粒子外加磁場分離，反復(fù)洗滌后，真空干燥保存。

1.3.3 Fe3O4@SiO2-MPS的制備準確稱取0.5g Fe3O4@SiO2至含有100 mL乙酸-水溶液(1∶9，V/V)的250 mL雙口燒瓶中，加入150 μL MPS，在60 ℃水浴條件下攪拌反應(yīng)5 h，得到Fe3O4@SiO2-MPS粒子，用超純水和甲醇交替洗滌三遍后，真空干燥備用。

1.3.4 ZEN-MMIPs的制備通過表面分子印跡技術(shù)將分子印跡聚合物與Fe3O4@SiO2-MPS偶聯(lián)。在雙口燒瓶中加入0.25 mmol的姜黃素，用30 mL的乙腈將其超聲溶解，再加入1 mmol功能單體4-VP，恒溫振蕩30 min進行預(yù)聚合反應(yīng)，然后加入25 mg Fe3O4@SiO2-MPS顆粒，4 mmol交聯(lián)劑EGDMA和20 mg引發(fā)劑AIBN，超聲15 min后在氮氣保護下攪拌反應(yīng)，于溫度60 ℃聚合24 h。聚合結(jié)束后冷卻至室溫，磁鐵分離所得沉淀，用乙酸-甲醇(1∶9，V/V)索氏提取至檢測不到模板分子為止，再用甲醇索氏提取24 h洗脫殘留的乙酸，真空干燥即得ZEN-MMIPs。ZEN-MNIPs的制備除不加替代模板分子外，其他步驟參照ZEN-MMIPs的制備。

1.4 ZEN-MMIPs的吸附性能試驗

1.4.1 吸附動力學(xué)曲線的繪制分別稱取30 mg ZEN-MMIPs和ZEN-MNIPs各6組于10 mL離心管中，加入3 mL的ZEN標準使用液(70 mg/L)，于室溫20 ℃分別恒溫振蕩吸附5、10、15、20、40、60 min，使用磁鐵分離聚合物，使用高效液相色譜(HPLC)測定上清液中ZEN的含量。根據(jù)公式(1)計算吸附量，繪制動力學(xué)曲線。

Qe=(C0-Ce)V/m

(1)

式中,C0為ZEN標準溶液吸附前濃度，Ce是經(jīng)過聚合物MIPs或者NIPs吸附后的ZEN溶液的濃度，V為加入的溶液的體積(mL)，m為加入聚合物的質(zhì)量(mg)。

1.4.2 靜態(tài)吸附等溫線的制作分別稱取30 mg ZEN-MMIPs和ZEN-MNIPs各10組于10 mL離心管中，依次加入3 mL不同濃度的ZEN乙腈溶液(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L)，在室溫20 ℃條件下于脫色搖床上振蕩20 min，使用磁鐵分離聚合物，使用HPLC法測定上清液中ZEN的含量。根據(jù)公式(1)計算聚合物的吸附容量。

1.5 ZEN-MMIPs的重復(fù)使用性

將3 mL ZEN標準溶液(70 mg/L)經(jīng)30 mg ZEN-MMIPs吸附后，使用外加磁場對聚合物進行分離，洗脫聚合物直至HPLC檢測不到ZEN，將該步驟循環(huán)10次，測定ZEN-MMIPs對ZEN標準溶液(70 mg/L)的吸附容量。

1.6 樣品前處理過程

在三支5 mL容量瓶中，分別加入2 mL玉米汁樣品，然后加入2 mL ZEN標準儲備溶液(10、20、40 mg/L)，使用乙腈定容至5 mL，混勻，超聲60 min，使玉米汁中的ZEN被完全萃取。靜置5 min待其沉降完全后，移取上清液于潔凈離心管中，作為待富集樣品溶液。將合成的磁性印跡聚合物加入待富集的樣品溶液中，常溫下振蕩20 min對樣品進行吸附。吸附完成后使用磁鐵分離聚合物，用乙酸-甲醇(1∶9，V/V)洗脫分離的聚合物。收集洗脫液，氮吹干燥后，復(fù)溶于2 mL乙腈∶0.1% H3PO4溶液=50∶50(V/V)中，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，使用HPLC法進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

2.1.1 透射電鏡圖1為Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2，ZEN-MIPs的透射電鏡(TEM)圖。由圖可見Fe3O4粒子直徑約10 nm，呈類球狀，尺寸均勻、分散性較好。Fe3O4@SiO2表面包覆有單層淺色的SiO2印跡層，證明TEOS水解生成的SiO2成功包覆在了Fe3O4的表面，而ZEN-MMIPs外部包裹了多層顏色較淺的印跡層結(jié)構(gòu)，且聚合物體積明顯增大，表明分子印跡聚合物成功聚合在磁性納米核心的表面。

圖1 Fe3O4(A)、Fe3O4@SiO2(B)和ZEN-MMIPs(C)的透射電鏡(TEM)圖Fig.1 TEM images of Fe3O4(A),Fe3O4@SiO2(B) and ZEN-MMIPs(C)

2.1.2 掃描電鏡圖2為ZEN-MMIPs(A)及ZEN-MNIPs(B)的掃描電鏡(SEM)圖?？梢钥闯鯶EN-MMIPs表面較為粗糙，具有疏松多孔的結(jié)構(gòu)且含有較多的結(jié)合位點，可以起到特異性吸附玉米赤霉烯酮的作用。ZEN-MNIPs由于在制備過程中沒有加入姜黃素作為替代模板，所以聚合物雖然呈現(xiàn)均勻分散的球形結(jié)構(gòu)，但表面光滑不存在特異性結(jié)合位點，不利于目標分子的吸附。

圖2 ZEN-MMIPs(A)和ZEN-MNIPs(B)的SEM表征Fig.2 TEM images of ZEN-MMIPs(A) and ZEN-MNIPs(B)

2.1.3 紅外光譜通過傅里葉紅外(FT-IR)光譜對制備出的磁性納米粒子進行表征。如圖3所示，574 cm-1處的峰歸因于Fe-O的伸縮振動；1 092 cm-1處為Si-O鍵的特征峰，表明SiO2成功與Fe3O4納米顆粒偶聯(lián)；1 628 cm-1處的吸收峰與C=C伸縮振動有關(guān)，表明MPS中的乙烯基被修飾在Fe3O4@SiO2納米顆粒的表面；1 722 cm-1處的特征峰由交聯(lián)劑EGDMA的C=O的伸縮振動產(chǎn)生，這表明參與分子印跡聚合的交聯(lián)劑與磁性載體發(fā)生了聚合反應(yīng)，證明MIPs成功附著在Fe3O4@SiO2-MPS的表面。

圖3 Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2(b)、Fe3O4@SiO2-MPS(c)和ZEN-MMIPs(d)的FT-IR光譜Fig.3 FT-IR spectra of Fe3O4(a),Fe3O4@SiO2(b),Fe3O4@SiO2-MPS(c) and ZEN-MMIPs(d)

2.1.4 磁性能分析對制備的Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2(b)、Fe3O4@SiO2-CH2-MPS(c)和ZEN-MMIPs(d)的磁性進行了表征。由圖4可以看出，隨著聚合物殼層結(jié)構(gòu)的增加，材料的磁強度降低，這是由于聚合物殼層在Fe3O4表面的屏蔽作用導(dǎo)致的。四條磁滯回線均與原點對稱，表明制備的材料具有超順磁性。Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-MPS和ZEN-MMIPs的飽和磁化率分別為63.92、48.77、41.62和24.79 emu/g，圖4插圖顯示ZEN-MMIPs在溶液中能均勻分散，且于磁場作用下可在10 s內(nèi)完成快速分離，證明聚合物具有良好的磁性能。

圖4 Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2(b)、Fe3O4@SiO2-MPS(c)和ZEN-MMIPs(d)的磁滯回線Fig.4 Magnetizarion curve of Fe3O4(a),Fe3O4@SiO2(b),Fe3O4@SiO2-MPS(c) and ZEN-MMIPs(d)Insert:The digital images of ZEN-MMIPs separated by a magnetic field

2.1.5 X射線衍射表征所合成材料的X射線衍射(XRD)表征如圖5所示。Fe3O4、Fe3O4@SiO2-MPS和ZEN-MMIPs(c)均表現(xiàn)出Fe3O4的特征峰(2θ=30.35°、35.45°、43.14°、53.71°、57.20°和62.76°)，分別與(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面相對應(yīng)，與Fe3O4的標準卡片一致，證明三種材料均存在Fe3O4。對Fe3O4進行修飾后，衍射峰位置均未發(fā)生偏移，說明在聚合物合成過程中晶體結(jié)構(gòu)均未發(fā)生變化。另外，隨聚合物殼層結(jié)構(gòu)的增加，F(xiàn)e3O4衍射峰強度逐漸降低，進一步證明聚合物成功附著在了Fe3O4磁芯的表面。

圖5 Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2-MPS(b)和ZEN-MMIPs(c)的X射線衍射(XRB)圖譜Fig.5 XRD patterns of Fe3O4(a),Fe3O4@SiO2-MPS(b) and ZEN-MMIPs(c)

2.2 吸附性實驗

2.2.1 吸附動力學(xué)ZEN-MMIPs和ZEN-MNIPs對玉米赤霉烯酮的吸附動力學(xué)曲線如圖6所示，隨著吸附時間的增加，ZEN-MMIPs和ZEN-MNIPs對ZEN的吸附容量增加，且ZEN-MMIPs吸附容量始終高于ZEN-MNIPs，吸附于20 min左右達到飽和。這是由于分子印跡聚合物表面結(jié)合位點幾乎全部被目標分子占據(jù)，吸附達到動態(tài)平衡。故選擇20 min為ZEN-MMIPs的最佳吸附時間。

圖6 ZEN-MMIPs(a)和ZEN-MNIPs(b)對玉米赤霉烯酮的動態(tài)吸附曲線Fig.6 Adsorption kinetics of zearalenone on ZEN-MMIPs(a) and ZEN-MNIPs(b)

2.2.2 吸附等溫線ZEN-MMIPs和ZEN-MNIPs對玉米赤霉烯酮的等溫吸附曲線如圖7所示，當ZEN初始濃度低于70 mg/L時，ZEN-MMIPs對ZEN的吸附能力隨著ZEN的濃度增加而增加，當ZEN初始濃度超過70 mg/L時，吸附容量不再上升，說明吸附達到飽和。ZEN-MMIPs的最大吸附量為0.72 mg/g，是ZEN-MNIPs(0.29 mg/g)的2.48倍，這歸因于ZEN-MMIPs表面存在較多的空間結(jié)構(gòu)和特異性結(jié)合位點。

圖7 ZEN-MMIPs(a)和ZEN-MNIPs(b)對玉米赤霉烯酮的等溫吸附曲線Fig.7 Adsorption isotherms of zearalenone on ZEN-MMIPs(a) and ZEN-MNIPs(b)

2.2.3 ZEN-MMIPs的重復(fù)使用性可重復(fù)使用性是分子印跡聚合物的重要性能，如圖8所示，與初始吸附容量相比，經(jīng)過10次吸附-洗脫循環(huán)后，ZEN-MMIPs的吸附容量為初始吸附容量的89.8%，表明ZEN-MMIPs的結(jié)合位點非常穩(wěn)定，在吸附-洗脫循環(huán)過程中沒有被破壞。

圖8 ZEN-MMIPs的重復(fù)性試驗Fig.8 Repeatability test of ZEN-MMIPs

2.3 實際樣品檢測中的應(yīng)用

2.3.1 玉米赤霉烯酮的標準曲線配制1、10、20、30、40、50、60、70 mg/L ZEN系列標準溶液，經(jīng)HPLC法測定，繪制標準曲線，其線性回歸方程為：Y=15 302X+8 842，r2=0.9991。以信噪比(SN)的3倍確定玉米赤霉烯酮的檢測限為0.45 mg/L，定量限(S/N=10)為1.5 mg/L。

2.3.2 加標回收率取玉米汁樣品，按照“1.6”方法處理，過0.22 μm濾膜進行HPLC測定，每個水平重復(fù)3次。結(jié)果如表1所示，ZEN的加標回收率為88.3%～94.7%，相對標準偏差(RSD)小于5%。

表1 玉米汁中ZEN的加標回收率

2.3.3 實際樣品的測定使用ZEN-MMIPs作為磁分散固相萃取劑，結(jié)合HPLC對玉米汁樣品進行檢測。玉米汁加標樣品如圖9 a所示，可以看出實際樣品雜峰多。經(jīng)ZEN-MMIPs純化后，ZEN峰面積無明顯變化，而雜峰面積明顯減小(圖9 b)，這表明絕大部分雜質(zhì)被成功去除，待測液中ZEN濃度上升至80.1%，實現(xiàn)了ZEN的有效純化。

圖9 玉米汁加標樣品(a)和純化后玉米汁加標樣品(b)的色譜圖Fig.9 Chromatograms of corn juice spiked sample(a) and purified corn juice spiked sample(b)

3 結(jié)論

合成了以姜黃素為替代模板的磁性分子印跡聚合物ZEN-MMIPs，經(jīng)SEM、TEM和FT-IR表征及吸附實驗證明該聚合物有特異性識別位點，吸附速率快，僅為20 min。磁性能分析證明該聚合物可在磁場下快速分離，無需繁瑣的離心或過濾。通過所制備的ZEN-MMIPs處理后，結(jié)合HPLC法，可有效消除玉米汁基質(zhì)中雜峰干擾。本文開發(fā)的ZEN-MMIPs提供了快速、高效、綠色的玉米赤霉烯酮前處理方法，在其食品安全檢測具有重大應(yīng)用潛力。