方海仙， 耿慧春， 陳興連， 普婭麗， 劉宏程*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南昆明 650205；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(昆明)，云南昆明 650205；3.元江縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站，云南元江 653300)

本課題組前期研究[1,2]中采集的26個土壤樣品中酰胺類除草劑陽性樣品比率為42%。洋蔥和大蒜可食用部分生長在地下，該類蔬菜根系可能從土壤中吸收殘留的農(nóng)藥[3]。這兩種蔬菜富含蒜氨酸類物質(zhì)，在完整的細(xì)胞中蒜氨酸以穩(wěn)定的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，能分解蒜氨酸的蒜酶存在于液泡中，有細(xì)胞膜作為屏障兩者無法接觸，但當(dāng)細(xì)胞遭到粉碎等破壞時，蒜氨酸與蒜酶接觸發(fā)生反應(yīng)生成大量含硫化合物[4 - 6]，因此，農(nóng)藥殘留測定需要的粉碎均質(zhì)樣品含有大量含硫化合物，這類化合物性質(zhì)與農(nóng)藥相近，且含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于農(nóng)藥含量，在農(nóng)藥殘留測定時造成很強的背景干擾。為了大蒜和洋蔥質(zhì)量控制，酰胺類除草劑殘留測定方法的建立尤其重要。

目前，關(guān)于洋蔥和大蒜中農(nóng)藥的多殘留檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、液相色譜法(LC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)等。其中，GC-MS/MS[7,8]具有快速、準(zhǔn)確和靈敏等優(yōu)點，適用于基質(zhì)較復(fù)雜的痕量化合物分析。QuEChERS方法由美國農(nóng)業(yè)部的Aanstassiades等人[9]提出，由于具有快速、簡單、經(jīng)濟、高效、抗干擾和安全的優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜及其他基質(zhì)農(nóng)藥殘留分析中。近年來新型碳納米材料的開發(fā)與應(yīng)用成為研究的熱點，如石墨烯，多壁碳納米管[10 - 15](Multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs)。其中MWCNTs由于具有與眾不同的機械性能、電子性能、化學(xué)性質(zhì)和較大的比表面積的優(yōu)點，引起眾多科學(xué)研究領(lǐng)域的關(guān)注并得到了廣泛的應(yīng)用。MWCNTs對有機物具備優(yōu)于其他吸附材料的吸附能力[16]，在農(nóng)藥殘留前處理過程中逐步得到應(yīng)用。

本研究選用土壤中檢出率較高的乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺和丙草胺5種酰胺類除草劑為研究對象，建立其在洋蔥和大蒜中殘留分析方法。該方法結(jié)合薄層色譜顯色，分析目標(biāo)化合物測定的干擾物，對凈化條件進行篩選，優(yōu)化前處理和檢測條件，建立QuEChERS-GC-MS/MS測定洋蔥和大蒜中5種酰胺類除草劑的分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

TRACE 1310 TSQ 8000型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(配有電子轟擊電離(EI)源和AL 1310型自動進樣器)(美國，Thermo Scientific公司)；HY-5A振蕩器(金壇市科析儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國，海道爾夫公司)；電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)；水浴氮吹儀(美國，Organomation N-EVAP公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺和丙草胺(1 000 μg/mL，農(nóng)業(yè)部天津環(huán)境保護科研監(jiān)測所)。多壁碳納米管(直徑>50 nm，長度：0.5～2 μm，純度>98%，中國科學(xué)院成都有機化學(xué)有限公司)；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)(40 μm，美國Varian公司)；十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)(40 μm，美國Varian公司)；石墨化碳黑(GCB)(40～120 μm，迪馬科技)；弗羅里矽(Florisil)固相萃取柱(1 g/6mL，美國Supelco公司)；正己烷(色譜純，美國J.T.Baker公司)；乙腈(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。NaCl、無水Na2SO4(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；乙腈-HAc(99∶1，V∶V)：移取10 mL冰HAc加入990 mL乙腈中，混勻。

硅膠G板(20 cm×20 cm，青島海洋化工)，點樣毛細(xì)管(100 mm×0.3 mm，華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，薄層色譜展開缸(100 mm×200 mm)。改良碘化鉍鉀顯色劑：(A)取堿式硝酸鉍0.85 g，加冰HAc 10 mL與水40 mL溶解；(B)取KI 8 g，加水20 mL溶解。將A、B溶液混合，搖勻，即可。

1.2 樣品前處理

稱取10 g(精確至0.01 g)勻漿后的樣品至50 mL帶蓋聚丙烯離心管中，洋蔥樣品加入10.0 mL HAc-乙腈，大蒜樣品加入10.0 mL乙腈、2 g NaCl，渦旋振蕩器渦旋10 s，振蕩提取30 min，以5 000 r/min離心10 min，得到提取液。取6.0 mL洋蔥提取液于預(yù)先加入150 mg PSA+12 mg MWCNTs+ 36 mg GCB填料的離心管中，取6.0 mL大蒜提取清液于預(yù)先加入270 mg PSA+24 mg MWCNTs+ 12 mg C18填料的離心管中，渦旋振蕩器渦旋10 s，取上清液4.0 mL，置于燒杯中，水浴加熱并通入氮氣，吹干溶劑，加入2.0 mL丙酮溶解，在渦旋振蕩器上渦旋10 s，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.3 溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液分別移取乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺和丙草胺1.0 mL，用正己烷定容至25.0 mL，配制成單一標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，貯存在-20 ℃冰箱中。準(zhǔn)確吸取一定體積各單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用正己烷定容至25.0 mL，得到5種酰胺類除草劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，貯存在-4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取勻漿后的洋蔥和大蒜樣品，按“1.2”方法進行前處理，分別制得空白洋蔥和大蒜基質(zhì)溶液。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用空白洋蔥基質(zhì)和空白大蒜基質(zhì)溶液稀釋成0.02、0.1、0.2、1.0、2.0 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“1.4”條件測定，采用外標(biāo)法定量。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：DB-17ms石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：高純氮氣(純度≥99.999%)，恒流模式，柱流速為1.0 mL/min；進樣量：1.00 μL，不分流進樣，進樣口溫度：230 ℃；柱溫升溫程序：初始溫度70 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至200 ℃，以5 ℃/min升至260 ℃，保持10 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件電離方式：EI源；離子源溫度：300 ℃；質(zhì)譜傳輸線溫度：280 ℃；電離能量：70 eV；碰撞氣：高純氬氣(純度≥99.999%)；掃描模式：選擇離子掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜鑒別

分別取40 μg/mL甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、異丙甲草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL，氮氣吹干后，加入100 μL丙酮復(fù)溶，得到1.0 mg/mL供試標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別稱取勻漿后大蒜樣品和洋蔥樣品各10 g，加入20 mL乙腈，4 g NaCl，渦旋混勻1 min，振蕩提取30 min后，5 000 r/min離心3 min，使乙腈相與水相分層，取2.0 mL上清液，氮氣吹干，加入100 μL丙酮復(fù)溶，即得。

以正己烷-丙酮(4∶1)為展開劑，展開后，取出晾干。碘化鉍鉀顯色(圖1)。由圖1a可知，5個化合物碘化鉍鉀，反應(yīng)顯紅色，得到的斑點清晰，其中異丙甲草胺比移值Rf=0.46，甲草胺、乙草胺和丙草胺的為Rf=0.53，丁草胺為Rf=0.63，基于此，與樣品對比時，選擇乙草胺作為代表。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品薄層色譜圖Fig.1 Thin layer chromatogram(TLC) of standard (a) and sample (b)1.alachlor;2.acetochlor;3.pretilachlor;4.butachlor;5.metolachlor;6.garlic;7.onion.

由圖1b可知，大蒜成分復(fù)雜，對5種化合物測定干擾較大，在5個目標(biāo)化合物附近，有較大不成型的斑點，而洋蔥相對干擾較小，因此，殘留測定時前處理過程尤其重要。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制2.0 μg/mL的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液在m/z50～550范圍內(nèi)進行全掃描，根據(jù)色譜圖及全掃描譜圖，得出各目標(biāo)農(nóng)藥的保留時間后，采用Auto SRM模式進行質(zhì)譜條件優(yōu)化，得到母離子全掃描譜圖，選擇分子離子峰或相對豐度較高的特征碎片峰作為母離子，鎖定母離子后，采用離子掃描方式進行二級質(zhì)譜分析，獲得子離子全掃描譜圖，選擇豐度較高的合理斷裂碎片離子作為子離子，在Targeted模式下優(yōu)化碰撞能量，選擇離子豐度最高、基質(zhì)干擾最小的三個離子對作為特征離子對，其中響應(yīng)最高的離子對作為定量離子，最終確定的母離子、子離子和碰撞能量詳見表1。

表1 目標(biāo)化合物多反應(yīng)監(jiān)測(SRM)質(zhì)譜參數(shù)

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

傳統(tǒng)QuEChERS[18]方法采用乙腈或者乙腈-HAc溶液(99+1)為提取溶劑；正己烷提取極性較小的農(nóng)藥，具有較高的提取效率。本實驗的5種酰胺類除草劑的極性較弱，因此，比較了乙腈、乙腈-HAc溶液(99+1)、正己烷三種溶劑的提取效率。結(jié)果表明：用正己烷和乙腈提取洋蔥中目標(biāo)農(nóng)藥時，回收率偏高，用乙腈-HAc提取時，回收率在93%～105%之間，因此，洋蔥基采用乙腈-HAc為提取溶劑。而在大蒜中，用正己烷提取目標(biāo)農(nóng)藥時，提取效率低，回收率偏低，乙腈-HAc提取時，回收率偏高，乙腈提取時，回收率在101%～105%之間，因此，大蒜采用乙腈為提取溶劑。

2.4 凈化條件的選擇

2.4.1 PSA用量洋蔥[19]中含有葡萄糖、木糖、半乳糖等多糖，以及咖啡酸、芥子酸和阿魏酸等有機酸；大蒜[20]中含有葡萄糖、半乳糖和果糖等單糖，蔗糖、果糖和棉子糖等低聚糖，半乳聚糖、雜果聚糖和果聚糖等多聚糖，這些物質(zhì)在前處理過程中的不進行凈化，后續(xù)過程會產(chǎn)生較大的干擾。為了獲得最佳的凈化效果及回收率，在添加濃度為0.1 mg/kg三個平行樣品每毫升提取液凈化過程中加入不同量的PSA(15 mg,25 mg,35 mg,45 mg,55 mg)，比較不同用量的PSA對回收率的影響。

從圖2和圖3可以看出：洋蔥中隨著PSA的增多，5種目標(biāo)農(nóng)藥有明顯的吸附作用，回收率下降，為滿足回收率的要求選擇25 mg/mL作為PSA的量；大蒜中隨著PSA用量的增加，丙草胺的回收率升高，其余4種目標(biāo)農(nóng)藥基本不吸附，當(dāng)PSA用量為45 mg/mL時，丙草胺的回收率最低為110%，因此，大蒜基質(zhì)中選擇PSA的用量為45 mg/mL。

2.4.2 MWCNTs用量MWCNTs是一種良好的吸附材料，可通過π-π作用力和分子間相互作用力[21]等方式與目標(biāo)物結(jié)合，可有效去除色素、疏水性物質(zhì)，具有較好的凈化效果。為了獲得最佳的凈化效果及回收率，在添加濃度為0.1 mg/kg的3個平行樣品每毫升提取液凈化過程中加入不同量的多壁碳納米管(2 mg,4 mg,6 mg,8 mg,10 mg)，比較不同用量的MWCNTs對凈化效果及回收率的影響(圖2，圖3)。結(jié)果表明，洋蔥中隨著MWCNTs用量增加，對目標(biāo)農(nóng)藥依舊沒有明顯吸附作用，回收率偏高，當(dāng)添加量為2 mg/mL時，已經(jīng)滿足回收率要求；大蒜中回收率偏高，當(dāng)用量為4 mg/mL時滿足回收率要求。因此，最終確定MWCNTs的用量為洋蔥選2 mg/mL，大蒜選4 mg/mL。

2.4.3 GCB用量GCB去除類胡蘿卜素、葉綠素等色素化合物，洋蔥基質(zhì)富含矢車菊色素和飛燕草色素等花青素類色素[22]，使提取液顏色較深。為了獲得最佳的凈化效果及回收率，在添加濃度為0.1 mg/kg 3個平行樣品每毫升提取液凈化過程中加入不同量的GCB(2 mg,4 mg,6 mg,8 mg,10 mg)，比較不同用量的GCB對凈化效果及回收率的影響。圖2可以看出，GCB對異丙甲草胺的影響較大，回收率偏高，綜合其他幾種農(nóng)藥的回收率，最終確定洋蔥中GCB的用量為6.0 mg/mL。

圖2 不同凈化材料對洋蔥基質(zhì)中5種農(nóng)藥的添加回收率影響Fig.2 Effect of different purification materials on recovery of 5 pesticides for extraction of onion

2.4.5 C18用量C18用于去除脂肪和脂類等非極性化合物。大蒜中含有中性脂質(zhì)、糖脂和磷脂等脂類化合物[20]，對農(nóng)藥殘留分析造成了較大的干擾，為了獲得最佳的凈化效果及回收率，在添加濃度為0.1 mg/kg三個平行樣品每毫升提取液凈化過程中加入不同量的C18(2 mg,4 mg,6 mg,8 mg,10 mg)，比較不同用量的 C18對凈化效果及回收率的影響。圖3可以看出：當(dāng)C18用量為2 mg/mL時，5種目標(biāo)農(nóng)藥的回收率已經(jīng)滿足要求，因此，最終確定大蒜中C18用量為2 mg/mL。

圖3 大蒜基質(zhì)不同凈化材料對5種農(nóng)藥的添加回收率影響Fig.3 Effect of different purification materials on recovery of 5 pesticides for extraction of garlic

綜上所述，為了使前處理方法的凈化效率達(dá)到最佳，同時保證回收率、降低成本，確定洋蔥每毫升提取液中加入25 mg PSA + 2 mg MWCNTs + 6 mg GCB，大蒜樣每毫升提取液中加入45 mg PSA + 4 mg MWCNTs + 2 mg C18。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別配制相同濃度梯度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，兩者采用同一個混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行稀釋配制，僅配制溶劑不同。溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液采用純?nèi)軇┻M行配制，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液采用前處理方法制備好的空白洋蔥和大蒜基質(zhì)溶液進行配制，基質(zhì)效應(yīng)按照文獻(xiàn)方法[17]進行計算。結(jié)果列于表2。

5種農(nóng)藥在優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件下的定量離子圖如圖4所示。

圖4 5種農(nóng)藥定量離子Fig.4 Quantification ion of five pesticides1.acetochlor;2.alachlor;3.metolachlor;4.butachlor;5.pretilachlor.

2.6 方法的線性范圍和定量限

在0.02～2.0 μg/mL線性范圍內(nèi)，以5種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積進行線性回歸分析，如表2所示。以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)計算定量限(LOQ)。5種酰胺類除草劑的線性關(guān)系良好，檢出限均為0.0075 mg/kg，定量限均為0.025 mg/kg。

從表2可以看出，5種目標(biāo)農(nóng)藥在洋蔥樣品中都表現(xiàn)出弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，且基質(zhì)效應(yīng)不明顯；在大蒜樣品中表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)，其中乙草胺和甲草胺表現(xiàn)為弱基質(zhì)增強效應(yīng)，丙草胺、丁草胺和異丙甲草胺表現(xiàn)為中等基質(zhì)增強效應(yīng)。因此，準(zhǔn)確定量時，需要配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來進行。

表2 5種酰胺類除草劑的基質(zhì)效應(yīng)、線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.7 方法的準(zhǔn)確度和精密度

分別稱取不含5種酰胺類除草劑殘留的洋蔥和大蒜樣品各19份，每份10.00 g，其中1份為對照，另外18份樣品分為3組，每組6份。第1組每份均加入5種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中5種酰胺類除草劑的含量為0.025 mg/kg；第2組添加5種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后的含量為0.1 mg/kg；第3組添加5種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后的含量為0.25 mg/kg，分別將上述樣品充分混勻，放置30 min。在最優(yōu)前處理條件和儀器條件下，進行回收率和精密度試驗，每個添加水平做6個平行樣品，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如表3所示。

表3 5種酰胺類除草劑的回收率、精密度、檢出限、定量限

(續(xù)表3)

5種酰胺類除草劑在洋蔥中的平均回收率為82.8%～102%，RSD為2.08%～7.90%，大蒜中平均回收率為72%～98.8%，RSD為0.524%～5.96%，說明該方法能達(dá)到農(nóng)藥殘留分析的要求。

3 結(jié)論

乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺和丙草胺為常用的酰胺類除草劑，本課題組前期研究土壤時發(fā)現(xiàn)此類農(nóng)藥容易檢出，大蒜和洋蔥為食根蔬菜，該類蔬菜根系可能從土壤中吸收本來就殘留的農(nóng)藥。因此，該類農(nóng)藥在大蒜和洋蔥中檢測方法的開發(fā)與應(yīng)用尤其重要。通過優(yōu)化展開劑配比、顯色條件，對5種目標(biāo)農(nóng)藥進行薄層色譜鑒別，碘化鉍鉀顯色改良后，洋蔥和大蒜提取液對5種目標(biāo)農(nóng)藥干擾較大，因此，洋蔥和大蒜前處理很重要。采用改良QuEChERS法進行前處理，優(yōu)化前處理條件、色譜條件和質(zhì)譜條件，實驗結(jié)果顯示，5種酰胺類除草劑加標(biāo)回收率結(jié)果較好，精密度和重現(xiàn)性滿足日常檢測農(nóng)藥殘留分析要求。